化妆品保存方法与流程

化妆品保存方法
1.相关申请信息
2.本专利申请基于并要求于2019年5月22日递交的美国62/851,477号临时专利申请及于2019年7月29日递交的美国62/879,785号临时专利申请的优先权，在此通过引用将这两件临时专利申请的全部内容并入本文中。本专利申请还基于并要求于2020年3月17日递交的美国16/821,402号非临时专利申请的优先权，在此通过引用将该专利申请的全部内容并入本文中。
技术领域
3.本发明涉及一种具有改善的抗微生物特性的用于皮肤的组合物的制备方法、具有改善的抗微生物特性和稳定性的用于皮肤的组合物、及使用该用于皮肤的组合物治疗急性皮肤感染的方法。该用于皮肤的组合物可以是化妆品组合物。


背景技术：

4.含有水和有机/无机化合物的化妆品组合物需要进行防止微生物污染的保存，以保证消费者安全并延长保质期。化妆品工业中使用的保存策略已被证实要么对消费者有毒，要么对控制微生物无效。由于最有效防腐剂的毒性，现行法规对其使用进行了限制或禁止，但仍要求未被污染的化妆品。因此，化妆品制造商正在寻求新的保存策略，以提供在微生物学和毒理学方面都更加安全的产品。
5.本发明的保存方法可用于任何用在皮肤上的组合物，其中包括含水的化妆品组合物。
6.据发明人所知，本发明的保存方法在化妆品工业中从未使用过。作为一个完整的体系，该方法允许与天然乳化剂和天然保湿剂兼容，以控制产生乳剂时水的可用性。本发明的方法不需要通过包含本身有毒的合成或化学成分而使制剂复杂化。
7.引入本发明的保存方法可解决产品稳定性的抗菌要素，同时通过改善上皮细胞紧密连接的完整性来支持皮肤健康。此外，目前消费者对天然化妆品的需求已经增长，并且预期还会进一步快速增长。本技术发明人的发现可使化妆品工业满足不断增长的消费群的需求。


技术实现要素：

8.本发明的一方面涉及一种制备化妆品组合物的方法，包括：将原料、水和有效抑制微生物生长的第一量的第一试剂混合以获得第一混合物；及将有效抑制微生物生长的第二量的第二试剂与第一混合物混合以获得第二混合物，其中，第二试剂的温度保持在等于或小于约33℃。第一试剂可包括发酵物、培养糖、抗微生物蛋白质、抗菌肽或其组合。第二试剂可包括益生菌，其包括乳酸菌，优选乳双歧杆菌。该组合物还可包含至少一种精油和/或至少一种相关萜烯。
9.本发明的另一方面涉及一种用于皮肤的组合物，其包含有效抑制微生物生长的第
一量的第一试剂、及有效抑制微生物生长的第二量的第二试剂。第一试剂可包括发酵物。第二试剂可包括益生菌。该用于皮肤的组合物还可包含至少一种精油和/或至少一种相关萜烯。相关萜烯可以是分离的萜烯。
10.本发明的另一方面涉及一种治疗急性皮肤感染的方法，包括向有需要的对象施用有效量的本发明的化妆品组合物。
11.附图简要说明
12.图1示出了实例3的乳液的微生物总数。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(microbial count，cfu/g)。
13.图2示出了实例4的样品的金黄色葡萄球菌(staph aureus，sa)检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
14.图3示出了实例4的样品的近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis，cp)检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
15.图4示出了实例6的精华液(serum)的金黄色葡萄球菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
16.图5示出了实例6的去角质剂的金黄色葡萄球菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
17.图6是根据本发明的样品分别在样品制备后大约一个月、一年和三周拍摄的照片。从左到右依次为：精华素、去角质剂、去角质剂 hn019/mg200。
18.图7示出了实例6的乳液的金黄色葡萄球菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
19.图8示出了实例6的晚间乳液的金黄色葡萄球菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
20.图9示出了实例6的晚间乳液的酵母菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
21.图10示出了实例6的晨间乳液的金黄色葡萄球菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
22.图11示出了实例6的晨间乳液的酵母菌检测结果。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
23.图12示出了实例6的晨间乳液和晚间乳液的金黄色葡萄球菌检测结果的比较结果和纳他霉素的影响。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
24.图13示出了实例6的晨间乳液和晚间乳液的酵母菌检测结果的比较结果和精油的影响。横轴表示时间(天)，纵轴表示微生物总数(cfu/g)。
具体实施方式
25.下面详细说明了本发明的方法和组合物的示例性非限制性实施方式和示例。除非另有说明，否则，每次出现的百分比(％)是通过对固体材料使用重量(以gm(g)表示)、对液体材料使用体积(以ml表示)确定的。
26.本发明的一方面涉及用于皮肤的组合物的制备方法，包括：将原料、水和有效抑制微生物生长的第一量的第一试剂混合以获得第一混合物；及，将有效抑制微生物生长的第
二量的第二试剂与所述第一混合物混合以获得第二混合物，其中，第二试剂的温度保持在等于或小于约33℃。
27.上述第一试剂可包括抗真菌剂。第一试剂可包括发酵物(fermentate)、培养糖(cultured sugar)、抗微生物蛋白质、抗微生物肽(抗菌肽)或其组合。该发酵物可以是包含乳酸菌的组合物的发酵产物。发酵物可以是200(杜邦营养与健康，特拉华州(dupont nutrition&health,delawarede))。第一试剂的示例包括：培养糖，其示例包括但不限于乳糖、右旋糖、果糖及麦芽糊精；蛋白质，其示例包括但不限于酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白；抗菌肽；及它们的组合。
