抗菌肽LI7、其重复多肽LI14、LI21及其衍生物和应用的制作方法

抗菌肽li7、其重复多肽li14、li21及其衍生物和应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及抗菌肽li7、其重复多肽li14、li21及其衍生物和应用，尤其涉及抗菌肽li14在相关细菌引起的感染性疾病中的应用。
2.背景内容
3.抗生素在现代医学中起到了举足轻重的作用，其对细菌性疾病的良好治疗效果挽救了无数生命。然而，近年来抗生素的大规模和不合理使用导致了细菌耐药性的大量产生、扩散和传播，这给人类的安全和畜禽养殖业的健康发展造成了巨大的威胁。迫切需要新型的抗菌策略去应对日益严重的抗生素危机。抗菌肽又被称为宿主防御肽，通常可以保护机体免受病原菌的侵害。抗菌肽来源广泛，分为自然抗菌肽和合成抗菌肽，自然抗菌肽通常来源于人类，动物，植物，环境，微生物，合成抗菌肽通常根据氨基酸的疏水性，电荷分布情况以及肽链长度等因素，可以用抗菌肽数据库过滤技术筛选出有抗菌活性的抗菌肽；此外，抗菌肽还具有多种功能，如免疫调节活性，抗菌，抗真菌，抗病毒，抗肿瘤等功能，并且，抗菌肽具有独特的作用靶点，抗菌肽通常以细胞膜为作用靶点，以不同的方式破坏细菌膜，导致胞质内容物外流，最终裂解细菌。一部分抗菌肽进入细胞内，作用于胞内特定的靶点，进而抑制核酸或蛋白质的合成，进而影响细菌的生物学功能，达到杀灭病原菌的目的。抗菌肽的独特作用靶点导致抗菌肽具有不易产生耐药性的优点，这一特点进一步为抗菌肽成为抗生素候选物奠定了坚实的基础。
4.虽然近年来小分子肽类化合物，因其良好的抗菌活性，独特的抗菌机制，受到越来越多的关注，但是，依然有很多因素制约其大批量的进入临床使用，比如筛选合成方法较为落后，合成成本高，稳定性差，具有非特异性毒副作用，以及部分抗菌肽体外具有较好的活性，但缺乏体内有效性等，因此，迫切需要设计和开发更加安全高效稳定的肽类抗生素去治疗多重耐药菌引起的感染性疾病。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供具有较强抗菌活性的小分子肽类化合物，以对抗日益严重的多重耐药菌感染。本发明根据抗菌肽数据库，利用抗菌肽数据库过滤技术进行筛选，每一步骤设置一个参数，比如氨基酸出现的频率，氨基酸疏水性，带电荷情况以及二级结构等，最终筛选出目标基序li7(lkklcri-nh2)，之后考虑到肽链长度过短，可能会影响到多肽二级结构的形成，进而影响多肽功能的发挥，因此，分别将li7进行一个和两个重复，设计出li14((lkklcri)
2-nh2)，li21((lkklcri)
3-nh2)以及用丙氨酸对li14进行逐个氨基酸取代的方法得到了一系列li14的衍生物；之后采用固相化学合成法合成，合成方向从c端到n端逐一进行，最终发现抗菌肽li14抗菌效果最为显著。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了抗菌肽li14在生物体内外的抗菌活性以及与不同种类抗生素的协同活性。
7.本发明最后还要解决的技术问题是提供了抗菌肽li14在制备细菌感染性疾病的药物中的应用。
8.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了抗菌肽li7，所述抗菌肽li7的氨基酸序列为：亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸，所述抗菌肽li7分子量为873.17，等电点为10.06。
9.本发明内容还包括抗菌肽li14，所述抗菌肽li14氨基酸序列为：亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸。所述抗菌肽li14为α-螺旋结构，分子量为1728.32，等电点为10.48。1.本发明内容还包括抗菌肽li21，所述抗菌肽li21氨基酸序列为：亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-异亮氨酸。所述li21为α-螺旋结构，分子量为2583.47，等电点为10.66。
10.其中，所述的抗菌肽li14的化学结构式如式1所示：
[0011][0012]
本发明内容还包括抗菌肽li14的衍生物，包括li14(s-s)、li14-a1、li14-a2、li14-a3、li14-a4、li14-a5、li14-a6、li14-a7、li14-a8、li14-a9、li14-a
10
、li14-a
11
、li14-a
12
、li14-a
13
或li14-a
14
。
[0013]
