靶向协同癌症免疫疗法的制作方法

靶向协同癌症免疫疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,061的权益，其披露内容通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

3.癌症免疫疗法的目标之一是引发有效的抗肿瘤免疫反应，尤其是t细胞反应，这是抗击癌症的主要驱动力。虽然有多种选择可以为t细胞激活提供抗原，但为了提高治疗效果，需要用来诱导可促进t细胞激活的细胞因子(诸如il-1β)的分泌的方法。以前，促炎辅助剂诸如脂多糖(lps)与氧化磷脂(oxpapc)的组合已被用于从巨噬细胞或树突细胞诱导il-1β。将il-1β添加到这些细胞分泌的免疫调节剂库中，赋予它们诱导有效的抗原特异性t细胞反应的能力。因此，以这种方式刺激的细胞被称为“超活化的”，其活性对于改善旨在刺激适应性免疫的疗法可能至关重要。迄今为止，超活化细胞的技术仅限于通过针头注射可及的那些技术。在身体的其他组织中超活化树突细胞(或巨噬细胞)的一般方法仍有待开发。
4.免疫检查点阻断(icb)免疫疗法取得了巨大的初步成功，如一些用icb治疗的患者的总体生存率和持久反应的显著改善所显示的那样(ribas等人,science[科学].359(6382):1350-1355(2018))。然而，反应率仅约为25％，且对于某些免疫原性低的癌症甚至可能更低，因此迫切需要改善icb的反应率(sharma等人,science[科学].348(6230):56-61(2015))。越来越多的证据表明，对icb的反应与抗肿瘤免疫细胞的浸润呈正相关，尤其是肿瘤微环境(tme)中的t细胞(chen等人,nature[自然].541(7637):321-330(2017)；binnewies等人,nat med.[自然
·
医学]24(5):541-550(2018)；fridman等人,nat rev clin oncol.[自然综述:临床肿瘤学]14(12):717-734(2017).)因此，引发有效的t细胞反应对于改善icb的反应率至关重要。
[0005]
诸如肽疫苗或mrna疫苗等疫苗已被用于诱导有效的t细胞反应，这些反应可以抑制肿瘤生长并与icb协同作用(kuai等人,nat mater.[自然
·
材料]16(4):489-496(2017)；kranz等人,nature[自然].534(7607):396-401(2016))，但是这些方法需要识别和使用肿瘤抗原。虽然在一些情况下，对肿瘤活检样本的分析可有助于识别肿瘤新抗原，但它是侵入性的、低产量的和有技术挑战的。向肿瘤局部注射疗法可有助于诱导抗肿瘤免疫反应，同时防止系统免疫反应(sagiv-barfi等人,sci transl med.[科学
·
转化医学]10(426),2018)，但最好采用非侵入性治疗方法。
[0006]
最近，通过化疗(pfirschke等人,immunity[免疫学].44(2):343-354(2016))、放疗(twyman-saint等人,nature[自然].520(7547):373-377(2015))、光热疗法(chen等人,nat commun.[自然免疫学]7:13193(2016))、光动力疗法(castano等人,nat rev cancer[自然癌症综述].6(7):535-545(2006))或声动力疗法(nomikou等人,chemmedchem.[药物化学]7(8):1465-1471(2012))原位杀死肿瘤细胞已被用于为树突细胞(dc)产生肿瘤抗原，这些树突细胞呈递t细胞激活的抗原表位，但这些方法无法控制对t细胞的激活有深远影响的细胞因子的产生。例如，最近的研究显示，巨噬细胞或树突细胞分泌的较高水平的il-1β
与更强的t细胞反应相关。为了诱导il-1β分泌，将诸如氧化1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(oxpapc)等免疫调节剂与诸如脂多糖(lps)等促炎辅助剂组合(zanoni等人,science[科学].352(6290):1232-1236(2016))，否则会产生极少的il-1β。这些刺激导致dc和巨噬细胞的“超活化”，导致比标准的基于lps的免疫引发的更强和更有效的t细胞反应。然而，超活化dc和巨噬细胞的能力仅限于真皮和肌肉细胞(通过针头注射获得)。目前还没有在身体的深层组织中诱导吞噬细胞超活化的方法。为了克服现有方法的局限性，需要一种同时实现肿瘤细胞的原位杀死(以产生肿瘤抗原)和超活化细胞的受控产生的通用方法。
[0007]
受活性氧物质(ros)升高与免疫细胞活性增加相关的事实启发(habtetsion等人,cell metab.[细胞代谢]28(2):228-242e226(2018))，我们着手控制ros的产生，以诱导免疫细胞的超活化和t细胞激活关键细胞因子的分泌。特别地，我们选择使用超声和声敏剂产生ros，因为它们具有良好的安全性概况(rwei等人,nat biomed eng.[自然生物医学工程]1:644-653(2017))，且适用于广泛的组织，包括那些通过活检或激光难以到达的相对较深的组织。当声敏剂暴露于具有一定频率和强度的超声时，声波递送的能量可以激发声敏剂，当激发的电子返回基态时，可以产生ros。虽然这种方法(也称为声动力学疗法)已被用于体外和体内抑制肿瘤生长，但如何利用它来控制免疫细胞的激活，尤其是控制免疫细胞分泌关键细胞因子以促进t细胞激活尚未得到彻底探索。


技术实现要素：

[0008]
在一方面，本发明提供了一种诱导细胞因子分泌的方法，该方法包括：(a)使哺乳类抗原呈递细胞(apc)与声敏剂和免疫调节剂接触；以及(b)将(a)中的apc暴露于超声辐射持续足以诱导这些apc分泌细胞因子的时间段。
[0009]
在一些实施例中，该细胞因子包含il-1β和tnf-α中的一者或两者。在一些实施例中，这些apc包括巨噬细胞。在一些实施例中，这些apc存在于哺乳类对象中。在一些实施例中，该哺乳类对象患有肿瘤，且接触和暴露这些apc导致杀死该肿瘤的细胞。
[0010]
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳类对象中诱导il-1β分泌的方法，该方法包括
[0011]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0012]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0013]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0014]
在一些实施例中，该声敏剂包含卟啉(porphyrin)、菁(cyanine)、份菁(merocyanine)、酞菁(phthalocyanine)、萘酞菁(naphthalocyanine)、三苯基甲川(triphenylmethine)、吡喃鎓(pyrilium)染料、硫代吡喃鎓(thiapyrilium)染料、方酸菁(squarylium)染料、克酮酸菁(croconium)染料、薁菁(azulenium)染料、吲哚苯胺(indoaniline)、苯并吩噁嗪(benzophenoxazinium)染料、苯并硫代吩噻嗪(benzothiaphenothiazinium)染料、蒽醌(anthraquinone)、萘醌(naphthoquinone)、靛蒽酮(indathrene)、邻苯二甲酰吖啶酮(phthaloylacridone)、三苯酚合苯醌(trisphenoquinone)、偶氮(azo)染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮(tropone)、四嗪(tetrazine)、双(二硫纶)(bis(dithiolene))复合物、双(苯-二硫
醇盐)(bis(benzene-dithiolate))复合物、碘苯胺(iodoaniline)染料、双(s,o-二硫纶)(bis(s,o-dithiolene))复合物、或其衍生物或组合。