28.第二试剂可包括益生菌。益生菌可包括乳酸菌。乳酸菌的一些示例包括乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。益生菌可包括双歧杆菌属细菌(bifidobacterium bacteria)、乳杆菌属细菌(lactobacillus bacteria)、乳球菌属细菌(lactococcus bacteria)、链球菌属细菌(streptococcus bacteria)、片球菌属细菌(pediococcus bacteria)及它们的组合。优选地，益生菌包括乳双歧杆菌hn019。益生菌还可以改善抗氧化系统并提高减少自由基生成的能力，因此，支持制剂中稳定性的另一方面。它还可以改善包括气味(smell/odor)在内的感官方面，并改善组合物的质地和乳化。
29.对第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量没有特别限制。第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量可以是有效抑制霉菌或酵母生长的量。第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约0.05％或更多、约0.25％或更多、约0.5％或更多、约0.75％或更多、约1％或更多、或约2.75％或更多(按重量计，以g表示)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、或约3％或更少(按以g表示的重量计)。第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量可以是，例如，上述用于皮肤的组合物的总量的约0.25％至约5％、或约0.75％至约4％、或约1％至约3％(按重量计)。
30.可将有效抑制微生物生长的第二量的第二试剂添加到第一混合物中，以获得第二混合物；或者，可将第一混合物添加到有效抑制微生物生长的第二量的第二试剂中，以获得第二混合物；或者，可同时加入第二试剂和第一混合物以获得第二混合物。
31.对第二试剂的有效抑制微生物生长的第二量没有特别限制。有效抑制微生物生长的第二量可以是上述用于皮肤的组合物的总量的约0.10％或更多、约0.25％或更多、约0.37％或更多、或约0.50％或更多(按重量计)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总量的约5％或更少、约4％或更少、约2％或更少、或约1％或更少(按重量计)。有效抑制微生物生长的第二量可以是，例如，上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约0.10％至约5％、约0.20％至约4％、或约0.25％至约1％(按以g表示的重量计)。
32.在加入第二试剂(例如，益生菌)之后，第二试剂的温度可保持在等于或小于约33℃、等于或小于约33℃、等于或小于约32℃、等于或小于约31℃、等于或小于约30℃或等于或小于约29℃。例如，第二混合物的温度和进行一个或多个后续步骤中的每一个步骤的温度可保持在等于或小于约33℃、等于或小于约33℃、等于或小于约32℃、等于或小于约31℃、等于或小于约30℃、或等于或小于约29℃。例如，上述用于皮肤的组合物的制备方法可
包括乳化含有益生菌的组合物，并且，含有益生菌的组合物乳化结束时的温度可被控制为等于或小于约33℃、等于或小于约32℃、等于或小于约31℃、等于或小于约30℃、或等于或小于约29℃。
33.上述用于皮肤的组合物的制备方法还可包括：将至少一种精油和/或至少一种相关萜烯(terpene)与上述第二混合物混合。相关萜烯可以是分离的萜烯(isolated terpene)。例如，可将至少一种精油和/或至少一种萜烯添加到第二混合物中。或者，可将第二混合物加入到至少一种精油和/或至少一种萜烯中。或者，可将第二混合物和至少一种精油和/或至少一种萜烯同时加入到例如容器中。上述至少一种精油的示例包括：来自橄榄科(burceraceae)的精油，包括乳香精油(boswellia sacra、b.carterii、b.frereana、b.serrata和b.papyrifera)、palo santo圣木精油(bursera graveolens)、没药精油(myrrh，commiphora myrrha或commiphora molmol)和copal(protium copal)；神圣罗勒精油(tulsi或holy basil，ocimum tenuiflorum)；姜黄精油(turmeric，curcuma longa)；岩兰草精油(vetiver，vetiveria zizanioides)；大麻(hemp，cannabis salvia)油，包括籽油；源自柑橘属(芸香科，rutaceae)(示例包括甜橙(citrus sinensis)、苦橙花(citrus uranium)、柑橘(citrus reticulata)、柠檬(citrus lemon)、来檬(citrus aurantifolia)、圆柚(citrus x paradise)、香柠檬(citrus bergamia)、香橙(citrus junos)、山金橘(citrus japonica))的精油；及其组合。例如，可以使用以下精油的组合：岩兰草精油(vetiver)、palo santo圣木精油、神圣罗勒精油(holy basil)、乳香精油(frankincense)和莱姆精油(lime)。在某些实施方式中，上述至少一种精油含有萜烯，例如，柠檬烯(limonene)、α-蒎烯(alpha pinene)、石竹烯(caryophyllene)、月桂烯(myrcene)、桧烯(sabinene)、丁子香酚(eugenol)、β-榄香烯(beta-elemene)、alpha-bulsene、γ-萜品烯(gamma terpinene)、萜品油烯(terpinolene)和薄荷呋喃(menthofuran)。上述至少一种精油、或一种或多种精油的组合、和/或相关萜烯的包含物可在用于皮肤的组合物中发挥共生作用。