其中，所述li14(s-s)为li14中引入二硫键得到的；所述li14-a1为li14的第一位的亮氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a2为li14的第二位的赖氨酸被丙氨酸取代得到的；所述li14-a3为li14的第三位的赖氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a4为li14的第四位的亮氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a5为li14的第五位的半胱氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a6为li14的第六位的精氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a7为li14的第七位的异亮氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a8为li14的第八位的亮氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a9为li14的第九位的赖氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a
10
为li14的第十位的赖氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a
11
为li14的第十一位的亮氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a
12
为li14的第十二位的半胱氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a
13
为li14的第十三位的精氨酸被丙氨酸取代得到；所述li14-a
14
为li14的第十四位的异亮氨酸被丙氨酸取代得到。
[0014]
本发明内容还包括所述的抗菌肽li7、所述的抗菌肽li14、所述的抗菌肽li21、所述的抗菌肽li14的衍生物在制备相关具有生物体内免疫调节活性产品或药物中的应用。
[0015]
本发明内容还包括所述的抗菌肽li7、所述的抗菌肽li14、所述的抗菌肽li21、所述的抗菌肽li14的衍生物在制备预防和/或治疗细菌、真菌或病毒引起的疾病的产品中的应用。
[0016]
本发明内容还包括所述的抗菌肽li7、所述的抗菌肽li14、所述的抗菌肽li21、所
述的抗菌肽li14的衍生物与不同种类抗生素组合物在制备细菌感染性疾病的药物中的应用。
[0017]
其中，所述生物指畜禽。
[0018]
其中，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
[0019]
有益效果：对于现阶段耐药性问题日益严重的局面，本发明提供了一种体内外均有较强抑菌及杀菌活性的的抗菌肽，并系统评价了体内外有效性，稳定性以及安全性，有助于开发出一类对抗多重耐药菌的新型抗生素候选物，缓解危害日趋严重的多重耐药菌(mdr)问题。本发明体内外研究共同表明li14对多种革兰氏阳性和阴性菌及其耐药菌都有很好的抗菌效果，其中对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度为4μg/ml。同时，li14对不同代谢状态的细菌，包括生物膜和持留菌都具有很好的杀菌活性。协同抗菌活性表明li14与不同种类的抗生素具有显著的协同抗菌活性。体内外安全性表明在测试剂量以下li14没有任何毒副作用。大蜡螟感染实验表明li14可以显著提高大蜡螟的存活率；大鼠皮肤伤口感染实验表明li14可以有效地促进伤口的愈合。以上研究表明抗菌肽li系列化合物是极具潜力的新型抗生素候选物。
附图说明
[0020]
图1、为抗菌肽li14的时间杀菌曲线，抗菌肽li14的浓度分别为256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0μg/ml，富含营养的mhb肉汤，不含营养的磷酸盐缓冲液。
[0021]
图2、为抗生物膜及持留菌实验，可知抗菌肽li14可以抑制生物膜的形成，清除已经形成的生物膜，杀死持留菌。
[0022]
图3、为抗菌肽li14在小鼠体内的急性毒性实验。可知抗菌肽li14在测试剂量下不存在毒副作用。
[0023]
图4、为抗菌肽li14治疗大蜡螟幼虫细菌感染，可知抗菌肽li14可以显著提高大蜡螟的存活率。
[0024]
图5、为抗菌肽li14治疗大鼠皮肤伤口细菌感染，可知抗菌肽li14可以促进伤口的愈合。
具体实施方式
[0025]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0026]
cd-1雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0027]
mhb肉汤培养基为含牛肉粉1.5g/l、可溶性淀粉1.5g/l和酸水解酪蛋白17.5g/l的水溶液。
[0028]
实施例1抗菌肽li7、li14、li21及li14衍生物的设计
[0029]
