一种生产角鲨烯的重组菌株及其构建方法以及应用与流程

1.本发明涉及生物合成应用领域，具体涉及一种生产角鲨烯的重组菌株及其构建方法以及应用。


背景技术：

2.角鲨烯(squalene)又被称作鲨烯，是一种全反式线状三萜化合物，化学式为c30h50，cas登录号111-02-4，相对分子质量为410.70，密度为0.8584mg/ml。从化学结构上讲，角鲨烯分子含有6个双键，属于多不饱和烯烃，化学名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。角鲨烯呈无色或黄色，是一种透明的油状液体，能发出令人愉快的气味，吸氧后变黏，呈亚麻油状，易溶于乙醚、丙酮等，不溶于水，微溶于冰醋酸和乙醇，330℃常压下分解。角鲨烯因其抗氧化、抗静电和抗癌特性而广泛用于食品、化妆品、医药和其他工业。重要的是，角鲨烯可以刺激和增强针对抗原的免疫反应，并已被用作多种疫苗的添加剂以提高疫苗的功效，包括大流行性流感、疟疾和covid-19等疫苗。
3.目前角鲨烯主要通过化学合成，动植物提取，微生物发酵法等方法获得。角鲨烯的化学合成主要包括“复杂合成路线”和“金合欢基衍生物路线”。这两种方法反应复杂、产率低，还仅限于实验室研究。几十年来，鲨鱼肝是角鲨烯的主要来源。但这种生产方式不环保和不可持续，已被《濒危野生动植物种国际贸易公约》严厉禁止。同时，植物提取法由于生产周期长、生产条件复杂，难以满足工业应用的需求。微生物发酵法由于生产方法简单，周期短，生产原料价格低廉来源丰富，受环境影响小，经济效益好等诸多优点而受到青睐。因此，利用遗传改造来开发高产角鲨烯的基因工程菌株，是一个具有良好应用前景的技术方向。酿酒酵母中合成的角鲨烯在小鼠模型实验中表现出同样有效和安全的疫苗佐剂作用，因此在工程酿酒酵母中生产角鲨烯具有优势。
4.目前生产角鲨烯的酿酒酵母工程菌株主要采用单纯的细胞质工程技术构建，生产能力不足，无法满足工业应用需求。除了细胞质工程外，鉴于功能高度专业化的亚细胞器具有独特的生理和物理优势，例如特定的生化环境、丰富的前体和辅因子供应、代谢途径的区室化既可以隔绝竞争途径又可以有效增加反应前体和酶的浓度可提高级联酶催化的效率，此外细胞器有利于产物储存、降低产物毒性，因此细胞器工程被认为是在酵母中合成目标产物的另一种潜在有效方法。线粒体是真核细胞中心代谢和能量生产的主要场所，对线粒体进行工程化(线粒体工程)合成萜类化合物，具有以下优势：萜合成的前体物质乙酰辅酶a含量是细胞溶质中的约20-30倍(weinert等人，2014)、高还原氧化还原电位、丰富的atp和足够的氧化还原酶辅因子(hu等人，2008)，以及紧凑的空间可浓缩底物、酶、中间体和辅因子以加速酶促反应(avalos等人，2013)。到目前为止，利用线粒体有效合成萜烯的可行性已被广泛研究。yuan等人(yuan和ching，2016)首先证明，通过在酵母线粒体内重建法呢基焦磷酸(fpp)生物合成途径，线粒体可以用作促进倍半萜烯amorpha-4,11-diene产生的隔室。最近，yee等人(yee等人，2019)指出，线粒体工程是生产单萜的有效方法，与细胞质工程相比可以将酵母中香叶醇的产量提高6倍。吕等人通过线粒体和细胞质中mva途径的双重代谢
工程(吕等人，2016)，将酵母中的异戊二烯产量提高了2.5g/l，分别是通过线粒体工程获得的异戊二烯产量的2.1倍和通过细胞质工程获得的异戊二烯产量的1.6倍。这些案例充分说明线粒体在酵母生产萜烯发挥着巨大作用。然而，线粒体作为真核细胞的核心细胞器，线粒体工程策略通常会导致严重的代谢负担，表现为工程菌株生长不良和产物滴度不高。这严重影响了线粒体工程策略优势的发挥，亟需解决。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种生产角鲨烯的重组菌株及其构建方法以及应用，从而解决现有技术中缺乏高产角鲨烯的基因工程菌的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.根据本发明的第一方面，提供一种生产角鲨烯的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：以酿酒酵母为出发菌株，首先在线粒体内重构甲羟戊酸途径构建线粒体工程菌株，然后在所述线粒体工程菌株细胞质内强化甲羟戊酸合成，最后在此基础上进行细胞质工程策略优化，通过线粒体与细胞质双工程联合优化获得高产角鲨烯的重组菌株。
