卵形鲳鲹干扰素调节因子IRF6基因、蛋白、制备方法及应用与流程

卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因、蛋白、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白、制备方法及应用。


背景技术：

2.卵形鲳鲹是一种重要的海水养殖鱼类。由于卵形鲳鲹适应性免疫防御系统系统存在抗体库有限、淋巴细胞增殖和成熟速度慢等局限性，固有免疫系统被认为在其抵抗病原体感染方面起着重要作用。因此，随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的提高，细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在卵形鲳鲹的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。
3.类似于哺乳动物，鱼类宿主细胞通过模式识别受体(prr)识别病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns,pamp)，然后传递信号引起下游干扰素(ifn)或者其他相关细胞因子的产生，从而导致宿主细胞保持抗感染状态。toll样受体(tlr)和rig-i样受体(rig-i like receptors,rlr)被认为是识别pamp并将信号传递至下游因子的两个主要prr。在tlr信号通路中，髓样分化因子88(myd88)被作为衔接子与tlr的toll/il-1受体(tir)域结合，然后激活nf-kb从而初始化转录ifn。在rlr信号通路中，级联信号是按照rig-i-mavs-tbk1-irf3的顺序激活；最后，irf3被tbk1磷酸化并转移到细胞核中以促进ifn转录。
4.干扰素(ifn)是一类能够抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤的细胞因子，可被分为α、β、γ、ω等几种。这其中ifnγ有促进nk细胞活性，促进抗原呈递和提高巨噬细胞溶酶体活性等功能。干扰素调节因子(irfs)是调节干扰素(ifn)、干扰素刺激基因(isg)以及其它相关基因表达的重要转录因子，能够与干扰素(ifn)或者干扰素刺激基因(isg)上游启动子区含有5'-gaaa-3'保守基序的dna序列相结合，并通过调节ifn、isg和其它密切相关基因的表达而发挥多种生物学效应。在脊椎动物中，己经鉴定出了11个irf，分别是irf1至irf11。所有的irfs成员在其n端都含有一个保守的螺旋-转角-螺旋型的irf结构域，又称为dna结合结构域。在这个结构域中含有5个保守的色氨酸残基(trp)，这5个保守的残基对识别含有5'-gaaa-3'四核苷酸的dna序列具有重要作用。研究发现，irfs成员irf6能够调控病毒，细菌以及干扰素诱导的信号通路，在抗病毒感染，先天性免疫和适应性免疫应答，细胞增殖和凋亡等方面发挥重大作用。
5.但是，迄今为止并没有关于卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白、制备方法及在制备免疫增强剂中应用的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白，制备方法及应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供一种卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因，所述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因的cdna核苷酸序列如seq id n0.1:
[0008][0009]
[0010]
所述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因的氨基酸序列如seq id n0.2:
[0011]
[0012]
本发明提供了卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6抗病基因及其编码蛋白质的重组表达方法，具体为提取卵形鲳鲹头肾组织的rna，将rna反转录为cdna，再以cdna为模板，以下述序列为引物，通过pcr获得irf6抗病基因的核苷酸序列，所述引物的序列为：
[0013]
troirf6-f：5
’‑
atttaaatgggccaccatgtcggtcacccctcgacg-3’；
[0014]
troirf6-r：5
’‑
atttaaatggctgtgtctgcagggcctggg-3’。
[0015]
将pcr获得irf6抗病基因的核苷酸序列与pmd19-t载体连接，转化至大肠杆菌dh5α，测序鉴定重组子，测序正确后将其命名为troirf6-tsimple。提取troirf6-tsimple质粒，用smii限制性内切酶酶切后回收1476bp片段；提取pet-32a质粒，经ecor v酶切后，利用t4连接酶将上述1476bp回收片段连接从而构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有irf6基因，将其命名为pet32a-troirf6；
[0016]
将上述的质粒pet32a-troirf6用常规方法转入大肠杆菌bl21表达菌株中，将其命名为e.coil bl21(de3)/pet32a-troirf6，随后进行诱导培养，纯化，即得到具有序列表seq id n0.2中氨基酸序列的重组蛋白。
[0017]
一种上述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白在制备卵形鲳鲹免疫增强剂的应用。