利用抗菌肽数据库过滤技术进行目标基序的筛选。在抗菌肽数据库中每一步骤设置一个参数，比如氨基酸出现的频率，氨基酸疏水性，氨基酸带电荷情况，结构类型等，最终筛选出目标基序lkklcri-nh2(li7)，之后考虑到肽链长度过短会影响到肽链二级结构的形
成，因此，对抗菌肽li7进行一个和两个序列重复，分别得到抗菌肽li14((lkklcri)
2-nh2)和li21((lkklcri)
3-nh2)，之后，采用固相化学合成法进行合成。
[0030]
实施例2、抗菌肽li7、li14、li21的抗菌谱及最小抑菌浓度测定
[0031]
采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽li7，li14，li21对细菌的抗菌活性，测试菌株见表1，其中包括g

，g-，敏感菌以及携带不同耐药基因的多重耐药菌，尤其是目前临床最为严重的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、万古霉素耐药肠球菌(vre)、携带mcr、bla
ndm
以及tet(x)的革兰氏阴性菌等都有较好的抗菌活性。
[0032]
表1
[0033]
[0034][0035]
注：文献1为liu y，ding s，dietrich r，e，zhu k.a biosurfactant inspired heptapeptide with improved specificity to kill mrsa[j].angewandte chemie international edition，2017，56(6)，1486-1490.
[0036]
文献2为meirong song，yuan liu，xiaoyong huang，shuangyang ding，yang wang，jianzhong shen and kui zhu.a broad-spectrum antibiotic adjuvant reverses multidrug-resistant gram-negative pathogens.nat.microbiol.，2020，5(8)：1040-1050.
[0037]
文献3为yuan liu，yuqian jia，kangni yang，ruichao li，xia xiao，zhiqiang wang.antagonizing vancomycin resistance in enterococcus by surface localized antimicrobial display-derived peptides.acs infect.dis.，2020，6(5)：761-767.
[0038]
文献4为yuan liu，yuqian jia，kangni yang，ziwen tong，jingru shi，ruichao li，xia xiao，wenkai ren，r
ü
diger hardeland，russel j reiter，zhiqiang wang.melatonin overcomes mcr-mediated colistin resistance in gram-negative pathogens.theranostics.2020，10(23)：10697-10711.
[0039]
文献5为yuan liu，yuqian jia，kangni yang，ruichao li，xia xiao，zhiqiang wang.anti-hiv agent azidothymidine decreases tet(x)-mediated bacterial resistance to tigecycline in escherichia coli.commun.biol.2020，3(1)：162.
[0040]
文献6为danielle m.mcgratha，e.magda barbua，wouter h.p.driessena，todd m.lascob，jeffrey j.tarrandc，pablo c.okhuysend，dimitrios p.kontoyiannise，richard l.sidmanf，renata pasqualinia，and wadih arapa.mechanism of action and initial evaluation of a membrane active all-d-enantiomer antimicrobial peptidomimetic.pnas.2013，110(9)：3477-3482.
[0041]
文献7为yan li，qian wang，kai peng，yuan liu，ruichao li and zhiqiang wang.emergence of carbapenem-and tigecycline-resistant proteus cibarius of animal origin.front.microbiol.2020,11：1940.