[0015]
在一些实施例中，该声敏剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，dope)或胆固醇。
[0016]
在一些实施例中，该免疫调节剂包括1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)、lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(monophosphoryl lipid a，mpla)、蒙塔尼德(montanide)ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体(vector)系统、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod，r848)、嘎德莫特(gardiquimod)、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占(vadimezan)、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该免疫调节剂包括papc、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。
[0017]
在一些实施例中，该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0018]
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳类对象中引发免疫细胞分泌细胞因子的方法，该方法包括：
[0019]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0020]
(b)向该对象施用免疫调节剂，
[0021]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0022]
在一些实施例中，该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合。
[0023]
在一些实施例中，该声敏剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0024]
在一些实施例中，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、
ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。
[0025]
在一些实施例中，该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0026]
在又另一方面，本发明提供了一种在哺乳类对象中促进t细胞激活的方法，该方法包括：
[0027]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0028]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0029]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0030]
在一些实施例中，该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、或双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合。
[0031]
在一些实施例中，该声敏剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0032]
在一些实施例中，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。
[0033]
在一些实施例中，该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0034]
一种治疗哺乳类对象的肿瘤的方法，该方法包括：
[0035]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0036]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0037]
(c)此后，将该肿瘤暴露于超声辐射。
[0038]
在一些实施例中，该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合。
[0039]
在一些实施例中，该声敏剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂与亲脂性部分缀合。
[0040]
在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0041]
在一些实施例中，该免疫调节剂选自由以下各项组成的组：cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、和其衍生物和组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。
[0042]
在一些实施例中，该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。在一些实施例中，该亲脂性部分是dope或胆固醇。在一些实施例中，该哺乳类对象是人。
[0043]
在又另一方面，本发明提供了一种用于在哺乳类中诱导促进t细胞激活的细胞因子分泌的试剂盒，该试剂盒包含：
[0044]
(a)声敏剂，该声敏剂包括卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合；以及
[0045]
(b)一种免疫调节剂，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。在一些实施例中，该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、
juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。
[0046]
在一些实施例中，该声敏剂或该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂和该免疫调节剂都被封装在相同或不同的脂质体中。
[0047]
在一些实施例中，该声敏剂、该免疫调节剂或两者与一个或多个亲脂性部分缀合。
[0048]
在一些实施例中，这些亲脂性部分选自dope或胆固醇。
[0049]
在进一步的方面，本发明提供了一种对对象进行胃肠外施用的药物组合物，该组合物包含：
[0050]
(a)声敏剂，该声敏剂包括卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合；
[0051]
(b)免疫调节剂，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合；以及
[0052]
(c)药学上可接受的载体(carrier)。
[0053]
在一些实施例中，该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该sting激动剂是环二核苷酸，诸如cgamp。在一些实施例中，该声敏剂或该免疫调节剂被封装在脂质体中。在一些实施例中，该声敏剂和该免疫调节剂都被封装在相同或不同的脂质体中。
[0054]
在一些实施例中，该声敏剂、该免疫调节剂或两者与一个或多个亲脂性部分缀合。在一些实施例中，这些亲脂性部分选自dope和胆固醇。
[0055]
在本文所述的实施例中，诱导、引发或促进反应意味着增加反应。在一些实施例中，该增加可以是从2倍到2000倍或更多，或从2、5、10、20、40或80倍中的任何一个到100、