8.作为本发明的一种实施方式，本发明随机利用了一株酿酒酵母cen.pk2-1c进行了代谢工程改造，获得了角鲨烯生产能力得到显著增强的基因工程菌。但是应当理解的是，本发明并不仅限于这一株酿酒酵母菌株。
9.根据本发明提供的构建方法，首先是构建线粒体工程菌株。作为本发明的一种实施方式，本发明利用线粒体定位信号肽(例如mls)将mva途径从乙酰辅酶a到二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)的7个关键酶(erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19和idi1)定位于上述菌株线粒体内，在线粒体内实现从乙酰辅酶a到异戊烯焦磷酸(ipp)和dmapp的合成。本发明利用gal1-gal10、gal2、gal3、gal7等诱导型启动子表达上述连接线粒体定位信号肽的基因。
10.定位于酿酒酵母的线粒体内的7个关键酶分别是：erg10(genbank:nm_001183842.1)、erg13(genbank:nm_001182489.1)、thmg1(genbank:nm_001182434.1)、erg12(genbank:nm_001182715.1)、erg8(genbank:nm_001182727.1)、erg19(genbank:nm_001183220.1)和idi1(genbank:nm_001183931.1)。
11.其次为了解决线粒体工程菌株的生长缺陷，本发明进一步在此线粒体工程菌株细胞质内强化甲羟戊酸合成以改善线粒体工程菌株的生长状态。作为本发明的一种实施方式，本发明在线粒体工程菌株的细胞质内过表达了thmg1(genbank:nm_001182434.1)，此举可显著改善线粒体工程菌株生长及角鲨烯产量。其中线粒体工程将mva途径中的7个关键酶定位到线粒体中，在线粒体内合成的ipp/dmapp可以透过线粒体膜进入细胞质被用于角鲨烯合成。至此该菌株实现了利用线粒体和细胞质联合提供角鲨烯合成产体ipp/dmapp，使角鲨烯的产量大幅提升，该产量约是单纯线粒体工程的角鲨烯产量和单纯细胞质工程的角鲨烯产量的加合，因此具有线粒体工程和细胞质工程产量的叠加效果。
12.最后，在上述细胞质与线粒体双工程联合菌株的基础上，本发明还对其再进行细胞质工程策略优化，又进一步提高了角鲨烯产量。作为本发明的一种实施方式，本发明在细胞质与线粒体双工程联合菌株的细胞质内过表达角鲨烯合成途径中的限速酶，包括但不限于增强乙酰辅酶a的供应，弱化消耗目标产物途径中关键酶的表达量或酶活。该细胞质工程所有需要增强表达基因的启动子为gal1-gal10、gal2、gal7等诱导型启动子。
13.其中，根据本发明的一个优选方案，表达强化的酶包括erg10(genbank:nm_001183842.1)和/或acs1(genbank:nm_001178197.1)和/或acs2(genbank:nm_001182040.1)，表达弱化的酶为erg1(genbank:nm_001181304.1)。
14.为了对角鲨烯工程菌株的生产能力进行评估，本发明进行了发酵放大测试。作为本发明的一种实施方式，本发明对角鲨烯工程菌株的营养缺陷型基因进行了回补。本发明在发酵放大过程中利用高产角鲨烯工程菌株诱导表达系统实现了生长阶段与产物合成阶段双阶段调控的高密度发酵方法，实现了角鲨烯的高产。
15.根据本发明的第二方面，提供一种根据上述构建方法得到的生产角鲨烯的重组菌株。
16.根据本发明的一个特别优选方案，所获得的高产角鲨烯的重组菌株的核苷酸序列如seq id no:8所示。
17.根据本发明的第三方面，还提供一种上述重组菌株在生产角鲨烯中的应用，在发酵培养过程中，向所述发酵体系中添加补料培养基，所述补料培养基含有：500～800g/l葡萄糖、9g/l kh2po4、2.5g/l mgso4、3.5g/l k2so4、0.28g/l na2so4、10ml/l微量元素溶液以及12ml/l维生素溶液。
18.所述发酵培养过程分为两个阶段：第一阶段使菌体快速生长，在菌体生物量达到一定浓度后，开始第二阶段发酵；第二阶段为角鲨烯生产阶段，通过诱导剂的添加，来启动角鲨烯的大量合成，最终获得角鲨烯的高产量。根据本发明提供的方法，最终通过两阶段发酵过程，角鲨烯的产量超过了20g/l，为目前国际上的最高生产水平，且还有进一步提升的空间。