[0042]
微量肉汤稀释法具体步骤如下：
[0043]
(1)用mhb肉汤培养基悬浮待测菌株，分别得到菌浓度为1
×
106cfu/ml的菌悬液。
[0044]
(2)分别取抗菌肽li7，li14，li21，用磷酸盐缓冲液(pbs)溶解并用mhb肉汤培养基稀释，分别得到浓度为512μg/ml的li7，li14，li21抗菌药物溶液。
[0045]
(3)取96孔板，每孔加入100μl mhb肉汤培养基，第一列每孔加入100μl步骤(2)制备的抗菌药物溶液，自第一列倍比稀释至第十列；之后每孔加入100μl步骤(1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h，观察抗菌肽li7，li14，li21抑制细菌生长时的最低浓度。设置阳
性对照孔，每个阳性对照孔加入100μl mhb肉汤培养基和100μl步骤(1)制备的菌悬液。
[0046]
试验结果见表2。结果表明抗菌肽li14效果最佳，表现出广谱抗菌活性，对各种细菌包括目前临床最为严重的mrsa、vre及多重耐药革兰氏阴性菌等都具有较好的抑菌效果，最小抑菌浓度分布在1-64μg/ml之间。
[0047]
表2新型抗菌肽li抗菌谱测定
[0048]
[0049][0050]
实施例3、抗菌肽li14与不同种类抗生素的协同抗菌活性
[0051]
采用棋盘分析法测定抗菌肽li14和不同种类抗生素对多重耐药菌e.coli b2和mrsat144的协同抗菌活性。
[0052]
(1)用mhb肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1
×
106cfu/ml的菌悬液。
[0053]
(2)分别取不同种类抗生素，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，分别得到浓度为128μg/ml的抗生素溶液。
[0054]
(3)取抗菌肽li14，用pbs溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为128μg/ml的抗菌药物溶液。
[0055]
(4)取96孔平底板，每孔加入100μl mhb肉汤培养基，最后一行每孔加入100μl步骤(2)制备的抗生素溶液，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入步骤(3)制备的抗菌药物溶液(每孔100μl)，倍比稀释至第七列，之后每孔加入100μl步骤(1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h，观察抗菌肽li14和各种抗生素联合使用抑制细菌生长时二者的最低浓度组合。设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入100μl mhb肉汤培养基和100μl步骤(1)制备的菌悬液。分级抑菌浓度fic指数按照以下公式进行计算：
[0056]
fic＝mic(a联合应用)/mic(a单用) mic(b联合应用)/mic(b单用)
[0057]
试验结果见表3和表4。结果表明抗菌肽li14可以显著增强环丙沙星，多西环素，替加环素，卡那霉素以及利福平对e.coli b2的抗菌活性，增效倍数为8到64倍，其中对利福平的增效效果最为显著，增效倍数达到64倍；抗菌肽li14可以显著增强氨苄西林以及多西环素对mrsa t144的抗菌活性，其中对氨苄西林的增效效果最为明显，增效倍数为64倍。联合使用的分级抑菌浓度指数(fic index)小于0.5，表明两者联合使用具有显著的协同作用。
[0058]
表3抗菌肽li14联合不同种类抗生素对e.coli b2的协同活性
[0059][0060]
表4抗菌肽li14联合不同种类抗生素对mrsa t144的协同活性
[0061]
抗生素mica(μg/ml)fic indexmicb(μg/ml)增效倍数(fold)c氨苄西林640.078164多西环素160.188116环丙沙星22.02-万古霉素0.52.00.5-[0062]a抗生素单独使用时对耐药菌的最小抑菌浓度；b加入抗菌肽li14后不同种类抗生素对耐药菌的最小抑菌浓度；c抗生素的抗菌活性提高倍数。
[0063]
实施例4、抗菌肽li14的时间杀菌曲线
[0064]
分别接大肠杆菌atcc 25922，e.coli b2和金黄色葡萄球菌atcc 29213，mrsat144单克隆于mhb肉汤中，培养4-5h，之后将菌液浓度调制106cfu/ml，在96孔板中铺100μl mhb肉汤，第一列加入1024μg/ml的抗菌肽li14，倍比稀释至倒数第二列，之后每孔加入100μl的106cfu/ml菌液。同时测定抗菌肽li14在无营养培养基中的杀菌活性，即将上述方法中的mhb培养基换成磷酸盐缓冲液。之后，分别于0.5h，1h，2h，4h取50μl上述抗菌肽与菌液的混合液于lb琼脂平板，过夜培养后进行菌落计数。