200、400、800、1600或3200倍中的任何一个。
[0056]
在本文所述的实施例中，超声辐射是指治疗性超声。
[0057]
定义
[0058]“诱导”反应，诸如诱导细胞因子分泌，包括引发和/或增强或促进反应。本领域技术人员容易理解，这通常是与除感兴趣的参数外其他相同的条件相比，或者与另一个条件相比(例如，与不治疗或仅使用声敏剂、免疫调节剂和超声治疗中的一种或两种相比，使用声敏剂、免疫调节剂和超声治疗导致诱导细胞因子分泌)。例如，“诱导”反应意味着增加反应。
[0059]
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容的适于施用给人或另一哺乳类的固体或液体填料、稀释剂或封装物质。
[0060]“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。药学上可接受的进一步是指与生物系统诸如细胞、细胞培养物、组织、或生物体相容的无毒材料。
[0061]“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与其结合以促进应用。载体的特性将取决于施用途径。药物组合物的组分也能够与本发明的声敏剂或免疫调节剂混合(且彼此混合)，其方式使得不存在会实质上损害所期望的药物功效的相互作用。该药学上可接受的载体在体内施用时必须是无菌的。生理上和药学上可接受的载体包括稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其他材料。
[0062]“胃肠外”包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或输注。优选地不将静脉内或肌肉内注射途径用于长期疗法和预防。然而，在紧急情况下，静脉内或肌肉内注射施用途径可能是优选的。由于对患者而言的方便性以及给药计划，预防性治疗首选口服施用。应当理解，在一些情况下，施用途径还可取决于所治疗的病症。例如，如果该病症是局部的(例如，特应性皮炎或湿疹)，则可以局部、皮内或皮下施用该拮抗剂。可以使用垫、纱布、绷带、压缩服、乳膏、洗剂、喷雾剂、润肤剂等实现局部施用，所有这些都包含感兴趣的拮抗剂。
[0063]“对象”是指易患或患有肿瘤或其他需要诱导分泌il-1β、引发免疫细胞分泌细胞因子或促进t细胞激活的任何哺乳类。对象可以是人和非人对象。
附图说明
[0064]
图1a和1b显示超声(us)可以允许精确消融肿瘤且激活抗肿瘤免疫。声敏剂在暴露于超声后可产生ros，其不仅在超声治疗区域具有直接的肿瘤杀伤作用，还可与免疫调节剂协同激活先天免疫细胞且诱导关键细胞因子的分泌，与濒死肿瘤细胞提供的抗原一起，可以诱导适应性免疫反应的激活，从而可以潜在地消除所有肿瘤细胞。图1a显示了一般方法，且图1b集中于利用脂质体的方法。
[0065]
图2显示了使用超声和声敏剂有效产生ros。显示的是在不存在或存在超声的情况下指定配制品的ros水平。
[0066]
图3a-3b显示了巨噬细胞的激活依赖于组合物和超声。图3a显示了在不存在或存在超声(us)的情况下，使用指定配制品处理后，巨噬细胞(raw 264.7)分泌tnf-α。a＝r848，b＝icg，us＝超声，且图3b显示了超声时间对巨噬细胞(raw 264.7)分泌tnf-α的影响。
[0067]
图4a-图4b显示了il-1β分泌高度依赖于组合物和超声。图4a显示了在不存在或存在超声(us)的情况下，使用指定配制品处理后，ibmdm分泌il-1β。a＝papc，b＝icg，us＝超
声。图4b显示了超声时间对巨噬细胞ibmdm分泌il-1β的影响。
[0068]
图5a-图5b显示了ros的消耗损害了细胞因子的分泌。图5a显示了用含有不同浓度(l＝低浓度，m＝中浓度，h＝高浓度)的ros清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)的指定配制品处理后，ibmdm分泌il-1β。图5b显示了用指定配制品处理后ibmdm的活力。用台盼蓝染色测量活力，以排除nac对xtt测定的干扰。
[0069]
图6a-图6b显示了ros增加和巨噬细胞激活都有助于体外肿瘤杀伤。图6a显示了使用transwell系统进行共培养测定的示意图。图6b显示了在不存在或存在超声的情况下，使用指定配制品处理后，与巨噬细胞(raw264.7)共培养的肿瘤细胞(ct26)的活力。a＝r848，b＝icg，us＝超声。
[0070]
图7显示了脂质体的制备的示意图。
[0071]
图8a-图8d显示了脂质体的制备和表征。显示的是lipo-r848/icg(图8a-图8b)或lipo-papc/icg(图8c-图8d)的负载效率和尺寸分布。
[0072]
图9显示了脂质体可显著延长声敏剂icg的循环时间。显示的是在小鼠中静脉内注射后游离icg和含有icg的脂质体(lipo-icg)的药代动力学概况。
[0073]
图10a-图10b显示了使用脂质体进行声敏剂/免疫调节剂的共递送随后超声显示了有效的治疗效果。在第0天，将balb/c小鼠在右肋皮下接种2
×
105个ct26细胞/小鼠，且在第10天，静脉内注射含有r848和icg(图10a)或papc和icg(图10b)的配制品。超声(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2w/cm2)在第11天应用于指定动物组。显示的是治疗后的肿瘤生长曲线。
[0074]
图10c是静脉内注射lipo-icg或icg后荷瘤小鼠的随时间的一系列荧光图像。
[0075]
图10d是量化图10c小鼠肿瘤中荧光的散点图。数据显示了代表性实验(n＝3)的平均值
±
标准偏差。
[0076]
图11a是显示balb/c小鼠在第17天肿瘤内t细胞反应的一系列facs点图。在第0天，将小鼠在右肋皮下接种2
×
105个ct26细胞/小鼠，且在第10天，静脉内注射含有60ug/剂量papc和60ug/剂量icg的配制品。超声(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2.5w/cm2)在注射指定配制品后一天应用。
[0077]
图11b是显示图11a中所述小鼠肿瘤中cd8 细胞百分比的盒形图。须线，第5至95个百分位数；未治疗为n＝8，且其他两组为n＝9。*p《0.05，通过单因素anova和tukey多重比较事后检验进行分析。
[0078]
图11c是显示图11a中所述小鼠的cd8/cd4比率的盒形图。须线，第5至95个百分位数；未治疗为n＝8，且其他两组为n＝9。*p《0.05，通过单因素anova和tukey多重比较事后检验进行分析。
[0079]
图11d是显示图11a中所述小鼠中肿瘤体积随时间增长的散点图。
[0080]
图11e是显示图11a中所述小鼠的kaplan-meier曲线的图。
[0081]
图11f是显示在第40天用2
×
105个ct26细胞/小鼠再次激发并再观察40天的balb/c小鼠(其原发性肿瘤消退)中肿瘤体积随时间增长的图。显示的是个体ct26肿瘤生长曲线和动物存活率(n＝3)
[0082]
图11g是显示图11f中所述小鼠的kaplan-meier曲线的图。
具体实施方式
[0083]
一般而言，本发明提供了用于诱导免疫细胞(例如，专职抗原呈递细胞，诸如巨噬细胞)分泌细胞因子(例如，il-1β)、促进t细胞激活、或治疗对象肿瘤的组合物和方法。本文披露的方法典型地涉及：(a)向该对象施用声敏剂，(b)向该对象施用免疫调节剂，以及(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。该声敏剂和免疫调节剂可以分开或同时施用。当同时施用时，该免疫调节剂和声敏剂可以在相同药物组合物中施用。可替代地，当同时施用时，该免疫调节剂和声敏剂可以在分开的药物组合物中施用。
[0084]