34.上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约0.2％或更多、约0.5％或更多、约1％或更多、约2％或更多、或约2.6％或更多(按体积计)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约10％或更少、约5％或更少、约4％或更少、或约3％或更少(按体积计)。例如，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约0.2％至约10％、约0.5％至约4％、或约1％至约3％(按体积计)。例如，当上述用于皮肤的组合物是乳液时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约2.57％(按体积计)。当上述用于皮肤的组合物是精华(serum)时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约2.6％(按体积计)。当上述用于皮肤的组合物是去角质剂(exfoliant)时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约1.14％(按体积计)。当使用多于一种精油和/或萜烯时，本发明中所述的至少一种精油和/或至少一种萜烯的量是指多于一种精油和/或萜烯的总量。
35.在一种实施方式中，本发明的用于皮肤的组合物的制备方法可包括：
36.(1)将发酵物与水成分(water element)混合以获得第一组合物；
37.(2)将油成分与蜡成分混合，加热至约63℃至约74℃，获得第二组合物；
38.(3)在第一组合物中加入甘油提取液(glycerite extraction)，搅拌，获得第三组合物；
39.(4)在第三组合物中加入益生菌，获得第四组合物；
40.(5)将冷却至约60℃的第二组合物加入第四组合物中，并在小于或等于约33℃的温度下乳化；
41.(6)将步骤(5)的产物冷却至小于或等于18℃；及
42.(7)在步骤(6)的产物中加入精油。
43.上述用于皮肤的组合物可以是霜剂(scream)。该用于皮肤的组合物的制备方法的示例可包括：
44.(1)将发酵物(约0.75％至约4％)与水成分(约50％)混合并搅拌；
45.(2)将油成分(约40％)与蜡成分(约3％)混合，并加热至约63-74℃；
46.(3)在步骤(1)的产物中加入甘油提取液(glyceriteextraction，约2％)并搅拌；
47.(4)在步骤(3)的产物中加入益生菌(约0.25％至约1％)；
48.(5)将步骤(2)得到的冷却至60℃的油/蜡组合物加入到步骤(4)得到的水/发酵物/甘油提取液/益生菌组合物中，搅拌/混合，以在小于或等于约33℃的温度下乳化；
49.(6)将混合物冷却至小于或等于18℃且大于0℃的温度；及
50.(7)在步骤(6)的产物中加入精油(约2％)，并搅拌至其混合。
51.最终产品可在约10℃至约18℃的温度下避光储存。
52.在另一种实施方式中，本发明的用于皮肤的组合物的制备方法可包括：
53.(1)将发酵物搅拌至包含水和甘油的液体组合物中，得到第一组合物；
54.(2)将益生菌搅拌至第一组合物中，得到第二组合物；及
55.(3)在第二组合物中加入至少一种精油。
56.在该实施方式中，该方法可在小于或等于21℃的温度下进行。
57.用于皮肤的组合物可以是液体组合物，例如，精华液(serum)。该液体组合物的制备方法的示例可在小于或等于21℃的温度下进行，该方法可包括：
58.(1)混合液体成分，如甘油提取液(glycerite extractions，水约28％，甘油约66％)；
59.(2)将发酵物(约0.75％至约4％)搅拌至步骤(1)所得的组合物中；
60.(3)将益生菌(约0.25％至约1％)搅拌至步骤(2)所得的组合物中；及
61.(4)加入至少一种精油(约2.50％)。
62.获得的最终产品可在约10℃至约18℃的温度下避光储存。
63.在另一种实施方式中，本发明的用于皮肤的组合物的制备方法可包括：
64.(1)将干成分、益生菌和发酵物混合，得到第一组合物；
65.(2)将第一组合物加入到包含水和甘油的液体组分中，搅拌，得到第二组合物；
66.(3)将干植物成分或粘土成分与第二组合物混合，搅拌，得到第三组合物；
67.(4)在第三组合物中加入保湿剂，搅拌，得到第四组合物；及
68.(5)将精油加入第四组合物中，并混合至混合一致。
69.液体组合物的制备方法的另一个示例可在小于或等于21℃的温度下进行，并且，该方法可包括：
70.(1)混合液体成分，如甘油提取液(glycerite extraction，水约11％，甘油约26％)；
71.(2)将奶粉基成分(约1.35％)与益生菌(约0.25％至约1％)和发酵物(约0.75％至约4％)混合，加入步骤(1)得到的组合物中，搅拌；
72.(3)将干植物成分或粘土成分(约14％)混合，加入到步骤(2)得到的组合物中，搅拌；
73.(4)在步骤(3)得到的组合物中加入保湿剂，保湿剂具体为但不限于蜂蜜(约45％)并搅拌；及
74.(5)加入至少一种精油(约1.25％)，并搅拌混合至混合一致。
75.获得的最终产品可在约10℃至约20℃的温度下避光储存。
76.本发明的另一方面涉及一种用于皮肤的组合物，其包含有效抑制微生物生长的第一量的第一试剂和有效抑制微生物生长的第二量的第二试剂。
77.第一试剂可包括发酵物(fermentate)、培养糖(cultured sugar)、抗菌蛋白、抗菌肽或其组合。该发酵物可以是包含乳酸菌的组合物的发酵产物。发酵物可以是200(杜邦营养与健康，特拉华州(dupont nutrition&health,delaware de))。第一试剂的示例包括：培养糖，其示例包括但不限于乳糖、右旋糖、果糖及麦芽糊精；蛋白质，其示例包括但不限于酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白；抗菌肽；及它们的组合。
78.第二试剂可包括益生菌。益生菌可包括乳酸菌。乳酸菌的示例包括乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)和副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)。益生菌可包括双歧杆菌属细菌(bifidobacterium bacteria)、乳杆菌属细菌(lactobacillus bacteria)、乳球菌属细菌(lactococcus bacteria)、链球菌属细菌(streptococcus bacteria)、片球菌属细菌(pediococcus bacteria)及它们的组合。优选地，益生菌包括乳双歧杆菌hn019。益生菌还可以改善抗氧化系统并提高减少自由基生成的能力，因此，支持制剂中稳定性的另一方面。它还可以改善包括气味(smell/odor)在内的感官方面，并改善组合物的质地和乳化。