[0065]
实验结果见图1。结果表明，抗菌肽li14具有时间依赖性的杀菌效果，在4h时杀菌
效果最为显著，在8μg/ml时即可杀灭所有细菌，并且抗菌肽li14杀菌活性的发挥不依赖于营养基的支持，因为抗菌肽li14在磷酸盐缓冲液中几乎具有相当的杀菌活性。
[0066]
实施例5、抗菌肽li14对生物膜的抑制以及清除、杀死持留菌的活性
[0067]
生物膜抑制实验：先将e.coli b2以及mrsa t144与亚抑菌(mic及小于mic浓度)浓度的抗菌肽li14在96孔平底板中混合置于37℃中培养36h。之后弃掉菌液，pbs清洗并弃去，加入50μl甲醇固定15分钟，15分钟后吸出固定液自然风干，加入100μl 0.1％结晶紫溶液染色15分钟，染色后吸除染色液pbs清洗并自然风干，加入33％乙酸于37℃培养30分钟溶解结晶紫，最后用酶标仪测定在576nm处的吸光值。实验结果见图2，结果表明抗菌肽li14对e.coli b2以及mrsa t144生物膜的形成呈现出浓度依赖性的抑制作用，其中，抗菌肽l114在1μg/ml时可以显著抑制mrsat144生物膜的形成；在0.25μg/ml时即可显著抑制e.coli b2生物膜的形成。
[0068]
生物膜清除实验：将e.coli b2以及mrsa t144 cfu＝106的菌液与mhb培养基在96孔板中置于37℃培养箱培养36h，之后吸出菌液并弃去，每孔加入100μl不同浓度的抗菌肽l114(4，8，16,32,64,128μg/ml)置于37℃培养箱培养2h，培养后，用超声仪器超声15分钟，去除附着菌，并进行滴板计数。实验结果见图2，结果表明，抗菌肽li14呈现出浓度依赖性的清除e.coli b2及mrsa t144形成的生物膜的效果，其中，在128μg/ml时可以完全清除mrsa t144形成的生物膜，对e.coli b2形成生物膜的清除率达到90％以上。
[0069]
持留菌实验：接e.coli b2以及mrsa t144单克隆于mhb肉汤中在37℃摇床培养16h，之后分别加替加环素(50mic)以及万古霉素(50mic)于37℃恒温培养箱作用4h，即得到持留菌。抗生素作用之后离心，pbs重悬菌体沉淀至od
600
＝0.5，加入不同浓度的抗菌肽li14置于37℃恒温培养箱作用6h，之后滴板测定cfu。实验结果见图2，结果表明，抗菌肽li14对持留菌的清除呈现出浓度依赖性的效果，其中，抗菌肽li14在4μg/ml时，对mrsa t144形成的持留菌呈现出较为显著的清除效果，在128μg/ml时对e.coli b2以及mrsa t144所形成的持留菌的清除率均达到99％以上。
[0070]
实施例6、抗菌肽li14在cd-1小鼠体内急性毒性实验
[0071]
抗菌肽li14 10mg/kg(2200μg/ml)：将2mg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。注：10mg/kg的含义是1kg小鼠中抗菌肽的含量是10mg。以下所有涉及到mg/kg的类同。
[0072]
1、小鼠分组处理
[0073]
取12只体重约为22g的cd-1雌性小鼠，随机分成vehicle组和抗菌肽li14 10mg/kg处理组(每组6只)，分别进行如下处理：
[0074]
vehicle组：每天观察小鼠的行为状态，记录体重，持续6天。
[0075]
抗菌肽li14 10mg/kg(2200μg/ml)：每天腹腔注射2200μg/ml的抗菌肽li14，持续6天，期间观察小鼠的行为状态，记录体重。
[0076]
2、进行血常规和生化指标检测
[0077]
第七天所有小鼠进行摘眼球取血，处理后得到全血和血清，进行血常规和生化指标检测。实验结果见图3，结果表明采用腹腔注射的方式进行一周的蓄积毒性之后，小鼠的体重与对照组相比没有发生明显的变化，血常规和生化指标检测指标均在正常范围之内，表明采用腹腔注射的方式在测试剂量下抗菌肽li14不存在体内毒性。
[0078]
实施例7、抗菌肽li14以及与抗生素利福平或者氨苄西林联合使用治疗大蜡螟幼
虫细菌感染
[0079]
抗菌肽li14 10mg/kg(300μg/ml)：将300μg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。
[0080]
抗菌肽li14 20mg/kg(600μg/ml)：将600μg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。
[0081]
抗菌肽li14 50mg/kg(1500μg/ml)：将1500μg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。
[0082]
利福平10mg/kg(300μg/ml)：将300μg利福平溶于1ml甲醇得到。
[0083]