本文所述的药物组合物可以是脂质体配制品。典型地使用脂质配制脂质体。用于脂质体药物组合物的脂质可包括，例如，蛋磷脂酰胆碱(pc)、蛋磷脂酰甘油(pg)、大豆磷脂酰胆碱(pc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、大豆磷脂酰甘油(pg)、脑磷脂酰丝氨酸(ps)、脑鞘磷脂(sm)、二癸酰基磷脂酰胆碱(ddpc)、二瓢儿菜基磷脂酰胆碱(depc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(pmpc)、棕榈酰硬脂酰基磷脂酰胆碱(pspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二月桂酰基磷脂酰甘油(dlpg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(dmpg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(popg)、二肉豆蔻酰基磷脂酸(dmpa)、二棕榈酰磷脂酸(dppa)、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dmps)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(dpps)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、二棕榈酰鞘磷脂(dpsm)、二硬脂酰鞘磷脂(dssm)、或其组合。可以在药物组合物的制备和使用药物组合物的方法中利用已知的用于配制包含免疫调节剂的组合物的原理。此类原理可以在例如us 2018/0318414中找到，其披露内容通过引用以其整体并入本文。
[0085]
在这里，我们显示，由声敏剂和超声产生的活性氧物质(ros)不仅可以用于直接杀死肿瘤细胞，还可以作为诱导吞噬细胞超活化标志的开关，诸如在1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(papc)存在下分泌il-1β。此外，从组合(papc/声敏剂/超声)中去除任何组分完全消除巨噬细胞分泌il-1β，且可以通过改变超声参数(诸如超声暴露时间)轻松调节激活。该方法能够精确控制免疫细胞激活和分泌细胞因子的位置和程度，这些细胞因子与濒死肿瘤细胞的抗原一起，可以导致适应性免疫反应的激活(图1a和1b)。为了进一步改善体内应用的声敏剂和免疫调节剂的药代动力学概况，我们将这些分子包装在脂质体中，脂质体具有良好的安全性追踪记录，且可以在cgmp条件下轻松制造。我们的结果表明，与注射游离药物后超声相比，注射含有诸如icg等声敏剂和诸如papc等免疫调节剂的脂质体后超声可以有效抑制肿瘤生长。这些体外和体内结果暗示，声敏剂和超声不仅对肿瘤细胞的生长有直接影响，而且还可以作为通用平台来控制对t细胞的激活至关重要的细胞因子的分泌。由于该平台不需要识别抗原，我们设想它可以用于促进多种类型癌症的t细胞的激活。
[0086]
在一方面，本发明包括诱导il-1β分泌的方法、引发免疫细胞分泌细胞因子的方法、促进t细胞激活的方法、和治疗哺乳类对象肿瘤的方法。这些方法包括(a)向该对象施用声敏剂，(b)向该对象施用免疫调节剂，以及(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0087]
在另一方面，本发明包括诱导il-1β分泌的试剂盒、引发免疫细胞分泌细胞因子的试剂盒、促进t细胞激活的试剂盒、和治疗哺乳类肿瘤的试剂盒，该试剂盒含声敏剂和免疫调节剂。
[0088]
在又另一方面，本发明包括用于诱导il-1β分泌、引发免疫细胞分泌细胞因子、促进t细胞激活、和/或治疗哺乳类肿瘤的药物组合物。
[0089]
在这些方面中的任何一个或多个中，该声敏剂可以包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合。它可以封装在脂质体中和/或与亲脂性部分(例如dope或胆固醇)缀合。
[0090]
在这些方面的任何一个或多个中，该免疫调节剂可以包含lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。在这些方面的任何一个或多个中，该免疫调节剂可以包含cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂(例如，环二核苷酸，诸如cgamp、环二amp和环二gmp)、或其衍生物或组合。它可以封装在脂质体中和/或与亲脂性部分(例如dope或胆固醇)缀合。
[0091]
以治疗有效量向该对象施用声敏剂和/或免疫调节剂。治疗有效量是足以提供医学上期望的结果的声敏剂和/或免疫调节剂剂量。在本发明的方法中，声敏剂和/或免疫调节剂的治疗有效量可以是足以引发免疫细胞分泌细胞因子、促进t细胞激活、诱导分泌il-1β、和/或诱导或促进肿瘤消退的量。
[0092]
用于诱导il-1β分泌、引发免疫细胞分泌细胞因子、促进t细胞激活和/或治疗对象肿瘤的药物组合物包含药学上可接受的载体和声敏剂和/或免疫调节剂(单独或组合)。如上所述，以有效量施用药物制剂。对于治疗应用而言，通常该量足以达到医学上期望的结果。一般而言，治疗有效量是延迟所治疗的特定病症(例如癌症)的发作、抑制其进展、或完全停止该病症所必需的量。例如，有效量通常是用于减轻本文所述的障碍的症状(例如，肿瘤生长等)的量。有效量将取决于施用方式、所治疗的病症和期望的结果。它还将取决于病症的阶段、病症的严重程度、所治疗的对象的年龄和身体状况、同时疗法的性质(如果有的话)、治疗的持续时间、具体的施用途径等在医生的知识和专长范围内的因素。对于预防性
sonicator
tm
系列超声设备(例如sonicator
tm
715、716、740、740x)、mettler electronics sonicators plus
tm
系列超声设备(例如sonicator plus
tm
930、940、992和994)、us pro2000
tm
便携式超声设备、chattanooga inetlect transport
tm
超声装置。可以选择使用的其他合适的超声施加器在本领域技术水平之内。
[0104]
使用非荧光探针检测ros水平，该探针在用ros氧化后变得发荧光。简而言之，用2ml 0.01n naoh(美国新罕布什尔州费希尔科学公司(fisher scientific))预处理乙醇中的0.5ml 1mm dcfh-da(美国密苏里州西格玛公司(sigma))，且在室温下在黑暗中放置30分钟。然后用10ml的25mm磷酸钠缓冲液(美国新罕布什尔州费希尔科学公司)中和水解物，且在冰上保存，直到使用。将最终浓度分别为10ng/ml和20ng/ml的papc和/或吲哚菁绿(indocyanine green，icg)添加到激活的dcfh溶液中，并且进行超声辐照(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2w/cm2)持续不同的时间长度(最多5分钟)。通过酶标仪(plate reader)infinite 200pro(瑞士门内多夫帝肯公司(tecan))在488nm激发和525nm发射下评估荧光信号。
[0105]
体外细胞因子释放
[0106]
将raw 264.7巨噬细胞(美国弗吉尼亚州atcc)以每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与10ng/ml r848(美国密苏里州西格玛公司)和/或20ng/ml icg(美国密苏里州西格玛公司)一起孵育24h。超声照射(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2w/cm2)应用于这些细胞长达5分钟。按照制造商的说明，通过小鼠tnfαduoset elisa(美国明尼苏达州r&d系统公司(r&d systems))分析tnfα分泌。为了测量il-1β的分泌，将永生的骨髓衍生的巨噬细胞或ibmdm(美国马萨诸塞州bch)以每孔20,000个细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与10ng/ml papc(美国阿拉巴马州阿凡提公司(avanti))和/或20ng/ml icg一起孵育24h。超声照射(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2w/cm2)应用于这些细胞长达5分钟。按照制造商的说明，通过小鼠il-1βelisa(美国加利福尼亚州英杰公司(invitrogen))分析il-1β分泌。在一些实验中，在用超声处理之前，将细胞也用0.5、1或2mm的ros清除剂n-乙酰半胱氨酸(美国密苏里州西格玛公司)处理。
