一种以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法与流程

1.本发明涉及微生物培养技术领域，特别是涉及一种以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法。


背景技术：

2.肠杆菌是自然界中普遍存在的环境致病菌，可引起人和动物多种不同程度的感染。奶牛乳房炎病因复杂多样，病原菌感染是奶牛乳房炎发生的主要生物诱因，其中大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要环境致病菌。clermont等最先通过三重pcr的方式简单快速的对大肠杆菌进行种系发育分型，此方法以具有进化特征的基因chua、yjaa和tspe4.c2为目的基因进行pcr试验，再按不同基因姐合方式进行分型。从系统发育角度可将大肠杆菌分为4种主要类型，即a、b1、b2和d型。其中，a型多为环境共生菌，在奶牛乳房炎病料中分离率较高。
3.鉴于a型大肠杆菌在自然界中的来源广泛，如果将a型大肠杆菌投入奶牛乳房炎的相关应用中必将有着巨大的优势和优点。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有中调控奶牛乳腺上皮细胞中免疫作用的方法中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明其中一个目的是，克服现有产品的不足，提供一种以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法。
7.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法，其包括如下步骤：
8.细胞培养：奶牛乳腺上皮细胞使用培养基进行培养，得到培养后的奶牛乳腺上皮细胞；
9.细胞处理：将奶牛乳腺上皮细胞培养中途更换含有特定微生物的培养基将进行培养。
10.作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞培养中，所述培养基为rm[i1640培养基。
[0011]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞培养中，所述完全培养基成分为比例90％的培养基和10％的胎牛血清。
[0012]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞培养中，培养的温度为37℃，co2浓度为5％。
[0013]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，待细胞培养至70％时，更换培养基。
[0014]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，所述特定微生物包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
[0015]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，所述特定微生物包括野生a型大肠杆菌、野生b1型大肠杆菌、标准大肠杆菌atcc25922、标准金黄色葡萄球菌atcc25923。
[0016]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，所述特定微生物为野生a型大肠杆菌。
[0017]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，特定微生物在培养基中的浓度为1x107cfu/ml。
[0018]
作为本发明所述以大肠杆菌在奶牛乳腺上皮细胞中调控免疫作用的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，更换特定微生物后培养的时间为3h。
[0019]
研究发现，大肠杆菌可激活奶牛乳腺上皮细胞中发挥炎症反应功能30％的基因，多于乳腺组织感染后的基因表达变化，证明奶牛乳腺上皮细胞具有强的免疫能力，可准确反应奶牛乳腺炎感染后的病理变化，作为奶牛乳腺炎体外研究的重要模型。目前临床分离的a型大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的诱导作用模型尚未见报道。本研究就牧场分离的野生a型大肠杆菌诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应构建模型进行探讨。
[0020]
本专利利用的临床分离野生a型大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞进行诱导反应，并构建炎症模型。为此，根据研究需要，进行相关实验，包括流式细胞凋亡实验、edu细胞增殖实验、蔡司场发射扫描电镜实验、荧光定量pcr实验等。最终证明，野生分离a型大肠杆菌在浓度为1*107cfu/ml时可诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应，炎症模型构建成功。
[0021]
本发明达到了如下的有益效果：
