检测核酸的组合、方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及核酸的检测。


背景技术：

2.长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。然而病理组织较难获得，取样较为不便，且难以连续取样对肿瘤患者的基因突变情况进行持续监测。因此通过检测患者外周血中的循环肿瘤dna(ctdna)的基因突变可以实现对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测。但由于外周血样本背景复杂，ctdna含量稀少，因此对于低丰度以及稀有序列的检测，需要特异性和灵敏度极高的检测方法及检测试剂盒。
3.目前现有的基因突变检测试剂，多采用taqman水解探针法或是扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,arms)。其中taqman水解探针法方法需要设计一对特异性的pcr引物和一条与模版互补的特异性探针，且探针的结合位点位于两条引物之间，探针上5'端和3'端分别标记了一个荧光基团(供体)和一个淬灭基团(受体)，当taqman探针呈完整的游离状态时，荧光基团与淬灭基团相距较近，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，fret)，从而导致仪器检测不到荧光信号；在pcr扩增过程中，taq dna聚合酶利用其5
’‑3’
核酸外切酶活性切割与靶序列结合的探针，荧光报告基团和淬灭基团相距变远，从而释放出荧光信号。
4.另一方面，arms法利用dna聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点，如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对，那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。理论上在进行基因突变检测时，需要一条通用探针与之配合的突变型引物和野生型引物，其中突变型引物的3’末端与突变型基因完全匹配，但与野生型基因不匹配。在进行突变基因检测时，由于突变型引物与野生型模板不能完全配对，引物的延伸被阻滞，从而实现突变基因的检测。
5.在针对肿瘤患者外周血ctdna进行液体活检时，由于ctdna呈高度片段化，其片段长度分布在90bp-160bp之间，既往研究发现当靶序列长度越短时，ctdna的检出率越高(anderson et al.,2015)。但当前的ctdna检测技术无论是采用taqman水解探针法还是arms法，都存在靶序列过长的问题。如专利cn105349654b所述的一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒，其检测egfr突变基因所需的靶序列长度在70bp-134bp之间，其中外显子18上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为100bp-116bp，外显子19上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为70bp-84bp，外显子20上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为85bp-134bp，外显子21上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为109bp-121bp。较长的扩增靶序列长度势必会降低片段化ctdna模板的检出率，从而影响检测灵敏度。
6.此外，目前arms法中的突变型引物往往无法完全阻滞非特异性的模板扩增，在检测时容易产生假阳性的结果，尤其是在终点检测的系统如数字pcr系统中，突变型和野生型的在扩增终点时的荧光信号往往很难区分，因此导致检测的特异性不足。
7.据此，在基因检测领域，存在着进一步改善核酸检测灵敏度和特异性的需求。