[0107]
共培养测定
[0108]
将raw 264.7巨噬细胞以每个插入式培养皿(insert)200,000个细胞的密度接种在transwell插入式培养皿(美国纽约州康宁公司(corning))中，且将ct26(美国弗吉尼亚州atcc)以每孔200,000个细胞的密度接种在下部隔室中，隔室由多孔膜隔开(孔面积：0.3cm2，插入式培养皿尺寸：6.5mm)。将细胞与10ng/ml r848和/或20ng/ml icg一起孵育24h。超声照射(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2w/cm2)进行5分钟。按照制造商的说明，在不存在或存在超声的情况下，通过xtt细胞增殖测定试剂盒(美国弗吉尼亚州atcc)测定用不同配制品处理后肿瘤细胞的活力。
[0109]
脂质体配制品的制备
[0110]
将适量的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(美国阿拉巴马州阿凡提公司)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](美国阿拉巴马州阿凡提公司)和胆固醇(美国密苏里州西格玛公司)溶解于0.5ml乙醇中，缓慢添加至5ml水性缓冲液中，且在60℃下孵育10分钟。使用挤出机(美国阿拉巴马州阿凡提公司)通过100nm聚碳酸酯膜挤出脂质悬浮液以获得空白脂质体。通过在4℃下透析过夜去除乙醇。
[0111]
在本实验中使用上述脂质体的同时，也可以使用其他脂质。用于脂质体制剂的脂质可包括蛋磷脂酰胆碱(pc)、蛋磷脂酰甘油(pg)、大豆磷脂酰胆碱(pc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、大豆磷脂酰甘油(pg)、脑磷脂酰丝氨酸(ps)、脑鞘磷脂(sm)、二癸酰基磷脂酰胆碱(ddpc)、二瓢儿菜基磷脂酰胆碱(depc)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dlpc)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(pmpc)、棕榈酰硬脂酰基磷脂酰胆碱(pspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二月桂酰基磷脂酰甘油(dlpg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(dmpg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(popg)、二肉豆蔻酰基磷脂酸(dmpa)、二棕榈酰磷脂酸(dppa)、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dmps)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(dpps)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、二棕榈酰鞘磷脂(dpsm)、二硬脂酰鞘磷脂(dssm)、或其组合。
[0112]
可从吉博科公司(gibco brl)商购获得脂质体，例如，lipofectin
tm
和lipofectace
tm
，它们由阳离子脂质(诸如n-[1-(2,3二乙氧基)-丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)和二甲基十八烷基溴化铵(ddab))形成。制备脂质体的方法在本领域是众所周知的，且已在许多出版物中描述。gregoriadis,g.在trends in biotechnology[生物技术趋势],第3版,第235-241页(1985)中也对脂质体进行了评论。
[0113]
为了在脂质体中负载声敏剂，首先将icg与脂质尾部(诸如dope)缀合，然后在室温下与预制空白脂质体一起孵育30分钟。使用pd-10柱(ge医疗集团(ge healthcare))去除未负载的icg。
[0114]
在一些实施例中，ros产生的声敏剂包含卟啉、菁(例如，吲哚菁绿(icg))、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该声敏剂与脂质尾部(例如，dope或胆固醇或任何其他亲脂性部分)缀合以提高脂质体中的负载效率。
[0115]
为了在脂质体中负载papc(美国阿拉巴马州阿凡提公司)，在室温下将适量的在dmso储备溶液中的papc与含有icg的脂质体一起孵育30分钟，且不经进一步纯化使用所得配制品。为了在脂质体中负载r848(美国密苏里州西格玛公司)，首先在250mm硫酸铵中制备空白脂质体，并通过在4℃下过夜透析将外部硫酸铵交换为10％蔗糖，然后在55℃下与r848一起孵育30分钟，且通过在4℃下过夜透析去除未负载的r848。
[0116]
在一些实施例中，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特
(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting、r848(雷西莫特)、papc、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting、r848(雷西莫特)、papc、或其衍生物或组合。在一些实施例中，该免疫调节剂与脂质尾部(例如，dope或胆固醇或任何其他亲脂性部分)缀合以提高脂质体中的负载效率。
[0117]
脂质体的表征
[0118]
为了测量脂质体的尺寸，将10ul脂质体用pbs稀释至2ml且用泽塔粒度仪(zeta sizer)测量尺寸。为了测量icg的量，在10ul脂质体中加入190ul dmso，且在ex＝780nm、em＝810nm下测量荧光。
[0119]
药代动力学和生物分布研究
[0120]
将c57bl/6小鼠静脉内注射游离icg或lipo-icg(脂质体封装的icg)。在预定的时间点(注射后0.25、1、3、7和24小时)，通过下颌下出血在microvette 500z-凝胶管中收集50ul血液且保存在冰上。将样本在室温下以10,000g离心5分钟，并用pbs将10ul血清稀释至100ul，且在ex＝780、em＝810nm下测量荧光强度。
[0121]
为了研究lipo-icg的生物分布概况，将动物静脉内注射30ug/剂量的游离icg或lipo-icg，且使用xtreme荧光成像系统在指定时间点(注射后3、24、48和72小时)对动物进行成像。
[0122]
治疗研究
[0123]
在第0天，将balb/c小鼠在右肋皮下接种2
×
105个ct26细胞/小鼠，且在第10天，静脉内注射指定配制品。在一些实验中，超声(频率：1mhz；占空比；50％；功率：2-2.5w/cm2)在第11天应用于指定动物组。在一些实验中，原发性肿瘤被消除的动物在指定的天数在左肋用相同的肿瘤细胞再次激发。按3次/周测量肿瘤体积，且使用以下公式计算体积：体积＝0.52
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长
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宽2。当肿瘤直径达到15mm或有活动性溃疡时，对动物实施安乐死。