[0022]
1)本发明首次证明了野生a型大肠杆菌诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的应用。相比于现有关于乳腺上皮细胞炎症反应模型构建的研究，本发明从细胞层面证明了临床分离的野生型大肠杆菌对奶牛乳腺上皮细胞的免疫调控作用，并且提高了细胞炎症因子的基因表达量，细胞增殖量降低，细胞正常形态破坏，因而具有更高的准确性和可信度。
[0023]
2)本发明证明了野生分离a型大肠杆菌在浓度为1*107cfu/ml时可诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应，炎症模型构建成功。流式细胞仪检测细胞凋亡率升高、免疫因子的基因表达量增加，因而具有更高的可行性。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0025]
图1为野生a型大肠杆菌、野生b1型大肠杆菌、标准大肠杆菌atcc25922、标准金黄色葡萄球菌atcc25923处理奶牛乳腺上皮细胞后的流式细胞仪检测细胞凋亡率结果；
[0026]
图2是野生a型大肠杆菌感染牛乳腺上皮细胞的edu细胞增殖结果；
[0027]
图3是野生a型大肠杆菌感染牛乳腺上皮细胞后的细胞扫描电镜结果；
[0028]
图4是野生a型大肠杆菌感染牛乳腺上皮细胞il1β、tnfα基因荧光定量pcr结果。
具体实施方式
[0029]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0030]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0031]
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术人员能够实施为准，制定了以下实施例。
[0032]
实施例1
[0033]
本实施例对于野生a型大肠杆菌、野生b1型大肠杆菌、标准大肠杆菌atcc25922、标准金黄色葡萄球菌atcc25923分别感染奶牛乳腺上皮细胞进行效果筛选，包括：
[0034]
(1)细胞培养：奶牛乳腺上皮细胞使用rmpi 1640培养基，完全培养基成分比例为90％培养基和10％胎牛血清，37℃培养，co2浓度为5％，六孔板中每孔培养基体积为2ml，细胞初始数量约为5
×
103个/ml。
[0035]
(2)细胞处理：奶牛乳腺上皮细胞分为5组，第1组为对照组，2-5组为处理组。六孔板培养细胞，待细胞培养至70％时，处理组2、3、4、5分别更换为野生a型大肠杆菌、野生b1型大肠杆菌、标准大肠杆菌atcc25922、标准金黄色葡萄球菌atcc25923，浓度均为1x 107cfu/ml的培养基，分别继续培养3小时。
[0036]
(3)样品制备：3小时后，弃去培养基，并用pbs缓冲液清洗2遍，每个孔加入2ml胰蛋白酶，经胰蛋白酶消化后低速离心，收集细胞，细胞个数约为5
×
105个/ml。用100μl 1
×
binding buffer缓冲液重悬细胞；加5μl annexin v和5μl pi，室温避光20分钟；加500μl缓冲液上机检测。
[0037]
(4)图像分析：annexin v-fitc和pi是细胞凋亡检测最常用的染色剂，这两种荧光素都能被波长为488nm的激光器激发，信号接收通道分别为第一通道(fitc)和第三通道(ecd)，因此凋亡检测方案第一张图为fsc/ssc，将细胞群体全部圈中，第2张图为第一通道和第三通道的散点图，即可分析细胞群体中各凋亡时期所占的比例，结果如图1所示，野生a型大肠杆菌处理后的奶牛乳腺上皮细胞早期凋亡率(q1-ur)和晚期凋亡率(q1-lr)增加。说明野生a型大肠杆菌可诱发奶牛乳腺上皮细胞的凋亡，造成细胞的损伤。通过流式细胞仪对各组细胞进行细胞凋亡检测，结果如图1所示，野生a型大肠杆菌的处理效果优于其它处理方式。
[0038]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
[0039]
实施例2
[0040]
本实施例中，用edu试剂盒对细胞进行处理，并用免疫荧光显微镜观察细胞增殖情况。
[0041]
(1)细胞培养：同实施例1。
[0042]
(2)样品制备：1)用实施例1中的完全细胞培养基按1000：1的比例稀释edu溶液(试剂a)，制备适量50μm edu培养基；每孔加入100μl 50μm edu培养基孵育2小时，弃掉培养基；pbs清洗细胞2次，每次5分钟。2)每孔加入50μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟，弃固定液；每孔加入50μl 2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μl pbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs；每孔加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床孵育10分钟；pbs清洗1次，5分钟。3)每孔加入100μl的1x 染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。4)用去离子水按100：1的比例稀释试剂hoechst33342反应液，制备适量1x hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μl 1x hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μl pbs清洗3次。