79.对第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量没有特别限制。对第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量没有特别限制。有效抑制微生物生长的第一量可以是有效抑制霉菌或酵母生长的量。第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约0.05％或更多、约0.25％或更多、约0.5％或更多、约0.75％或更多、约1％或更多、或约2.75％或更多(按重量计，以gm表示)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、或约3％或更少(按重量计，以gm表示)。第一试剂的有效抑制微生物生长的第一量可以是，例如，上述用于皮肤的组合物的总量的约0.25％至约5％、或约0.75％至约4％、或约1％至约3％(按重量计)。
80.对第二试剂的有效抑制微生物生长的第二量没有特别限制。有效抑制微生物生长的第二量可以是上述用于皮肤的组合物的总量的约0.10％或更多、约0.25％或更多、约0.37％或更多、或约0.50％或更多(按重量计)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总量
的约5％或更少、约4％或更少、约2％或更少、或约1％或更少(按重量计)。有效抑制微生物生长的第二量可以是，例如，上述用于皮肤的组合物的总体积(以ml表示)的约0.10％至约5％、约0.20％至约4％、或约0.25％至约1％(按重量计，以gm表示)。
81.优选地，第一试剂为发酵物，并且，有效抑制微生物生长的第一量是上述用于皮肤的组合物的总量的约0.75％至约4％、或约1％至约3％(按重量计)。
82.优选地，第二试剂为益生菌，并且，有效抑制微生物生长的第二量是上述用于皮肤的组合物的总量的约0.25％至约1％(按重量计)。
83.用于皮肤的组合物还可包含至少一种精油和/或至少一种与防止微生物生长相关的萜烯。所述至少一种萜烯可以是至少一种分离的萜烯(isolated terpene)。上述至少一种精油的示例包括：来自橄榄科(burceraceae)的精油，包括乳香精油(boswellia sacra、b.carterii、b.frereana、b.serrata和b.papyrifera)、palo santo 圣木精油(bursera graveolens)、没药精油(myrrh，commiphora myrrha或commiphora molmol)和copal(protium copal)；神圣罗勒精油(tulsi或holy basil，ocimum tenuiflorum)；姜黄精油(turmeric，curcuma longa)；岩兰草精油(vetiver，vetiveria zizanioides)；大麻(hemp，cannabis salvia)油，包括籽油；源自柑橘属(芸香科，rutaceae)(示例包括甜橙(citrus sinensis)、苦橙花(citrus uranium)、柑橘(citrus reticulata)、柠檬(citrus lemon)、来檬(citrus aurantifolia)、圆柚(citrus x paradise)、香柠檬(citrus bergamia)、香橙(citrus junos)、山金橘(citrus japonica))的精油；及其组合。例如，可以使用以下精油的组合：岩兰草精油(vetiver)、palo santo圣木精油、神圣罗勒精油(holy basil)、乳香精油(frankincense)和莱姆精油(lime)。在某些实施方式中，上述至少一种精油含有萜烯，例如，柠檬烯(limonene)、α-蒎烯(alpha pinene)、石竹烯(caryophyllene)、月桂烯(myrcene)、桧烯(sabinene)、丁子香酚(eugenol)、β-榄香烯(beta-elemene)、alpha-bulsene、γ-萜品烯(gamma terpinene)、萜品油烯(terpinolene)和薄荷呋喃(menthofuran)。上述至少一种精油、或一种或多种精油的组合、和/或相关萜烯的包含物可在用于皮肤的组合物中发挥共生作用。
84.上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约0.2％或更多、约0.5％或更多、约1％或更多、约2％或更多、或约2.6％或更多(按体积计)，并且，可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约10％或更少、约5％或更少、约4％或更少、或约3％或更少(按体积计)。例如，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是上述用于皮肤的组合物的总体积的约0.2％至约10％、约0.5％至约4％、或约1％至约3％(按体积计)。例如，当上述用于皮肤的组合物是乳液时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约2.57％(按体积计)。当上述用于皮肤的组合物是精华(serum)时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约2.6％(按体积计)。当上述用于皮肤的组合物是去角质剂(exfoliant)时，上述至少一种精油和/或上述至少一种萜烯的量可以是该组合物的总体积的约1.14％(按体积计)。当使用多于一种精油和/或萜烯时，本发明中所述的至少一种精油和/或至少一种萜烯的量是指多于一种精油和/或萜烯的总量。
85.本发明的另一方面涉及治疗急性皮肤感染的方法，包括向有需要的对象施用有效量的本发明的用于皮肤的组合物。组合物的有效量可以是足以缓解、减轻或改善急性皮肤
感染的症状的量。治疗急性皮肤感染的方法可涉及在长时间内施用该组合物。例如，本发明的用于皮肤的组合物可在至少8小时的时间内、在至少12小时的时间内、在至少一天的时间内、在至少一周的时间内、或在至少两周的时间内施用给该对象。
86.实例
87.实例1