氨苄西林10mg/kg(300μg/ml)：将300μg氨苄西林溶于1ml水得到。
[0084]
抗菌肽li14 利福平10mg/kg 10mg/kg(300μg/ml 300μg/ml)：分别取300μg抗菌肽li14和300μg利福平溶于1ml甲醇得到。
[0085]
抗菌肽li14 氨苄西林10mg/kg 10mg/kg(300μg/ml 300μg/ml)：分别取300μg抗菌肽li14和300μg氨苄西林溶于1ml水得到。
[0086]
细菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬mrsa t144和e.coli b2，得到细菌悬浮液；使mrsa t144和e.coli b2菌液浓度均为1.0
×
107cfu/ml。
[0087]
1、大蜡螟幼虫分组处理
[0088]
取96只体重为300mg的大蜡螟幼虫，随机分成12组，分别为：vehicle组(mrsa t144组及e.coli b2组)、抗菌肽li14 10mg/kg(mrsa t144组及e.coli b2组)、抗菌肽li14 20mg/kg(mrsa t144组及e.coli b2组)，抗菌肽li14 50mg/kg(mrsa t144组及e.coli b2组)，利福平10mg/kg，氨苄西林10mg/kg，抗菌肽li14 利福平10mg/kg，抗菌肽li14 氨苄西林10mg/kg(每组8只)，分别进行如下处理：
[0089]
mrsa t144：
[0090]
vehicle组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144菌悬浮液；1h后右下最后1个腹足注射0.01ml pbs缓冲液；
[0091]
抗菌肽li14 10mg/kg(300μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为300μg/ml的li14溶液；
[0092]
抗菌肽li14 20mg/kg(600μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为600μg/ml的li14溶液；
[0093]
抗菌肽li14 50mg/kg(1500μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为1500μg/ml的li14溶液；
[0094]
氨苄西林10mg/kg(300μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为300μg/ml的氨苄西林溶液；
[0095]
协同治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml mrsa t144悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml抗菌肽li14 氨苄西林10mg/kg(300μg/ml 300μg/ml)混合液；
[0096]
e.coli b2：
[0097]
vehicle组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2菌悬浮液；1h后右下最后1个腹足注射0.01ml pbs缓冲液；
[0098]
抗菌肽li14 10mg/kg(300μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为300μg/ml的li14溶
液；
[0099]
抗菌肽li14 20mg/kg(600μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为600μg/ml的li14溶液；
[0100]
抗菌肽li14 50mg/kg(1500μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为1500μg/ml的li14溶液；
[0101]
利福平10mg/kg(300μg/ml)治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml浓度为300μg/ml的利福平溶液；
[0102]
协同治疗组：大蜡螟幼虫左下最后1个腹足注射0.01ml e.coli b2悬浮液；1h后右下最后一个腹足注射0.01ml抗菌肽li14 氨苄西林10mg/kg 10mg/kg(300μg/ml 300μg/ml)混合液；
[0103]
2、统计存活率
[0104]
分别于完成步骤1后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天统计大蜡螟幼虫的存活率。
[0105]