[0018]
本发明与现有技术相比的有益效果：
[0019]
本发明的干扰素调节因子irf6重组蛋白能够显著抑制致病菌的生长，提高鱼类的抗病能力。本发明的卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白能够在体外通过myd88接头蛋白或者tbk1激酶激活卵形鲳鲹中干扰素蛋白(troifnγ)的启动子，可作为免疫增强剂，在制备抗病毒类药物、抗细菌性药物及抗炎剂等方面具有应用价值。
附图说明
[0020]
图1为本发明实施例卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白纯化的电泳图。
[0021]
图2本发明实施例为实验鱼注射纯化的卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6重组蛋白(r irf6)后肝脏、脾脏及肾脏的细菌在各个时间点的数量变化图。
[0022]
图3为本发明实施例卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6重组蛋白在hek293t细胞中激活troifnγ启动子区的功能效果图。a：troifnγ启动子连续截短突变体的示意图，b:双荧光素酶报告基因检测troirf6对troifnγ启动子的转录活性；
[0023]
图4为本发明实施例卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6重组蛋白在hek293t细胞中通过myd88接头蛋白或者tbk1激酶从而激活卵形鲳鲹中干扰素蛋白(troifnγ)的启动子区的功能效果图。a：tromyd88促进troirf6调节troifnγ启动子活性。b：trotbk1促进troirf6调节troifnγ启动子活性。
具体实施方式
[0024]
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0025]
实施例1
[0026]
一种卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因，所述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因cdna的核苷酸序列如seq id n0.1，所述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因的氨基酸序列
如seq id n0.2
[0027]
上述卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行:
[0028]
1.重组载体的构建
[0029]
提取卵形鲳鲹头肾组织的rna，将rna反转录为cdna，再以cdna为模板，以下述序列为引物，通过pcr获得irf6抗病基因的核苷酸序列，所述引物的序列为：
[0030]
troirf6-f：5
’‑
atttaaatgggccaccatgtcggtcacccctcgacg-3’；
[0031]
troirf6-r：5
’‑
atttaaatggctgtgtctgcagggcctggg-3’。
[0032]
反应条件:94℃预变性5min，94℃30s，62℃30s，72℃1min 40s，72℃再延伸5min，共35个循环；扩增后的片段经胶回收纯化试剂盒(诺维赞生物技术公司)后与pmd19-t载体连接，转化至大肠杆菌dh5α，挑取阳性菌落进行pcr检测；检测正确后将其命名为troirf6-tsimple。
[0033]
提取重组质粒troirf6-tsimple，使用smii限制性内切酶酶切后回收1476bp片段；提取pet-32a质粒同时质粒经ecor v酶切后，利用t4连接酶将上述1476bp回收片段连接构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有irf6基因，将其命名为pet32a-troirf6；
[0034]
2.重组蛋白rtroirf6的诱导表达
[0035]
将上述的质粒pet32a-troirf6用常规方法转入表达菌株e.coil bl21(de3)感受态细胞中(购自全式金生物公司，北京)，在含有氨苄青霉素(1
‰
)的lb固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为e.coil bl21(de3)/pet32a-troirf6.
[0036]
将e.coil bl21(de3)/pet32a-troirf6菌株接种至含氨苄青霉素(1
‰
)的lb培养基中，37℃条件下，180rpm/min振荡培养至od
600
约为0.4～0.6，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.2mm/l进行诱导表达，16℃条件下继续以180rpm/min摇动培养35h，而后以8000g，4℃离心10min，收集菌液，加入6mllysis buffer(0mm咪唑溶液，ph＝8.0)，彻底混匀，再经液氮速冻10min，放于4℃自然解冻，而后进行超声破碎后，以12000rpm，4℃离心30min，回收上清。
[0037]
3.重组蛋白rtroirf6的纯化
[0038]
于4℃条件下，采用ni-nta-sepharose柱纯化获得了可溶性的重组蛋白rtroirf6，具体操作步骤如下：
[0039]
(1)新鲜配制20％乙醇对镍柱进行清洗，4ml，水平摇床震荡30min；
[0040]
(2)0mm lysis buffer，4ml，水平摇床震荡30min；
[0041]
(3)将待纯化蛋白加入柱中，4ml，水平摇床震荡1～2h后竖直静置2min，收集流出液；