88.防腐试验始于利用盐通过创造不利于微生物生长的环境来控制不良微生物活动。对于该试验，评估了三种处理方式：无盐对照、低盐(0.05％)和高盐(5％)。此外，添加0.093％的lc(杜邦营养与健康，特拉华州)，以确定这种抗微生物剂与盐一起是否会产生所需的结果。开始时的结果示于表1中。一个月后的结果示于表2中。
89.表1盐试验：初始结果
[0090][0091]
使用的盐-支持“清洁标签(clean labeling)”的有机海盐(organic sea salt)。
[0092]
这些结果证实了清洁生产。细菌、酵母菌和霉菌似乎是在添加盐时引入的。
[0093]
表2盐试验：一个月后的结果
[0094][0095]
结果与讨论
[0096]
盐常用于自然保存，并被认为是一个很好且明显的出发点。这个实验中的结果表明，我们能够实现清洁生产，并且，盐在控制酵母菌、霉菌或tpc方面没有发挥作用。事实上，盐似乎在制造时通过引入不需要的细菌和y/m而起到了不利的作用。总之，盐不能控制微生物污染，因此选择不再研究这种处理方式作为可能的解决方案。
[0097]
发明人还决定，由于盐引入的混杂因素，无法确定lc是否在这些试验中发挥作用，因此，需要对lc进行更多试验以确定其功效。
[0098]
发明人决定，有必要进行合理的挑战试验(challenge testing)以确定配方是否支持这些潜在污染物的生长。
[0099]
实例2：挑战研究#1
[0100]
按以下方法制备乳液配方的两个样品：
[0101]
(1)提供水成分(约50％)；
[0102]
(2)将油成分(约40％)与蜡成分(约3％)混合，加热至约63-74℃；
[0103]
(3)向水成分(1)中加入甘油提取液(glycerite extractions，约2％)，搅拌；
[0104]
(4)在(3)中得到的混合物中加入益生菌(加入holdbac lc(一种益生菌，鼠李糖乳杆菌(lactobaccillus rhamnosis))，hn019.lc加入0.09％，hn019加入0.17％)；
[0105]
(5)将(2)得到的冷却至60℃的油/蜡加入(4)得到的混合物中，搅拌乳化≤33℃；
[0106]
(6)加入精油(约2％)，搅拌后冷却；及
[0107]
(7)将混合物冷却至低于或约18℃(并且不冻结)。
[0108]
样品在约10℃至18℃的温度下避光储存。
[0109]
将这两种化妆品乳霜样品1110001-mml乳液n92117和1110002-mml乳液e100517送到biogen laboratory developments,llc，使用金黄色葡萄球菌(staph.aureus)和近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)进行挑战试验。该实验室建议，这两种微生物将提供足够的生物负荷来评估mml制剂。试验从乳液(乳剂，emulsion)开始，因为这些产品最容易受到微生物污染问题的影响。
[0110]
在挑战研究#1中，对两种乳液样品进行了分析。分析发现，这些未经接种的产品中的每一种产品的初始微生物负荷均不含细菌、酵母菌和霉菌，如下表3所示。
[0111]
表3挑战研究#1：未经接种的产品的平板菌落计数结果
[0112][0113]
*cfu＝菌落形成单元(colony forming unit)
[0114]
每种产品分别接种金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)的24h培养物。对24h培养物进行分析以建立将提供的总体生物负荷。结果如下：
[0115]
金黄色葡萄球菌(staph.aureus)＝2.6x108cfu/ml
[0116]
近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)＝1.5x106cfu/ml
[0117]
对于每个样品，每个50g的两个子样品用金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)通过将1.0ml的24h培养物添加到50g子样品中进行接种。
[0118]
每个接种sa的子样品的最终生物负荷为2.6x106cfu/g样品。
[0119]
每个接种cp的子样品的最终生物负荷为1.5x104cfu/g样品。
[0120]
表4挑战研究1：mml乳液的微生物总数
[0121]
样品处理生物负荷t＝0t＝1天t＝2天1110001mml乳液
–
n92117sa420,000180,00038,0001110002mml乳液
–
e100517sa370,00077,00021,0001110001mml乳液
–
n92117cp7,10024,000120,000110002mml乳液
–
e100517cp9,60025,00048,000
[0122]
结果与讨论
[0123]
除了0.09％的lc(一种被证明在食品工业中可有效抑制酵母菌和霉
菌的益生菌)外，乳液n92117还含有配方中0.17％的乳双歧杆菌hn019(一种乳酸菌，通常称为益生菌)。乳化温度为99
°
f(37℃)。
[0124]
结果如表4所示。该配方中的金黄色葡萄球菌数量在24h内下降了一半以上，并在第2天下降了1个log以上。这种组合对减少酵母菌数没有影响，事实上，在此为期2天的研究过程中，酵母菌数增加了2.5个log。这表明lc不能有效控制这些化妆品配方中的酵母菌。
[0125]
除了0.09％的lc外，乳液e100517还包含配方中0.14％的乳双歧杆菌hn019。乳化温度也是99
°
f(37℃)。该乳液还含有高含量(0.59％)的橙子精油(orange essential oil)。这种组合对酵母菌没有影响。然而，金黄色葡萄球菌数的减少有所提高，甚至比n92117更显著(表4)。这再次证实了lc无法有效控制这些化妆品配方中的酵母菌。值得注意的是，添加精油可提高控制金黄色葡萄球菌的性能，并且可有助于控制酵母菌。需要做更多的研究来了解它的作用。
[0126]
数据表明，这两种配方在常温储存的前两天内金黄色葡萄球菌都逐渐减少，减少了约1个log。然而，在乳液n92117中，假丝酵母菌(candida)数在前24h内增加了近1个log，并且在48h内增加了近另一个log。e100517乳液在第2天保持稳定。e100517乳液中这些生物体的总回收率较低，这表明它比n92117配方具有更大的适应力(resilience)。将继续监测这些含量水平，以得出这些样品中这些生物体的生长趋势。
[0127]
这些数据表明，金黄色葡萄球菌可能最终在这两种配方中都被饿死，但假丝酵母菌(念珠菌)可在这两种配方中继续生长。