实验结果见图4。结果表明，在mrsa t144感染组中，随着li14浓度的提高显著提高了大蜡螟的存活率，在li14 50mg/kg治疗组中，大蜡螟的存活率达到了100％；此外，在协同治疗组中，大蜡螟的存活率均高于li14(10mg/kg)和氨苄西林(10mg/kg)单独治疗时的存活率；在e.coli b2感染组中，随着li14浓度的提高显著提高了大蜡螟的存活率，在li14 50mg/kg治疗组中，大蜡螟的存活率达到了75％；并且，在协同治疗组中，大蜡螟的存活率均高于li14(10mg/kg)和利福平(10mg/kg)单独治疗时的存活率；
[0106]
实施例8、抗菌肽li14治疗大鼠皮肤伤口感染
[0107]
抗菌肽li14 50μg/ml：将50μg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。
[0108]
抗菌肽li14 100μg/ml：将100μg抗菌肽li14溶于1ml pbs得到。
[0109]
抗菌肽li14 氨苄西林50μg/ml 50μg/ml：分别取50μg抗菌肽li14和50μg氨苄西林溶于1ml水得到。
[0110]
抗菌肽li14 利福平50μg/ml 50μg/ml：分别取50μg抗菌肽li14和50μg利福平溶于1ml甲醇得到。
[0111]
细菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬mrsa t144和e.coli b2，得到细菌悬浮液；使mrsa t144和e.coli b2菌液浓度均为1.0
×
108cfus/ml。
[0112]
1、大鼠分组处理
[0113]
取8只雌性大鼠，随机分成8组，分别为vehicle组(mrsa t144组及e.coli b2组)、抗菌肽li14 50μg/ml(mrsa t144组及e.coli b2组)、抗菌肽li14 20μg/ml(mrsa t144组及e.coli b2组)，抗菌肽li14 利福平50μg/ml 50μg/ml，抗菌肽li14 氨苄西林50μg/ml 50μg/ml(每组1只)，分别进行如下处理：
[0114]
mrsa t144
[0115]
vehicle组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(mrsa t144)，1h后伤口部位给予0.1ml pbs缓冲液；
[0116]
抗菌肽li14 50μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于
伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(mrsa t144)，1h后伤口部位给予0.1ml 50μg/ml的抗菌肽li14；
[0117]
抗菌肽li14 100μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(mrsa t144)，1h后伤口部位给予0.1ml 100μg/ml的抗菌肽li14；
[0118]
抗菌肽li14 氨苄西林50μg/ml 50μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(mrsa t144)，1h后伤口部位给予0.1ml抗菌肽l114与氨苄西林的混合液；
[0119]
e.coli b2：
[0120]
vehicle组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(e.coli b2)，1h后伤口部位给予0.1ml pbs缓冲液；
[0121]
抗菌肽li14 50μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(e.coli b2)，1h后伤口部位给予0.1ml 50μg/ml的抗菌肽li14；
[0122]
抗菌肽li14 100μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(e.coli b2)，1h后伤口部位给予0.1ml 100μg/ml的抗菌肽li14；
[0123]
抗菌肽li14 利福平50μg/ml 50μg/ml组：大鼠背部皮肤左右两侧各剪一个约1cm2的伤口，之后于伤口部位给予0.1ml上述细菌悬浮液(e.coli b2)，1h后伤口部位给予0.1ml抗菌肽li14与利福平的混合液；
[0124]
2、测量大鼠皮肤伤口大小、测量伤口部位载菌量、取伤口部位进行he染色
[0125]
每天对大鼠伤口部位进行测量，记录伤口大小并进行拍照记录，持续8天；8天之后取伤口部位组织进行滴板计数，测cfu，同时，取伤口部位组织进行he染色，做病理切片，对伤口愈合情况进行分析。
[0126]
实验结果见图5，结果表明li14可以显著促进伤口的愈合，降低皮肤部位载菌量，同时，抗菌肽li14与抗生素(氨苄西林/利福平)联合治疗组效果均优于二者单独使用。