[0042]
(4)0mm lysis buffer，4ml，水平摇床震荡30min后竖直静置2min，收集流出液(此步重复两次)；
[0043]
(5)40mm wash buffer，1.5ml，水平摇床震荡30min后竖直静置2min，收集流出液(此步重复四次)；
[0044]
(6)60mm elution buffer，1.5ml，水平摇床震荡30min后竖直静置2min，收集流出液(此步重复三次)；
[0045]
(7)80mm wash buffer，1.5ml，水平摇床震荡30min后竖直静置2min，收集流出液；
[0046]
(8)用500mm wash buffer清洗柱子，4ml，水平摇床震荡30min，弃滤液(此步重复一次)；
[0047]
(9)将4ml，20％乙醇加入柱中后保存于4℃；
[0048]
(10)每一步流出液样品用12％sda-page检测；
[0049]
(11)剪下合适长度的透析袋，沸水中煮沸20min，用夹子夹住一端，另一端加入符合目的蛋白大小且条带单一的流出液样品后也用夹子固定紧，置于pbs缓冲液(4℃，ph＝7.0)中按透析袋(索莱宝)使用说明书进行透析。
[0050]
(13)结束后，将透析后的重组蛋白rtroirf6于-80℃保存。
[0051]
经纯化，透析后的重组蛋白rtroirf6及对照空载体的蛋白用sds-page电泳分析检测(80v电压下电泳25-30min，随后120v电压下电泳1-2h),测定其分子量大小(参见图1)，符合预期蛋白大小。即得到卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白，氨基酸序列如seq id n0.2所示。
[0052]
长度:492个氨基酸
[0053]
类型:氨基酸
[0054]
链型:单链
[0055]
特性:分子量为55.455kda，等电点为5.07，具有一个保守的irf结构域即dna结合结构域。
[0056]
实施例2：rtroirf6蛋白注射鱼类后显著提高鱼类的抗病感染能力
[0057]
将实施例1纯化的rtroirf6蛋白在pbs中稀释至150ug/ml，即为rtroirf6稀释液。将30条卵形鲳鲹(14.2g
±
1.3g)随机分为2组，每组15条。将两组分别命名为a和b，a组的每条鱼分别注射100ul rtroirf6稀释液，将b组分别注射100ul pbs
[0058]
将哈维氏弧菌在lb培养基中，37℃条件下，180rpm/min振荡培养至od
600
约为0.4-0.6，估算10d＝5x108cfu/ml，于pbs中稀释至106cfu/ml，即为哈维氏弧菌细菌悬液。
[0059]
攻毒感染
[0060]
在将a和b组实验鱼注射100u1 rtroirf6稀释液或100u1 pbs 1天后，每条鱼注射100u1上述步骤制备的哈维氏弧菌细菌悬液进行人工感染。在感染后6h，9h及12h，取鱼的肾脏、脾脏及肝脏，组织研磨于pbs中制备各组织悬液，组织悬液涂布lb固体平板，30℃培养12h后，进行细菌的菌落计算。结果表明，a组鱼肾脏、脾脏及肝脏的细菌数在各个时间点均显著低于b组鱼组织中的细菌数，见图2。
[0061]
所述pbs组分的配方为:nacl 137mmol/l，kcl 2.7mmol/l，na2hpo
4 10mmol/l，kh2po
4 2mmol/l，ph7.2-7.4。
[0062]
这些结果表明，rtroirf6能够显著抑制致病菌的生长，并且能够显著增强鱼类抵抗细菌的侵染能力。因此，卵形鲳鲹rtroirf6可以制备成预防哈维氏弧菌病的注射制剂。
[0063]
实验例3：本发明的卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白在hek293t细胞中促进troifnγ启动子区的转录活性分析。
[0064]
(1)采用smi i对troirf6-tsimple质粒进行酶切，采用ecor v对pcn3质粒进行酶切，酶切片段经t4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子，将其命名为ptroirf6。
[0065]
(2)以卵形鲳鲹干扰素蛋白(troifnγ)上游1817bp基因非编码区为模板，根据troifnγ启动子序列预测的结合位点，构建troifnγ启动子截短突变体(如图3a)，分别采
用下列引物进行扩增后与pmd19-t载体进行连接，转化，提取质粒，将其命名为troifnγ-tsimple；
[0066]
tr-ifnγ-pf1 cggggtaccttcatcttttcattggatgt
[0067]
tr-ifnγ-pf2 cggggtacctcagttaaaatcaccaaacc
[0068]
tr-ifnγ-pf3 cggggtaccatctaatgatttccgacgca
[0069]
tr-ifnγ-pf4 cggggtacccccagtatgaccagtaaag
[0070]
tr-ifnγ-pf5 cggggtacccagtttgagccaacttcag
[0071]
tr-ifnγ-pr ccgctcgagatagtgctgcagcaggttgctg
[0072]
(3)采用kpn i和xho i对上述的质粒及pgl4.10质粒进行酶切，酶切片段经t4连接，转化，测序鉴定重组子，将其命名为pgl4.10-ifnγpromotor(如图3b)；
[0073]
(4)将所有的质粒，包括pgl4.10-luc，pcn3，prl-tk,ptroirf6以及pgl4.10-ifnγpromotor进行去内毒素质粒提取；
[0074]
(5)人肾上皮细胞hek293t培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，培养条件为37℃，5％c02的培养箱内培养，取对数期细胞用于试验；