[0128]
实例3：挑战研究#2
[0129]
本研究旨在分析biovida(一种multi-hurtle抗微生物剂，包括芥菜籽、绿茶)的影响。这种抗微生物剂因其清洁标签状态而被选中。
[0130]
按如下方法制备乳液样品：
[0131]
(1)将发酵物(bio vida 0.89％)与水成分(约50％)混合；
[0132]
(2)将油成分(约40％)与蜡成分(约3％)混合，加热至约63-74℃；
[0133]
(3)向水成分(1)中加入甘油提取液(glycerite extraction，约2％)，搅拌；
[0134]
(4)在(3)得到的混合物中加入益生菌(0.42％hn019)；
[0135]
(5)将(2)得到的冷却至60℃的油/蜡加入(4)得到的混合物中，搅拌乳化小于或等于33℃；
[0136]
(6)加入精油(约2％)，搅拌后冷却；及
[0137]
(7)将混合物冷却至低于或约18℃(并且不冻结)。
[0138]
样品在约10℃至18℃的温度下避光储存。
[0139]
本研究是针对化妆品乳霜样品0426001-mml onpa 41018进行的。
[0140]
先对乳霜进行分析，以检查本底微生物(background organisms)(表5)。
[0141]
表5挑战研究2：本底微生物数
[0142][0143]
*cfu＝菌落形成单元(colony forming unit)
[0144]
对于该样品，每个50g的两个子样品用金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)通过分别向50g子样品中加入0.5ml金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)的24h培养物进行接种。
[0145]
对24h培养物进行分析以确定样品中添加了多少细菌。
[0146]
金黄色葡萄球菌(staph.aureus)：1.1x108cfu/ml
[0147]
近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)：1.4x107cfu/ml
[0148]
接种sa的每个50g子样品接收大约1,100,000cfu/g样品。接种cp的每个50g子样品接收大约140,000cfu/g样品。
[0149]
结果：结果示于图1和下面的表6中。
[0150]
表6挑战研究2中的微生物总数
[0151] 0426001 sa0426001 cp第0天240,00020,000第1天710,00037,000第2天250,00037,000第3天150,00041,000第4天100,00080,000第5天40,000120,000第6天12,00096,000第7天100180,000第14天10310,000第21天3,7005,500,000
[0152]
在这项研究中，没有看到金黄色葡萄球菌的减少，正如在之前的实验中看到的那样。乳液温度为95
°
f(35℃)。乳双歧杆菌hn019是在该过程的早期添加的。配方中未使用萜烯(柠檬烯
–
橙子精油含量为90％)。可能的原因是乳双歧杆菌hn019的添加时间和添加顺序可能会产生影响，因为它比之前显示出更好结果的试验更早引入。此外，萜烯的缺乏可能也起到了一定的作用。biovida似乎没有对金黄色葡萄球菌或近平滑假丝酵母菌产生积极影响。
[0153]
实例4：挑战研究#3
[0154]
该实验比较了发酵物(mg100(有机乳制品)、mg200(有机)、mg210(非有机))和抗微生物剂(不同水平的纳他霉素(natamycin，natam))及它们对金黄色葡萄球菌和近平滑假丝酵母菌的影响。由于过程可能在结果中发挥作用，因此，特定的处理条件(顺序和温度)及其对微生物结果的潜在影响的评估将包括在所有未来的研究中。
[0155]
研究：
[0156]
mml-1：men 70918(7/9am)
–
mg100
[0157]
mml-2：een 71018(7/10am)
–
mg200
[0158]
mml-3：even 71118(7/11am)
–
mg210
[0159]
mml-4：晨间乳液(morning emulsion)81418(8/14/18am)——纳他霉素(0.025％)
[0160]
mml-5：晚间乳液(eve emulsion)81818(8/14/18am)——纳他霉素(0.0125％)
[0161]
通过类似于实例3的方法制备五种乳霜(本实例中特别指出的那些组分、量和/或条件除外)。所有处理包括0.41％-0.47％的乳双歧杆菌hn019。
[0162]
先对每种乳霜进行分析以确定本底微生物。对产品进行apc、酵母菌和霉菌分析(表7)。
[0163]
表7实例4中的本底微生物数
[0164][0165]
*cfu＝菌落形成单元(colony forming unit)
[0166]
每种产品分别接种金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)的24h培养物。对24h培养物进行分析以确定将提供的总体生物负荷。
[0167]
金黄色葡萄球菌(staph.aureus)＝2.8x108cfu/ml
[0168]
近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)＝3.7x106cfu/ml
[0169]
对于每个样品，每个100g的两个子样品用金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)通过将1.0ml 24h培养物添加到100g子样本中进行接种。
[0170]
接种sa的每个100g子样品的最终生物负荷为2.8x106cfu/g样品。
[0171]
接种cp的每个100g子样品的最终生物负荷为37,000cfu/g样品。
[0172]
结果与讨论
[0173]
实例4的结果示于表10-表12、以及图2和图3中。
[0174]
表8 mml-1的微生物总数
[0175]
[0176][0177]
表9 mml-2的微生物总数
[0178] mml-2samml-2cp第0天800,00017,000第1天5807,000第2天1,2001,300第3天1,200220第4天2,200210第5天8,90040第6天50,00010第7天67,000《10
[0179]
表10 mml-3的微生物总数