19.本发明在酿酒酵母中以线粒体工程技术在线粒体内引入了甲羟戊酸途径(mva途径)，构建了角鲨烯产量得到明显提高的线粒体工程菌株，然而发现该菌生物量明显下降，从而折损了角鲨烯单位体积的产量。进一步研究表明这是由于mva途径在线粒体内产生的代谢产物对酿酒酵母有严重的毒性作用。为了解决线粒体工程对线粒体的毒副作用，本发明证实在线粒体工程菌株的细胞质中增加甲羟戊酸的合成可以显著改善菌体的生长，提高角鲨烯的产量，因而进一步提出了一种细胞质和线粒体工程的组合优化策略，以减轻线粒体中引入mva途径所引发的代谢负担并改善细胞生长。此外，本发明证实该策略对于角鲨烯的生产还具有细胞质工程角鲨烯产量和线粒体工程角鲨烯产量的叠加效应。通过细胞质与线粒体双工程联合优化，可解除线粒体工程对角鲨烯产物的负面影响，实现了角鲨烯产量的大幅度提升。
20.综上所述，本发明通过在酵母线粒体内重构mva途径得到线粒体工程菌株，其次在此线粒体工程菌株细胞质内强化甲羟戊酸合成以改善线粒体工程菌株生长得到细胞质与线粒体双工程联合菌株，最后在细胞质与线粒体双工程联合菌株的细胞质内进行细胞质工程优化，实现了酵母线粒体工程联合细胞质工程高产角鲨烯的开发。经发酵放大测试，本发明开发的基因工程菌株，其角鲨烯产量可高达20g/l，是目前的最高产量，是本实验室前期开发的角鲨烯产量第二高的过氧化物酶体工程菌的角鲨烯产量的近两倍。本发明证实了利用线粒体工程配合细胞质工程联合优化开发高产角鲨烯基因工程菌的优势，为在酵母中实现角鲨烯和其他萜烯的高效生产提供了新的思路。
附图说明
21.图1是工程菌株构建示意图；
22.图2是实施例1中质粒pczt3-mls-gfp和pczt3-gfp图谱；
23.图3是实施例1中线粒体定位信号肽mls的专一性和稳定性验证图；
24.图4是实施例2中线粒体定位基因表达盒构建工具质粒pzt-mls图谱；
25.图5是实施例2中细胞质内基因表达盒构建工具质粒pzt20图谱；
26.图6是实施例2中crispr-cas9基因编辑工具将bmls-erg13-erg12敲入adh3位点示意图；
27.图7是实施例2中角鲨烯标准品和工程菌株发酵检测气相图。
具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
29.下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
30.本文中涉及的溶液制备方法如下：
31.ypd培养基：10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖(ypd固体培养基，需额外添加20g/l琼脂粉)。
32.上罐发酵基础培养基：在ypd内添加8g/l kh2p04，3g/l mgso4，0.72g/l znso4·
7h2o，10ml/l微量元素液和12ml/l维生素液。
33.上罐补料培养基：500g/l葡萄糖，9g/l kh2p04，2.5g/l mgso4，3.5g/l k2so4，0.28g/l na2so4，10ml/l微量元素液，12ml/l维生素液，10g/l酵母提取物和20g/l蛋白胨。
34.角鲨烯提取方法：为了提取角鲨烯，将600μl培养细胞和600μl乙酸乙酯与1.5g氧化锆珠(直径0.5mm)混合在2ml离心管中，并用冷冻研磨仪(中国上海净信)在-4℃下55hz破碎30min。振动后的混合物在13,000rpm下离心10分钟，上层有机相经无水硫酸钠脱水后用于gc检测。
35.角鲨烯检测方法：
36.角鲨烯的标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
37.角鲨烯标准品溶液配制：称取50mg角鲨烯标准品，溶于乙酸乙酯，定容于5ml容量瓶，标准品母液浓度为10mg/ml。
38.本发明采用气相色谱进行角鲨烯定性和定量分析。gc系统(agilent 7820 a，美国)配备hp-5色谱柱(30m
×
0.25mm，0.25μm膜厚)和火焰离子化检测器(fid)。烘箱温度先在90℃保持0.5分钟，然后以20℃/min的速度逐渐升至170℃，保持0.5分钟，然后以10℃/分钟的速度升至190℃，保持0.5分钟，最后以20℃/分钟的速率升至280℃并保持7分钟。角鲨烯用外标法定量。