[0075]
(6)将上述细胞分别以0.5x10
5-2x105/孔的密度接种于24孔细胞培养板，500ul/孔，5％co2培养箱内培养24h，待细胞贴壁后，更换各自的培养基；
[0076]
(7)质粒分组如下：
[0077]
pcn3 pgl4.10 prl-tk＝200ng 250ng 10ng
[0078]
pcn3 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝200ng 250ng 10ng
[0079]
ptroirf6 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝200ng 250ng 10ng
[0080]
(8)当细胞融合度到达70％-90％时，按照以上组别并根据lipofectaminetm3000 reagent说明书进行转染实验；
[0081]
(9)置5％co2培养箱内培养24h后，用lps刺激24h后用双荧光素报告基因检测试剂盒检测相对荧光活性。
[0082]
根据troifnγ启动子序列预测的结合位点，构建troifnγ启动子截短突变体。结果如图3所示。
[0083]
结果分析：troirf6提高troifnγ-1的转录活性高于其他突变体，表明troirf6主要作用于troifnγ-1启动子片段的-1817bp至 120bp。由此可见，troirf6在hek293t细胞中能够诱导troifnγ基因的表达。
[0084]
实验例4：本发明的卵形鲳鲹干扰素调节因子irf6基因重组蛋白在hek293t细胞中通过myd88接头蛋白或者tbk1激酶促进troifnγ启动子区的转录活性分析。
[0085]
用卵形鲳鲹头肾组织的的cdna为模板，以下述序列为引物，通过pcr获得卵形鲳鲹myd88(tromyd88)和tbk1(trotbk1)基因的核苷酸序列，所述引物的序列为：
[0086]
tr-myd88-f:gatatcgccaccatggcttgtgctgagacagatgttg
[0087]
tr-myd88-r:gatatccggcagtgaaagaactttggc
[0088]
tr-tbk1-f:gatatcgccaccatgcagagcaccaccaactacc
[0089]
tr-tbk1-r:gatatctcctctcaagcctccatccag
[0090]
将上述pcr产物与pmd19-t载体进行连接，转化，提取质粒，将其命名为tromyd88-tsimple，trotbk1-tsimple；
[0091]
采用ecor v对tromyd88-tsimple，trotbk1-tsimple和pcn3质粒进行酶切，酶切片段经t4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子，将其命名为ptromyd88,ptrotbk1。
[0092]
(1)将所有的质粒，包括pgl4.10-luc,pcn3,prl-tk,ptroirf6，ptromyd88,ptrotbk1以及pgl4.10-ifnγpromotor进行去内毒素质粒提取；
[0093]
(2)人肾上皮细胞hek293t培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，培养条件为37℃，5％co2的培养箱内培养，取对数期细胞用于试验；
[0094]
(3)将上述细胞分别以0.5x10
5-2x105/孔的密度接种于24孔细胞培养板，500ul/孔，5％co2培养箱内培养24h，待细胞贴壁后，更换各自的培养基；
[0095]
(4)质粒分组如下：
[0096]
pcn3 pcn3 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0097]
ptromyd88 pcn3 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0098]
pcn3 ptroirf6 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0099]
ptromyd88 ptroirf6 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0100]
ptrotbk1 pcn3 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0101]
ptrotbk1 ptroirf6 pgl4.10-ifnγpromotor prl-tk＝250ng 25ng 250ng 10ng
[0102]
(5)当细胞融合度到达70％-90％时，按照以上组别并根据lipofectaminetm3000 reagent说明书进行转染实验；
[0103]
(6)置5％co2培养箱内培养24h后，用lps刺激24h后用双荧光素报告基因检测试剂盒检测相对荧光活性。
[0104]
结果如图4所示。结果分析：由a可见：troirf6和tromyd88均可以提高troifnγ启动子的转录活性，troirf6和tromyd88同时转染至细胞时，troifnγ启动子转录活性上调的倍数更高；由b可见：troirf6和trotbk1均可以提高troifnγ启动子的转录活性，troirf6和trotbk1同时转染至细胞时，troifnγ启动子转录活性上调的倍数更高。由此可见，troirf6在hek293t细胞中能够通过myd88接头蛋白或者tbk1激酶调节troifnγ启动子的转录活性，从而激活troifnγ的启动子区的表达。这将应用于irf6相关疾病机制的研究和干扰素相关免疫通路转录机制的研究。