[0180] mml-3samml-3cp第0天400,00018,000第1天35,00016,000第2天1503,300第3天101,900第4天《101,000第5天101,300第6天101,300第7天30790
[0181]
表11 mml-4的微生物总数
[0182][0183]
[0184]
表12 mml-5的微生物总数
[0185] mml-5samml-5cp第0天800,00013,000第1天110,00021,000第2天13,00015,000第3天《108,500第4天《1010,000第5天206,700第6天《105,300第7天101,200
[0186]
men 70918 mg100
–
乳双歧杆菌hn019的顺序正确，但过程结束温度(乳化后)为107
°
f(41.6℃)。该处理显示金黄色葡萄球菌(sa)和近平滑假丝酵母菌(cp)分别从第4周和第6周开始增加。温度可能是导致失败的原因。由于mg100没有影响，该成分将不再进行进一步试验。
[0187]
een 71018
–
该产品含有萜烯(橙子精油和依兰依兰来源(ylang ylang sourced))。虽然没有记录，但假设这种处理的最终温度也很高。金黄色葡萄球菌较高，这与乳化过程中温度升高时的其他试验一致。这种处理对减少酵母菌有显著影响，需要进一步研究以评估mg200。
[0188]
乳化后的最终温度似乎与影响金黄色葡萄球菌(sa)结果有关。b.lactis hn109在温度低于101
°
f(38.3℃)时明显更有效。
[0189]
岩兰草精油(vetiveria zizanioides)显示出潜在影响，如even 71118中所见。对于71118，乳化温度为101
°
f(38.3c)，添加顺序正确，mg210。
[0190]
由于mg200具有良好的性能和清洁标签(有机认证)，因此，在未来的研究中将使用这种抗微生物剂来代替mg 210。
[0191]
mg200和精油之间可能有关系。具体地，岩兰草精油可提供支持或共生关系。
[0192]
尽管纳他霉素(natamycin)对近平滑假丝酵母菌(cp)显示出良好的控制，但是，它对产品质量会产生负面影响，包括负面的气味和粘稠度影响。此外，纳他霉素也不被视为清洁标签。由于这些原因，这种成分将在未来的实验中去除。
[0193]
实例5：挑战研究#4
[0194]
在这项研究中，设计了三种处理方式来分离影响植物(大麻)和精油。将b.lactis hn019添加到所有处理中以支持对金黄色葡萄球菌的控制。这是第一项评估在冷却至65
°
f(18.3℃)后添加萜烯的研究。所关切的是较高的温度可能会导致细胞毒性成分(它们对温度敏感)。
[0195]
通过类似于实例3的方法制备样品(在该实例中特别指出的那些组分、量和/或条件除外)。
[0196]
处理方式：
[0197]
晨间乳液混合物(morning e blend)112918(岩兰草(vetiveria zizanioides)，精油(萜烯)，大麻，mg200，88f)
[0198]
晚间乳液混合物(evening blend)121018(岩兰草，冷却后添加精油(萜烯)，大麻，
mg200，2.5％ncfm，88f)
[0199]
晚间乳液(evening e)112618(岩兰草，冷却后添加萜烯，大麻，mg200，109f)
[0200]
112918-第4天抑制金黄色葡萄球菌，第5天抑制酵母菌至150。
[0201]
121018-第4天抑制金黄色葡萄球菌，上升，然后在第7天《10；酵母菌数在第7天为20。
[0202]
112618-金黄色葡萄球菌在第7天控制在1,500,000cfu，酵母菌在第7天控制在10cfu/g。温度似乎对b.lactis hn019产生了负面影响。这进一步证实了温度是解决金黄色葡萄球菌结果的关键。
[0203]
结论：酵母菌和金黄色葡萄球菌在3个处理中的2个中得到控制。乳化后的温度仍然是一个相关因素。对于酵母菌结果，mg200和冷却后添加精油似乎有助于产生积极的结果。
[0204]
实例6：挑战研究#5
[0205]
在本研究中，使用标准化方案(顺序、温度、mg200和乳双歧杆菌hn019)评估了精油在乳液配方中的作用。该研究还评估了低含量纳他霉素的作用，以确定其对酵母菌数的影响。
[0206]
通过类似于实例3的方法制备乳液制剂(本实例中特别指出的那些组分、量和/或条件除外)。首先，将发酵物加入水中。
[0207]
在试验中添加三种额外的配方：一种精华液(serum，含有水)，两种去角质剂(含有可导致微生物污染的成分)，以确定目前在乳液配方中显示出积极结果的保存方法是否可以转移到其他化妆品配方中。这两种制剂均通过冷制法制备。
[0208]
精华液是在低于或等于21℃的低温下制备的，具体如下：
[0209]
(1)混合液体成分，具体是甘油提取物(水约28％，甘油约66％)；
[0210]
(2)将发酵物mg200(约0.09％)搅拌至(1)中所得的液体中；
[0211]
(3)将0.49％的益生菌b.lactis hn019和1.68％的嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)ncfm(用于皮肤健康)搅拌到(2)中得到的液体中；及
[0212]
(4)加入精油(约2.50％)。
[0213]
精华液在约10℃至18℃下避光储存。
[0214]
去角质剂通过以下在小于或等于21℃的温度下进行的方法制备：
[0215]
(1)混合液体成分，例如，甘油提取液(水约11％，甘油约26％)；
[0216]
(2)将奶粉基成分(约1.35％)与益生菌(约0.25％至约1％)和发酵物(约0.75％至约4％)混合，加入步骤(1)所得的组合物中，搅拌；
[0217]
(3)混合干植物成分或粘土成分(约14％)，加入到步骤(2)得到的组合物中，搅拌；
[0218]
(4)在步骤(3)得到的组合物中加入保湿剂并搅拌，保湿剂具体为但不限于蜂蜜(约45％)；及
[0219]
(5)加入至少一种精油(约1.25％)，并搅拌混合至混合一致。
[0220]
获得的最终产品在约10℃至约20℃的温度下避光储存。
[0221]
提供了四种乳霜混合物、两种去角质剂和一种精华液，以挑战其对抗金黄色葡萄球菌和近平滑假丝酵母菌。
[0222]
先对每种乳霜进行分析以检查本底微生物水平(表13)：
[0223]
表13实例7中的本底微生物水平
[0224][0225]
*cfu＝菌落形成单元(colony forming unit)
[0226]