39.酿酒酵母的原始菌株cen.pk2-1c购买于欧洲酿酒酵母功能分析菌种保藏中心(european saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis,euroscrf)，保藏号：30000a。
40.图1为本发明所采用的细胞质与线粒体双工程联合菌株调控策略的示意图。下面通过实施例对其进行详细描述。
41.实施例1：目标蛋白在线粒体中稳定定位的方法
42.为了确保目标蛋白能在酿酒酵母线粒体中的稳定定位，本发明选择了来自线粒体细胞色素氧化酶亚基iv的n端线粒体定位信号mls来引导目标基因蛋白在线粒体基质中的准确定位。本发明通过绿色荧光蛋白gfp作为报告基因来验证mls在线粒体中精确定位蛋白质的能力。在gfp的前端引入线粒体定位信号肽mls，启动子为酿酒酵母组成型强启动子ptdh3，构建质粒pczt3-mls-gfp，图谱如图2中的b所示。同时作为对照，本发明构建了未在gfp前端加信号肽的质粒pczt3-gfp，图谱如图2中的a所示。本发明通过引物bamhi-gfp-f和sali-gfp-r(引物的具体序列见表1)，扩增出gfp，在pczt3由bamhi和sali双酶切后通过无缝克隆方法连接先构建质粒pczt3-gfp。利用引物bamhi-mls-gfp-f和mls-gfp-r1(引物的具体序列见表1)扩增出mls，在质粒pczt3-gfp由bamhi单酶切后通过无缝克隆连接得到质粒pczt3-mls-gfp。本发明通过crispr-cas9基因编辑工具分别将ptdh3-mls-gfp和ptdh3-gfp整合到酵母cen.pk2-1c基因组的gpd1基因位点。以引物gpd1-uf、gpd1-tpgk1-ur，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂gpd1-up。以引物gpd1-ttps1-df、gpd1-dr，上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂gpd1-dn。以引物gpd1-tpgk1-f、gpd1-ttps1-r，分别以上述质粒pczt3-gfp和pczt3-mls-gfp为模板pcr扩增分别得到表达盒ptdh3-gfp和ptdh3-mls-gfp具体引物可见表1。将gpd1-up、gpd1-dn、ptdh3-gfp或ptdh3-mls-gfp以及grna质粒通过化学转化法转化至酵母中，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选并培养后，用荧光共聚焦显微镜鉴定荧光蛋白的定位。定位结果如图所示3，融合有mls序列的荧光蛋白只集中在线粒体局部区域，而没有融合序列的荧光蛋白充满了整个酵母细胞，该结果表明可以通过融合mls序列将目的基因稳定并专一地定位到线粒体中。此实施例说明本发明对酶在线粒体中的定位具有准确性和稳定性。
43.表1
44.实施例2：高产角鲨烯线粒体工程菌株的构建
45.为了利用线粒体在角鲨烯生物合成中的优势，本发明将mls标记到基因的n端，将mva途径从乙酰辅酶a到ipp/dmapp的7个关键酶定位到了线粒体，从而获得线粒体工程菌株。首先本发明将来源于酵母的启动子gal1-gal10、终止子tcyc1和tadh1、来源于puc19的质粒骨架环化构建成功pzt20，图谱如图5所示，核苷酸序列如seq id no:1所示。本发明将线粒体定位信号肽mls分别插入pzt20的两个启动子后得到pzt-mls，图谱如图4所示，核苷酸序列如seq id no:2所示。本发明将mva途径的7个酶构建至含有mls序列的诱导型质粒pzt-mls的多克隆位点。并且本发明将角鲨烯合成相关的erg9和erg20构建至pzt20的多克隆位点。本发明分别构建了pzt-mls-erg10-thmg1、pzt-mls-erg13-erg12、pzt-mls-erg8-erg19、pzt-mls-thmg1-idi1、pzt20-erg9-erg20五个重组质粒用以构建高产角鲨烯的线粒体工程菌株。以上基因序列来自于酿酒酵母cen.pk2-1c(酵母基因组数据库(sgd)：cen.pk2-1ca_sgd_2015_jriv01000000)。