[0043]
(3)图像观察：染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要》1s。结果如图2所示，浓度为1*107cfu/ml野生a型大肠杆菌处理后的奶牛乳腺上皮细胞增殖量明显降低，说明野生a型大肠杆菌能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖。
[0044]
实施例3
[0045]
本实施例中，利用geminisem 300蔡司场发射扫描电镜观察大肠杆菌处理后细胞的形貌变化。
[0046]
(1)细胞培养：同实施例1(1)。
[0047]
(2)细胞爬片制备：细胞培养至70％，使用2ml胰酶消化细胞后计数并重悬细胞于实施例1中的完全细胞培养中。根据爬片大小选择合适的细胞密度种入爬片。待细胞贴壁后，实验组去除多余完全培养基，更换为a型大肠杆菌浓度为1*107cfu/ml的培养基继续培养3个小时。滴加2.5％戊二醛前至完全没过爬片，4℃过夜进行前固定。
[0048]
(3)样品漂洗：0.1m pbs或双蒸水清洗4次。用1％oso4进行后固定，再用0.1m pbs或双蒸水清洗3-4次。每次清洗15min，4℃进行。
[0049]
(4)样品脱水：梯度浓度乙醇脱水(30％
→
50％
→
70％
→
80％
→
90％
→
95％
→
100％
→
100％无水硫酸钠)，更换液体时不能触及样品，每步骤停留15min，。
[0050]
(5)样品导电与形貌观察：样品经cdp-300型临界点干燥仪干燥后，将样品待观察面朝上，粘贴到样品台上，用scd 500型离子溅射仪内对样品表面喷镀黄金，并在一天内利用geminisem 300蔡司场发射扫描电镜进行细胞形貌观察。结果如图3所示，野生a型大肠杆菌处理后的奶牛乳腺上皮细胞形态发生明显变化，细胞凋亡裂解。与正常生长的细胞相比，野生a型大肠杆菌处理后的细胞表面吞噬体活性受到损伤。
[0051]
实施例5
[0052]
本实施例中，通过荧光定量pcr检测野生a型大肠杆菌处理后的细胞il-1β和tnfα基因表达量变化。
[0053]
(1)细胞培养：同实施例2。
[0054]
(2)rna提取：30h后，弃去培养基，并用pbs缓冲液洗涤2次，每个孔加入1mltrnzol,充分吹打后收集与冻存管中。将裂解的细胞转移到新的ep管中，每管加入200ul氯仿(每1mltrnzol加入0.2ml氯仿)，剧烈摇晃15s，室温静置5min，于4℃、12000r离心15min。轻轻取出，吸取上清液并转移到新的ep管中，加入500ml异丙醇(约等于上清体积)，轻轻上下颠倒混匀，于4℃、12000r离心10min。缓慢弃去上清，管底会有白色沉淀生成。每管加入1ml75％乙醇洗涤，于4℃、7500r离心5min，弃去上清，并重复上步操作。室温晾干5min，加入20ul去离子水，反复吹打，充分溶解rna。利用分光光度计检测rna浓度和od值(od值范围在1.9-2.0最佳)。
[0055]
(3)引物设计：使用il1β、tnfα基因引物的核苷酸序列如下：
[0056]
il1β上游引物为：5
’‑
attctctccagccaaccttcatt-3’；
[0057]
il1β下游引物为：5
’‑
ttctcgtcactgtagtaagccatca-3’[0058]
tnfα上游引物为：5
’‑
tctcaagcctcaagtaacaagcc-3’；
[0059]
tnfα下游引物为：5
’‑
ccatgagggcattggcatac-3’[0060]
(4)反转录：1)基因组dna去除，加入4
×
gdna wiper mix 4ul，将rna浓度调整至1ug/ul，od值经检测为1.93，加入模板rna 1ul，加入rnase free ddh2o至16ul。用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。1)配制逆转录反应体系，在1)反应管中直接加入5
×
no rt control mix 4ul，用移液器轻轻吹打混匀，50℃15min，85℃2min。
[0061]
(5)qrcr：配制如下混合液：2
×
aceq qpcr sybr green master mix 10.0ul，primer1(10um)0.4ul，primer2(10um)0.4ul，50
×
rox rererence dye2 0.4ul，cdna 0.2ul，ddh2o 8.8ul。扩增程序为：预变性：95℃5min；循环反应：95℃10s,60℃30s,40个循环；融解曲线：95℃15s,60℃60s,95℃15s。结果如图4所示，野生a型大肠杆菌处理后的奶牛乳腺上皮细胞炎症基因il1β、tnfα表达量显著上调，分别为2.17和1.95倍。