对于每个样品，每个样品的两个子样品用金黄色葡萄球菌(sa)或近平滑假丝酵母菌(cp)通过将0.4ml24h培养物添加到40g的每个子样品中进行接种。
[0227]
对24h培养物进行分析以确定样品中添加了多少细菌。
[0228]
金黄色葡萄球菌(staph.aureus)：2.1x108cfu/ml
[0229]
近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)：5.8x104cfu/ml
[0230]
接种sa的每个100g子样品接收大约2,100,000cfu/g样品。
[0231]
接种cp的每个100g子样品接收大约580cfu/g样品。
[0232]
结果
[0233]
表14每个0510001-mml混合物的菌落总数结果
[0234]
0510001-mml植物精华液0423019sa0423019cp第0天1,100,000《10第1天190《10第2天50《10第3天160《10第4天30《10第5天50《10第6天40《10第7天80《10第14天50《10第21天160《10第28天80《10
[0235]
第2天减少至本底水平；酵母菌在第0天相继死亡。
[0236]
表15每个0510002-mml混合物的菌落总数结果
[0237][0238][0239]
第21天减少至本底水平；酵母菌在第6天相继死亡。
[0240]
表16每个0510003-mml混合物的菌落总数结果
[0241]
0510003-mml植物去角质剂050719 sa050719 cp第0天3,300,000200第1天560,000《10第2天30,000《10第3天47,000《10第4天1,000《10第5天2,500《10第6天400《10第7天280《10第14天400《10第21天600《10第28天500《10
[0242]
在第6天减少至本底水平；酵母菌在第1天相继死亡。
[0243]
表17每个0510004-mml混合物的菌落总数结果
[0244][0245][0246]
在第2天减少至本底水平；酵母菌在第4天相继死亡。
[0247]
表18每个0510005-mml混合物的菌落总数结果
[0248]
0510005-mml植物晚间乳液#2043019sa043019cp第0天510,000170第1天5,000200第2天《10120第3天《1070第4天《1020第5天《10《10第6天《10《10第7天《10《10第14天30《10第21天《10《10第28天《10《10
[0249]
在第2天减少至本底水平；酵母菌在第5天相继死亡。
[0250]
表19每个0510006-mml混合物的菌落总数结果
[0251]
0510006-mml植物晨间乳液#3050619sa050619cp第0天700,000150第1天11,000170第2天1030第3天1020第4天10《10
第5天20《10第6天20《10第7天《10《10第14天150《10第21天《10《10第28天《10《10
[0252]
在第2-7天减少至本底水平；酵母菌在第4天相继死亡。
[0253]
表20每个0510007-mml混合物的菌落总数结果
[0254]
0510007-mml植物晨间乳液#4050619sa050619cp第0天1,100,000240第1天10,000110第2天30《10第3天1030第4天10《10第5天30《10第6天20《10第7天10《10第14天20《10第21天《10《10第28天《10《10
[0255]
在第2-21天减少至本底水平；酵母菌在第4天相继死亡。
[0256]
精华液(serum)：精华液含有0.49％乳双歧杆菌hn019、2.6％精油(萜烯)、1.68％嗜酸乳杆菌ncfm(用于皮肤健康)和1.09％mg200。该数据表明，一天后金黄色葡萄球菌显著减少，不存在酵母菌(见图4)。这种配方和方法正在努力降低挑战水平。
[0257]
去角质剂：该配方中没有添加水，但由于包括粘土和蜂蜜在内的其他成分，它被认为容易受到微生物污染。试验结果如图5所示。
[0258]
处理030118-该配方不含乳双歧杆菌hn019，但在第21天时能够降低金黄色葡萄球菌本底水平，并且，在第6天时不存在酵母菌。但是，添加0.37％的乳双歧杆菌hn019和2.1％的mg200后，在第6天达到金黄色葡萄球菌的本底水平，并且，在第1天不存在酵母菌。这表明添加乳双歧杆菌hn019和mg200对减少这些微生物污染物有显著贡献。
[0259]
此外，在该配方中包含益生菌和mg200时出现了意想不到的质量属性。如图6所示，这些成分的添加为最终产品提供了永久性的正乳化作用。如果没有这个，配方会迅速分离，这会导致分配该产品时出现问题。这是一个重大的质量改进。
[0260]
晨间乳液和晚间乳液
[0261]
该实验旨在比较含和不含精油的晨间乳液和晚间乳液配方(配方#1和#3不含精油)。此外，还评估纳他霉素(晨间乳液#2和晚间乳液#4)对酵母菌结果的功效。
[0262]
这些乳液都含有0.4-0.6％的乳双歧杆菌hn019和2.83％的mg200。只有晚间乳液#1和#2含有0.0056％的纳他霉素。晨间乳液不含纳他霉素。
[0263]
结果与讨论
[0264]
结果如图7至图13所示。图7示出了实例6乳液的金黄色葡萄球菌分析结果。图8示出了实例6晚间乳液的金黄色葡萄球菌分析结果。图9示出了实例6晨间乳液的酵母菌分析结果。图10示出了实例6晨间乳液的金黄色葡萄球菌分析结果。图11示出了实例6晨间乳液的酵母菌分析结果。图12示出了实例6的晨间乳液和晚间乳液的金黄色葡萄球菌分析结果的比较和纳他霉素的影响。图13示出了实例6的晨间乳液和晚间乳液的酵母菌分析结果的比较和精油的影响。
[0265]
该项研究发现，精油(包括萜烯)似乎对乳液的保存有影响。它们可能是用于控制化妆品中微生物生长的hurtle-type技术的一部分。在其他研究中，精油被证明具有抗菌作用。在查看这些结果时，此时可能不排除配方中的植物成分的贡献。可能需要更多的研究来确定植物成分在促进这种保存方法中的作用。
[0266]
乳液温度的影响：晨间乳液#3和#4的乳液温度为86
°
f(30℃)，在65
°
f(18.3℃)下添加精油。晚间乳液#1和#2的乳液温度为83
°
f(28.3℃)，在65
°
f(18.3℃)下添加精油。结果突出了温度变化的潜在影响。
[0267]
晚间乳液含有纳他霉素。纳他霉素不影响菌数，事实上，酵母菌数在14天内保持高于不含纳他霉素的配方。此外，纳他霉素对乳液的气味(醋)和稠度有不利影响。