以pzt-mls-erg13-erg12为例，erg12和erg13分别用引物mls-erg12-f、mls-erg12-r和mls-erg13-f、mls-erg13-r，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增，并将片段插入到pzt-mls的相应酶切位点，得到质粒pzt-mls-erg13-erg12。本发明通过crispr-cas9基因编辑工具将mls-erg13-erg12转入adh3基因位点。以引物adh3-uf、adh3-tadh1-ur，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂adh3-up。以引物adh3-tcyc1-df、adh3-dr，上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂adh3-dn。以引物adh3-tadh1-f、adh3-tcyc1-r，上述质粒pzt-mls-erg13-erg12为模板pcr扩增得到表达盒bmls-erg13-erg12。本发明将adh3-up、adh3-dn、bmls-erg13-erg12以及grna质粒通过化学转化法转化至酵母细胞中，利用crispr-cas9基因编辑工具将bmls-erg13-erg12敲入adh3位点示意图如图6所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选。同理，其余基因的基因组整合方法均按照以上方法构建，具体引物可见表2。通过代谢工程优化后得到高产角鲨烯的线粒体工程菌株，该菌株通过耗氧发酵培养7天经气相
检测角鲨烯产量，角鲨烯标准品和工程菌株发酵检测气相图如图7所示。该工程菌株的角鲨烯产量达到401.97mg/l，是原始菌株cen.pk2-1c的63.1倍。
46.表2
thmg1以及grna质粒通过化学转化法转化至上述线粒体工程菌株中，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选，得到线粒体和细胞质联合菌株，具体引物可见表3。同时，本发明将adh4-up、adh4-dn、bgal1-thmg1以及grna质粒通过化学转化法转化至非线粒体工程菌株中，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选，得到细胞质工程菌株，通过耗氧发酵培养7天经气相检测角鲨烯的产量达到1003.87mg/l。线粒体和细胞质联合工程改造菌株通过耗氧发酵培养7天，生物量较单纯线粒体工程菌株提高了32.0％。这表明在线粒体代谢工程菌株的细胞质内过表达thmg1可显著改善线粒体工程菌株生长。同时经气相检测线粒体和细胞质联合菌株角鲨烯的产量达到1382.88mg/l，其角鲨烯产量几乎是单纯细胞质工程菌株和单纯线粒体工程菌株的角鲨烯产量之和。这表明线粒体和细胞质联合菌株实现了利用线粒体和细胞质联合提供萜类合成前体ipp/dmapp，使角鲨烯的产量产生了叠加效果。
50.表3
51.实施例4：线粒体和细胞质联合工程改造菌株的细胞质工程优化，即增强细胞质内乙酰辅酶a的供应和弱化目标产物消耗途径。
52.增强乙酰辅酶a的供应
53.乙酰辅酶a是合成萜类的直接前体，而细胞质中乙酰辅酶a的合成是限速步骤。本发明为了进一步提高角鲨烯产量，在上述线粒体和细胞质联合工程改造菌株的基础上，又强化了菌株细胞质内乙酰辅酶a合成途径以及mva途径的第一个基因erg10。本发明使用启动子为gal1-gal10、终止子为tpgk1和ttps1的质粒pzt110来构建强化上述基因的质粒pzt110-acs2-erg10和pzt110-acs1-erg10。本发明通过引物bamhi-acs2-f和xhoi-acs2-r，gal110-acs1-f和xhoi-acs1-r，mls-erg10-f和noti-erg10-r，以上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增分别得到acs2、acs1、erg10，分别插入到pzt110相应位点得到质粒pzt110-acs2-erg10(核苷酸序列如seq id no:5所示)和pzt110-acs1-erg10(核苷酸序列如seq id no:6所示)，具体引物可见表4。本发明通过crispr-cas9基因编辑工具将bacs2-erg10和bacs1-erg10分别整合到线粒体和细胞质联合菌株基因组的gpd1和ars911位点。