[0124]
统计分析
[0125]
所有统计分析均采用graphpad prism 7(美国加利福尼亚州graphpad公司)进行。所有数据均采用单因素或双因素anova检验进行分析，以确定各组间均值的统计差异，随后进行推荐的多重比较检验。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
[0126]
结果
[0127]
使用声敏剂和超声产生ros
[0128]
我们首先建立了使用声敏剂icg和超声产生ros的方法，该方法在临床环境中具有良好记录的安全性概况。使用探针检测ros水平，该探针在用ros氧化后变得发荧光。单独的免疫调节剂或声敏剂诱导ros的背景水平(图2)。有趣的是，与单独的免疫调节剂或声敏剂相比，单独的超声诱导的ros水平略高。这是因为环境中的分子，包括用于检测ros水平的探针，可能会在激发电子返回基态时吸收超声能量且产生ros，从而导致ros探针的氧化。虽然
单独的超声诱导了一些ros，但效率显著低于声敏剂和超声的组合，该组合在相同的超声条件下诱导的ros超出了2.5倍。此外，ros的产生高度依赖于超声参数，诸如超声时间，且随着超声时间越长，诱导的ros水平更高。这些结果表明，声敏剂/超声的组合(而不是单独的声敏剂或超声)是一种很有希望的方法，以高度可控的方式产生ros，用于治疗应用。
[0129]
细胞因子释放
[0130]
为了了解超声和声敏剂产生的诱导型ros是否可用于与免疫调节剂协同作用，我们首先测量了用tlr7/8激动剂r848、icg、超声、或其组合处理这些细胞后，raw264.7巨噬细胞释放的细胞因子tnfα。与无处理对照相比，单独的r848、icg或超声不会诱导显著的tnfα释放(图3a)。令人惊讶的是，当它们组合在一起时，巨噬细胞分泌的tnfα水平超出了7倍。此外，从该组合中去除任何组分(r848、icg或超声)显著损害巨噬细胞的激活，如tnfα释放降低所示。我们还发现tnfα的释放依赖于超声时间，且随着超声时间的延长，诱导的tnfα水平增加(图3b)。
[0131]
我们还测试了诱导型ros对其他免疫调节剂(诸如papc)的影响。选择从ibmdm释放il-1β作为评估先天免疫细胞激活的标志物。单独的papc、icg或超声不诱导任何可检测水平的il-1β。引人注目的是，papc、icg和超声的组合诱导高水平的il-1β，且来自该组合的任何组分的消耗都会完全消除释放的il-1β(图4a)。我们还发现il-1β的释放依赖于超声时间，且随着超声时间的延长，诱导的il-1β水平会升高(图4b)。综上所述，这些结果表明巨噬细胞激活(如tnfα或il-1β的分泌所示)高度依赖于组合物，且可以通过改变超声参数来调节。
[0132]
为了证实ros是否是触发免疫细胞激活的主要因素，我们使用ros清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)从接受papc icg us的组合的组中消耗ros。如il-1β的nac剂量依赖性减少所示，ros的消耗显著损害ibmdm的激活(图5a)。为了了解il-1β的减少是否是由于ros清除剂的毒性，我们测量了接受papc icg us加不同浓度ros清除剂的ibmdm的活力。在不存在或存在ros清除剂的情况下，在用papc icg us处理后，ibmdm具有类似的活力(图5b)。这些结果表明，超声产生的诱导型ros是与免疫调节剂协同诱导细胞因子分泌的主要因素。
[0133]
体外肿瘤细胞杀伤作用
[0134]
为了评估不同组合对癌细胞活力的影响，使用transwell系统将巨噬细胞与ct26癌细胞共培养(图6a)，随后使用指定组合物进行处理。单独的r848、icg或超声只能使ct26细胞活力中等降低，但所有三种组分的组合使该活力显著降低至低于50％。从该组合中去除任何组分也显著损害癌细胞的杀伤。有趣的是，我们发现从接受组合疗法的组中去除巨噬细胞也显著损害了肿瘤杀伤作用，表明巨噬细胞的激活也可有助于杀死癌细胞(图6b)。这并不令人惊讶，因为已知巨噬细胞释放的细胞因子(诸如tnfα)具有肿瘤杀伤作用。
[0135]
脂质体的制备
[0136]
已经显示诱导型ros可以与免疫调节剂协同作用，且诱导细胞因子的分泌，这些细胞因子对适应性免疫反应至关重要，因此我们试图评估它们在肿瘤治疗中的潜力。然而，声敏剂和免疫调节剂是小分子，其可在体内迅速消除，且在感兴趣的组织中不易同时获得。这促使我们改进声敏剂和免疫调节剂的药代动力学概况和共定位。为了实现这一点，我们选择使用脂质体，这是一种类型的基于脂质的囊泡，且在体内递送声敏剂和免疫调节剂方面具有良好安全性和生物相容性的追踪记录。
[0137]
空白脂质体是通过在60℃下将脂质的乙醇溶液与选定的水相混合，随后通过100nm聚碳酸酯膜以产生均质脂质体来制备的(图7)。为了制备含有免疫调节剂r848和声敏剂icg的脂质体(图8a和图8b)，首先使用主动负载方案将r848负载到脂质体中，并且负载效率超过80％，显著高于使用被动负载方案实现的约10％。为了在脂质体中有效地负载声敏剂，首先将其与脂质尾部缀合，之后在室温下与预制脂质体一起孵育。脂质缀合声敏剂的负载效率超过95％，而无脂质声敏剂的负载效率少于20％。此外，由于声敏剂的负载过程与脂质体的制备(其需要相对较高的温度(60℃))分离，因此我们能够保护声敏剂不暴露于热，且最小化其活性损失。为了制备含有免疫调节剂papc和声敏剂icg的脂质体(图8c和图8d)，首先将脂质缀合icg与预制脂质体一起孵育，负载效率超过95％。然后将papc与获得的lipo-icg一起孵育以获得lipo-papc/icg。
[0138]
药代动力学和生物分布研究
[0139]
为了研究游离药物与脂质体配制品的药代动力学，将c57bl/6小鼠静脉内注射游离icg或lipo-icg，且使用酶标仪测量注射后不同时间点的icg浓度。注射后几分钟内未能检测到游离icg。相比之下，脂质体icg展现出显著更长的循环时间(图9)和显著更大的曲线下面积(auc)。
[0140]
在荷瘤小鼠中静脉内注射icg或lipo-icg后，使用荧光成像评估icg随时间的生物分布(图10c)。肿瘤中的荧光定量揭示了lipo-icg在肿瘤内递送icg方面的能力优于icg的非脂质体配制品(图10d)。
[0141]
治疗研究
[0142]
为了评估治疗功效，将ct26荷瘤小鼠在接种肿瘤细胞后第10天静脉内注射r848 icg的物理混合物或含有r848和icg的脂质体(lipo-r848/icg)，然后在第11天进行超声治疗。虽然游离r848 icg us仅显示出边缘肿瘤生长抑制，但与无治疗对照和r848 icg us相比，lipo-r848/icg具有显著更好的肿瘤生长抑制(图10a)。类似地，仅papc icg us对肿瘤生长的影响最小，但与无治疗和papc icg us相比，lipo-papc/icg us显示出显著更好的肿瘤生长抑制(图10b)。
[0143]
激活稳健的抗肿瘤免疫反应需要几种信号，包括肿瘤抗原，以及先天免疫细胞(诸如巨噬细胞和树突细胞)的激活，这会导致t细胞反应的进一步激活。我们的结果表明，与激活树突细胞的药剂共同包装的超声与声敏剂的应用为这种协同信号传导奠定了基础。特别地，超声和声敏剂产生的ros可以杀死肿瘤细胞且提供肿瘤抗原。ros还可以通过免疫调节剂协同激活先天免疫细胞(诸如巨噬细胞和树突细胞)，从而产生促进t细胞激活的关键细胞因子。因为只有当所有信号都存在于同一位置时，才会诱导稳健的免疫反应。脂质体确实是一种确保信号都在同一位置的方法。值得注意的是，当信号没有被共定位(在血液中游离施用)时，作用很小。这也与体外发现一致，即所有三种信号都必须存在。这些结果表明，脂质体实现的改善的声敏剂和免疫调节剂的药代动力学概况和共定位递送可增强免疫激活和抗肿瘤功效的协同效应。
[0144]