54.本发明以引物gpd1-uf、gpd1-tpgk1-ur，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂gpd1-up。以引物gpd1-ttps1-df、gpd1-dr，上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂gpd1-dn。以引物gpd1-tpgk1-f、gpd1-ttps1-r，以上述质粒pzt110-acs2-erg10为模板pcr扩增得到表达盒bacs2-erg10(具体引物可见表1)。本发明以引物ars911-uf、
ars911-tpgk-ur，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂ars911-up。以引物ars911-ttps1-df、ars911-dr，上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂ars911-dn。以引物ars911-tpgk1-f、ars911-ttps1-r，以上述质粒pzt110-acs1-erg10为模板pcr扩增得到表达盒bacs1-erg10，具体引物可见表4。本发明先将gpd1-up、gpd1-dn、bacs2-erg10以及grna质粒通过化学转化法转化至线粒体和细胞质联合菌株基因组的gpd1位点，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选正确的克隆。之后将ars911-up、ars911-dn、bacs1-erg10以及grna质粒通过化学转化法转化至上述菌株基因组的ars911位点，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选正确的克隆，得到增强乙酰辅酶a的供应线粒体和细胞质联合菌株，通过耗氧发酵培养7天经气相检测角鲨烯的产量达到2489.25mg/l。
55.弱化角鲨烯消耗
56.角鲨烯是酵母中合成麦角甾醇的中间产物，是细胞生长的必需成分。本发明为了减少角鲨烯过度消耗用于麦角甾醇的合成，通过用phxt1替换erg1的启动子perg1来动态调节erg1的转录。其方法如下：
57.本发明以引物bproerg1-f和erg1-uf，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂erg1-up。以引物atf2-dr和bproerg1-r上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂erg1-dn。以引物phxt1-erg1-f和phxt1-tcyc1-r，tcyc1-r和tcyc1-atf2-f，以上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增分别得到phxt1和tcyc1。以引物phxt1-erg1-f和tcyc1-atf2-f将片段phxt1和tcyc1融合成片段phxt1-tcyc1。本发明将erg1-up、erg1-dn、phxt1-tcyc1以及grna质粒通过化学转化法转化至上述线粒体和细胞质联合菌株基因组的perg1位点，实现用phxt1替换工程菌株基因组erg1的启动子perg1，核苷酸序列如seq id no:7所示，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选正确的克隆，具体引物可见表4。得到弱化角鲨烯消耗的线粒体和细胞质联合菌株，通过耗氧发酵培养7天经气相检测角鲨烯的产量进一步提高到3000.63mg/l。
58.表4
59.实施例5：工程菌株的角鲨烯生产能力评估
60.营养缺陷型氨基酸基因回补
61.为了评估细胞质-线粒体双工程菌株的生产能力，在5l罐式发酵罐中进行补料分批发酵。由于这些菌株是营养缺陷型，它们的生长并不令人满意导致角鲨烯产量受限。因此，本发明回补了缺失的his3、leu2、ura3和trp1四种氨基酸基因。其方法如下：
62.本发明通过四对引物zzt-ura3-f和zzt-ura3-r，zzt-trp1-f和zzt-trp1-r，zzt-his3-f和zzt-his3-r，zzt-leu2-f和zzt-leu2-r，以酿酒酵母s288c基因组为模板pcr扩增分别得到ura3、trp1、his3和leu2四个营养缺陷型基因的启动子与基因，分别以质粒pzt20和pzt110为骨架通过无缝克隆得到质粒pura3-ptrp1和phis-pleu2，具体引物可见表5。本发明通过crispr-cas9基因编辑工具将四个营养缺陷型基因的表达盒bpura3-ptrp1和bphis-pleu2一起整合到上述弱化角鲨烯消耗的线粒体和细胞质联合菌株基因组的his3位点。
63.本发明以引物chis3-uf和his3-tadh1-ur，用上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增上游同源臂chis3-up。以引物ttps1-his3-df和chis3-dr，上述酿酒酵母基因组为模板pcr扩增下游同源臂chis3-dn。以引物his3-tadh1-f和cyc1-tpgk1-r，cyc1-tpgk1-f和ttps1-his3-r，以上述质粒pura3-ptrp1和phis-pleu2为模板pcr扩增得到四个营养缺陷型基因的表达盒bpura3-ptrp1和bphis-pleu2，具体引物可见表5。本发明先将chis3-up、chis3-dn、bpura3-ptrp1和bphis-pleu2以及grna质粒通过化学转化法转化至上述弱化角鲨烯消耗的线粒体和细胞质联合菌株基因组的his3位点，用sd-leu-ura双缺陷培养基平板筛选正确的克隆,最终实现了高产角鲨烯线粒体和细胞质联合工程菌株his3、leu2、ura3和trp1四种氨
基酸基因的回补，核苷酸序列如seq id no:8所示。
64.表5表5
65.2)上罐发酵
66.鉴于前期角鲨烯大量积累造成显着的生长负担，通过修改的gal调控系统和控制葡萄糖的供应，实现了细胞生长阶段和角鲨烯积累阶段组成的两阶段发酵策略。第一阶段设定为48小时，其中工程菌株的生物量增加到od
600
的120.2，而没有明显的角鲨烯积累。在第二阶段，角鲨烯主要通过半乳糖对gal1-gal10启动子的诱导作用产生，角鲨烯效价达到21.1g/l这是我们已知的角鲨烯最高产量。其方法如下：
67.本发明用于分批补料发酵的基础培养基由ypd、8g/l kh2po4、3g/l mgso4、0.72g/l znso4·
7h2o、10ml/l微量元素溶液和12ml/l维生素溶液组成。
68.本发明上罐发酵种子培养过程如下：首先，将单克隆接种到5ml ypd管中来制备种子培养物，然后在220rpm的旋转振荡器中30℃下保持约18小时。其次，该种子培养物通过将0.15ml的第一级培养物转移到含有15ml ypd的250ml三角烧瓶中进行继代培养，然后在30℃下以220rpm的转速在旋转振荡器中保持约14小时。第三，种子培养物通过将3ml第二级培
养物转移到含有100ml ypd的500ml烧瓶中进行继代培养。将这些培养物在230rpm的旋转振荡器中保持在30℃约24小时，然后将10％(vol/vol)的第三级种子培养物接种到5l生物反应器(bai lun,china)中，其中含有2.7l上述发酵基础培养基。本发明上罐分批发酵在30℃下进行，发酵系统中的ph通过自动加入5m氢氧化氨来维持在5.0。空气流量范围为1vvm到2vvm(空气体积/工作体积/分钟)。
69.本发明采用了两阶段补料分批策略。在第一阶段，含有500g/l葡萄糖、9g/l kh2po4、2.5g/l mgso4、3.5g/l k2so4、0.28g/l na2so4、10ml/l微量元素溶液和12ml/l维生素溶液。当分批培养中的葡萄糖浓度降低到1g/l时，供应补料溶液以将残余葡萄糖浓度调节在1g/l和2g/l之间。当细胞开始缓慢增加(至静止期)时，第一阶段结束并加入诱导剂半乳糖。在第二阶段，除了与进料溶液中所含的相同矿物盐和微量元素外，还加入800g/l葡萄糖。该浓缩培养基用于诱导角鲨烯的积累。
70.以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。