本领域技术人员可根据需要优化给药方案。参见例如，nair和jacob,j basic clin pharm[基础临床药学杂志]7(2):27-31(2016)。ivis成像可用于监测不同时间点处于自由形式和脂质体形式的声敏剂的生物分布概况。这将有助于确定超声应用的最佳时间范围。超声应用对于引流淋巴结的功效可作为增强抗肿瘤免疫启动的替代或补充靶标进行评
估。静脉内注射时，含有免疫调节剂papc和声敏剂icg的脂质体到达引流淋巴结(dln)。因此，dln作为超声应用的补充靶标，以加强髓样细胞的激活，髓样细胞可以迁移以捕获肿瘤抗原，且引发新的肿瘤特异性ctl。此外，应用超声后dln中巨噬细胞和树突细胞分泌的il-1β细胞因子可作为许可信号，以实现最佳的记忆和效应t细胞功能。这一过程潜在地拓宽了被识别的抗原的范围，赋予新引发的肿瘤特异性ctl最佳的效应和记忆能力，且增加抗肿瘤免疫的效率。在实体肿瘤位于超声频率无法有效到达的深部组织的许多情况下，可替代地应用超声靶向dln。
[0145]
用不同配制品 /-超声治疗荷瘤小鼠后，使用流式细胞术评估肿瘤内免疫反应(图11a)。特别地，在将肿瘤组织消化成单细胞悬浮液后，研究了cd8 和cd4 t细胞的浸润(图11b和11c)。对小鼠进行40天的肿瘤体积和存活率监测(图11d和11e)。在第40天用2
×
105个ct26细胞/小鼠再次激发原发性肿瘤消退的那些小鼠，且再观察40天(图11f和11g)。
[0146]
使用已知方法，技术人员可获得且可使用另外的模型，诸如乳腺癌或黑色素瘤。根据结果，检查点抑制剂可用于一些实验，以显示我们的平台与icb之间的协同作用。
[0147]
虽然本发明已在特定实施例中披露，但本领域技术人员将理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对实施例进行某些替换、改变和/或省略。因此，前述描述仅意为示例性的，且不应限制本发明的范围。本文引用的所有参考文献、科学文章、专利出版物和任何其他文件均针对其披露内容通过引用特此并入。
[0148]
本发明还通过以下列举的实施例来描述。
[0149]
1.一种诱导细胞因子分泌的方法，该方法包括：
[0150]
(a)使哺乳类抗原呈递细胞(apc)与声敏剂和免疫调节剂接触；以及
[0151]
(b)将(a)中的apc暴露于超声辐射持续足以诱导这些apc分泌细胞因子的时间段。
[0152]
2.根据实施例1所述的方法，其中该细胞因子包含il-1β和tnf-α中的一者或两者。
[0153]
3.根据实施例1或实施例2所述的方法，其中这些apc包括巨噬细胞。
[0154]
4.根据实施例1-3中任一项所述的方法，其中这些apc存在于哺乳类对象中。
[0155]
5.根据实施例4所述的方法，其中该哺乳类对象患有肿瘤，且接触和暴露这些apc导致杀死该肿瘤的细胞。
[0156]
6.一种在哺乳类对象中诱导il-1β分泌的方法，该方法包括：
[0157]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0158]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0159]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0160]
7.根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合，任选地其中该声敏剂包含菁。
[0161]
8.根据实施例1-7中任一项所述的方法，其中该声敏剂被封装在脂质体中。
[0162]
9.根据实施例1-8中任一项所述的方法，其中该声敏剂与亲脂性部分缀合。
[0163]
10.根据实施例9所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0164]
11.根据实施例1-10中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合，任选地其中该免疫调节剂包括r848和papc的一者或两者。
[0165]
12.根据实施例1-10中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合，任选其中该免疫调节剂包括r848和papc的一者或两者。
[0166]
13.根据实施例1-12中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0167]
14.根据实施例1-13中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。
[0168]
15.根据实施例14所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0169]
16.一种在哺乳类对象中引发免疫细胞分泌细胞因子的方法，该方法包括：
[0170]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0171]
(b)向该对象施用免疫调节剂，
[0172]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0173]
17.根据实施例15所述的方法，其中该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合。
[0174]
18.根据实施例16或17所述的方法，其中该声敏剂被封装在脂质体中。
[0175]
19.根据实施例16-18中任一项所述的方法，其中该声敏剂与亲脂性部分缀合。
[0176]
20.根据实施例19所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0177]
21.根据实施例16-20中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa
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51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0178]
22.根据实施例16-20中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0179]
23.根据实施例16-22中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0180]
24.根据实施例16-23中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。
[0181]
25.根据实施例24所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0182]
26.一种在哺乳类对象中促进t细胞激活的方法，该方法包括：
[0183]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0184]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0185]
(c)此后，将该对象暴露于超声辐射。
[0186]
27.根据实施例26所述的方法，其中该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、和双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合。
[0187]
28.根据实施例26或27所述的方法，其中该声敏剂被封装在脂质体中。
[0188]
29.根据实施例26-28中任一项所述的方法，其中该声敏剂与亲脂性部分缀合。
[0189]
30.根据实施例29所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0190]
31.根据实施例26-30中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0191]
32.根据实施例31所述的方法，其中该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0192]
33.根据实施例26-32中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0193]
34.根据实施例26-32中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。
[0194]
35.根据实施例34所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0195]
36.一种治疗对象的肿瘤的方法，该方法包括：
[0196]
(a)向该对象施用声敏剂，
[0197]
(b)向该对象施用免疫调节剂，以及
[0198]
(c)此后，将该肿瘤暴露于超声辐射。
[0199]
37.根据实施例36所述的方法，其中该声敏剂包含卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、或双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合。
[0200]
38.根据实施例36或37所述的方法，其中该声敏剂被封装在脂质体中。
[0201]
39.根据实施例36-38中任一项所述的方法，其中该声敏剂与亲脂性部分缀合。
[0202]
40.根据实施例39所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0203]
41.根据实施例36-40中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0204]
42.根据实施例36-40中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0205]
43.根据实施例36-42中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0206]
44.根据实施例36-43中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂与亲脂性部分缀合。
[0207]
45.根据实施例44所述的方法，其中该亲脂性部分是dope或胆固醇。
[0208]
46.根据实施例1-45中任一项所述的方法，其中哺乳类细胞是人细胞且该哺乳类对象是人。
[0209]
47.根据实施例1-46中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包含papc。
[0210]
48.根据实施例1-47中任一项所述的方法，其中该免疫调节剂包含r848。
[0211]
49.根据实施例1-48中任一项所述的方法，其中该声敏剂是菁。
[0212]
50.根据实施例49所述的方法，其中该声敏剂是吲哚菁绿。
[0213]
51.一种用于在哺乳类中诱导促进t细胞激活的细胞因子分泌的试剂盒，该试剂盒包含：
[0214]
(a)声敏剂，该声敏剂包括卟啉、菁、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、和双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合；以及
[0215]
(b)免疫调节剂，该免疫调节剂包括lps、mpl、r848、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0216]
52.根据实施例51所述的试剂盒，其中该免疫调节剂包括cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、papc、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂，或其组合。
[0217]
53.根据实施例51或52所述的试剂盒，其中该声敏剂或该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0218]
54.根据实施例53所述的试剂盒，其中该声敏剂和该免疫调节剂都被封装在相同或不同的脂质体中。
[0219]
55.根据实施例51-54中任一项所述的试剂盒，其中该声敏剂、免疫调节剂或两者与一个或多个亲脂性部分缀合。
[0220]
56.根据实施例55所述的试剂盒，其中这些亲脂性部分选自dope或胆固醇。
[0221]
57.根据实施例51-56中任一项所述的试剂盒，其中该免疫调节剂包含papc。
[0222]
58.根据实施例51-57中任一项所述的试剂盒，其中该免疫调节剂包含r848。
[0223]
59.根据实施例51-58中任一项所述的试剂盒，其中该声敏剂是菁。
[0224]
60.根据实施例59所述的试剂盒，其中该声敏剂是吲哚菁绿。
[0225]
61.一种对对象进行胃肠外施用的药物组合物，该组合物包含：
[0226]
(a)声敏剂，该声敏剂包括菁、卟啉、份菁、酞菁、萘酞菁、三苯基甲川、吡喃鎓染料、硫代吡喃鎓染料、方酸菁染料、克酮酸菁染料、薁菁染料、吲哚苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮、邻苯二甲酰吖啶酮、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内
或分子间电荷转移染料或染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫纶)复合物、双(苯-二硫醇盐)复合物、碘苯胺染料、双(s,o-二硫纶)复合物、或其组合；以及
[0227]
(b)免疫调节剂，该免疫调节剂包括papc、r848、lps、mpl、r837、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、雷西莫特(r848)、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合；以及
[0228]
(c)药学上可接受的载体。
[0229]
62.根据实施例61所述的药物组合物，其中该免疫调节剂包括papc、雷西莫特(r848)、cpg、聚ic、聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、imufact imp321、is patch、iss、iscomatrix、juv immune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a(mpla)、蒙塔尼德ims 1312、蒙塔尼德isa 206、蒙塔尼德isa 50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、运载体系统、咪喹莫特、嘎德莫特、3m-052、srl172、β-葡聚糖、pam3cys、aquila's qs21刺激子、瓦迪美占、asa404(dmxaa)、sting激动剂、或其组合。
[0230]
63.根据实施例61或62所述的药物组合物，其中该声敏剂或该免疫调节剂被封装在脂质体中。
[0231]
64.根据实施例61-63中任一项所述的药物组合物，其中该声敏剂和该免疫调节剂都被封装在相同或不同的脂质体中。
[0232]
65.根据实施例61-64中任一项所述的药物组合物，其中该声敏剂、免疫调节剂或两者与一个或多个亲脂性部分缀合。
[0233]
66.根据实施例65所述的药物组合物，其中这些亲脂性部分选自dope或胆固醇。
[0234]
67.根据实施例61-66中任一项所述的药物组合物，其中该免疫调节剂包含papc。
[0235]
68.根据实施例61-67中任一项所述的药物组合物，其中该免疫调节剂包含r848。
[0236]
69.根据实施例61-68中任一项所述的药物组合物，其中该声敏剂是菁。
[0237]
70.根据实施例69所述的药物组合物，其中该声敏剂是吲哚菁绿。