技术实现要素：

8.针对上述问题，本发明人基于arms法对其引物和探针设计方式进行研究，从而完成了本发明。
9.一方面，本发明提供了用于检测核酸的组合，包括：
10.上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；
11.下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端也能够与同一特异检测位点互补；和
12.信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，
13.其中，所述信号寡核苷酸被设计成所述上游引物和/或下游引物的一部分且位于所述靶序列结合区的上游；或者，所述上游引物和/或下游引物在靶序列结合区的上游进一步包括信号检测区，所述信号寡核苷酸被设计成独立于所述上游引物和/或下游引物且与所述信号检测区具有相同的序列，
14.并且其中，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对。
15.通过采用这样的设计，本发明取得了以下有益效果：
16.一方面，在使用信号寡核苷酸代替靶序列特异性探针的基础上，本发明在上游引物与下游引物两者的3’末端均与靶序列上的某个特异检测位点相匹配。两种方式相互配合，使得对靶序列长度的需求降低到理论上的最低值如下文实施例中所证实，靶序列的长度可不超过40bp。如前文所述，在高度片段化核酸样本(如ctdna)的检测中，更短的靶序列长度拥有更高的检出率，从而大大提高检测的灵敏度。
17.另一方面，本发明的组合以及反应体系可以良好地避免交叉反应，例如，在检测突变型靶核酸序列时，无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时，两者交叉反应小，更有利于稀有突变的检测。
18.又一方面，本发明的组合可用于检测小于100bp的短片段dna，可以适用于多种样本类型的核酸检测。
19.再一方面，本发明的组合可在一个反应管中同时检测突变型与野生型靶核酸序列，无需分管定性检测或定量检测野生型和突变型基因，特别适合用于稀少样本，如外周血ctdna样本的检测。
20.在一些实施方式中，本发明的组合的各引物对被设计成针对不同的基因突变类型。在信号寡核苷酸被设计成引物的一部分的情况下，各引物对所对应的信号寡核苷酸探针可彼此相同，但它们的靶序列结合区与不同的突变型基因互补。在信号寡核苷酸独立于引物存在的情况下，各引物对的信号检测区可彼此相同，但它们的靶序列结合区与不同的突变型基因互补。类似地，本发明的组合还可以包括额外的多组引物对。
21.通过利用多组上游引物以及下游引物的靶序列结合区特异性识别多种靶标，然后由信号寡核苷酸进行检测。在多重检测中，针对无需分型的基因突变类型，只需设计不同的上游引物及下游引物，可以共用信号寡核苷酸，即可实现不同基因突变类型的检测，减少探
针的使用量。一方面，可以节约成本，利于临床使用；另一方面，可以显著降低反应体系内因探针数量过多造成的背景干扰。
22.在一些实施方式中，所述组合进一步包括能够特异性靶向其他核酸的上游引物和/或下游引物。例如，在本发明的组合的上游引物和下游引物被设计成针对突变型基因的情况下，即，上游引物和下游引物的3’末端均与靶序列上的特异检测位点(即，由于突变所引起待检测的突变型基因区别于其他基因的位点)相匹配，能够扩增突变型基因；进一步地，本发明的组合还包括野生型上游引物，所述野生型上游引物3’末端设置有与野生型基因匹配的位点，能够特异性地与野生型基因退火，和/或野生型下游引物，所述野生型下游引物3’末端设置有与野生型基因匹配的位点，能够特异性地与野生型基因退火。
23.在一些实施方式中，本发明的靶序列结合区可设置有1-5个错配碱基，其不与靶序列互补配对。例如，在靶序列结合区的3’末端倒数第2位或第3位上可设置有错配碱基。
24.在第一方式中，本发明的组合包括：
25.上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；
26.下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端也能够与同一特异检测位点互补；和
27.信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸被设计成自5’至3’依次包括第一茎(stem)区、环(loop)区、第二茎区和锚定(anchor)区，并且修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团修饰在所述第一茎区上，所述第二检测基团修饰在所述第二茎区上、所述第二茎区与锚定区之间或所述锚定区的非3’末端，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，
28.其中，所述上游引物和/或下游引物在靶序列结合区的上游包括信号检测区，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对，
29.其中，所述第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，所述锚定区位于所述信号寡核苷酸的3’端且被设计成与所述信号检测区完全或部分相同。
30.可以理解，由于锚定区被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。另外，第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，从而能够与第二茎部一起构成茎环的茎部。
31.当使用第一方式的组合时，第一茎区与第二茎区互补，构成茎环的茎部，当信号寡核苷酸呈完整的“茎环”结构时，第一检测基团与第二检测基团距离较近，荧光共振能量转移效率较高；当信号寡核苷酸的第一茎区被dna聚合酶的5
’‑3’
外切酶活性水解，或信号寡核苷酸的“茎环”结构被打开时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变远，荧光共振能量转移效率降低，导致荧光信号产生变化，从而被仪器检测到。
32.在一些实施方式中，本发明的信号寡核苷酸能够形成“茎环”结构，该茎环结构在本发明的引物的退火温度下(如高至75℃的情况下)仍具有稳固的结构(即，“茎环”不会被打开)。
33.在本发明中，第一茎区的长度可以是6-20nt。
34.在本发明中，第二茎区的长度可以是6-20nt。
35.在本发明中，环区例如可以是长度为3-25nt的碱基序列，又例如可以是选自由c3、c6、c9和c12所组成的组的间臂修饰，再例如可以选自聚乙二醇。
36.在本发明中，第二茎区与锚定区之间可以存在0-5个碱基间隔。
37.在具体的实施方式中，锚定区的长度可以是15-30nt。
38.在示例性的实施方式中，第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于所述第二茎区；第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于锚定区的非3’末端；第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于第二茎区和锚定区之间；第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于第二茎区；第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于锚定区的非3’末端；或者第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于第二茎区和锚定区之间。
39.在一些实施方式中，第一检测基团或第二检测基团可位于第一茎区的5’端。
40.在第二方式中，本发明的组合包括：
41.上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；
42.下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；和
43.信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸被设计成柔性寡核苷酸，其全部或部分序列与信号检测区相同，并且所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，所述第一检测基团和第二基团位于所述信号寡核苷酸的非3’末端，
44.其中，所述信号检测区位于上游引物和/或下游引物的靶序列结合区的上游，并且所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对。
45.可以理解，由于信号寡核苷酸被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。
46.当使用第二方式的组合时，上游引物及下游引物与靶序列特异性结合并延伸产生预扩增产物后，信号寡核苷酸可与预扩增产物互补配对并进行pcr扩增，将第一检测基团与第二检测基团整合入pcr产生的双链扩增产物中，使得第一检测基团与第二检测基团的距离发生变化，导致荧光信号发生变化，从而被仪器检测到。
47.在具体的实施方式中，信号寡核苷酸的长度可以是15-30nt。
48.在示例性的实施方式中，第一检测基团位于5’端或任意非3’末端的位置，而第二检测基团与第一检测基团间隔5-25nt且未位于3’末端。
49.在第三方式中，本发明的组合包括：
50.上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；
51.下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；
52.信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸的全部或部分序列与信号检测区相同，并且修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过所述信
号寡核苷酸水解所产生的距离的变化产生信号的变化；和
53.第二引物，所述第二引物的全部或部分序列与信号检测区相同，
54.其中，所述信号检测区位于上游引物和/或下游引物的靶序列结合区的上游，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对，并且所述信号检测区上与所述信号寡核苷酸相同的区域位于与所述第二引物相同的区域的下游。
55.可以理解，在该方式中，信号寡核苷酸为taqman探针，其能够与信号检测区的互补序列进行杂交配对；另外，由于第二引物被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。
56.当使用第三方式的组合时，上游引物及下游引物与靶序列特异性结合并延伸产生预扩增产物后，第二引物以及信号寡核苷酸可与预扩增产物互补配对，由第二引物进行延伸时，会将信号寡核苷酸水解并释放第一检测基团，导致荧光信号发生变化，从而被仪器检测到。
57.本领域技术人员能够设计并选择合适的第二引物，只要能够对上游引物和下游引物的预扩增产物进行扩增即可。
58.对于本发明第三方式中的信号寡核苷酸，本领域技术人员能够按照常规taqman水解探针的设计原则进行设计，只要杂交区域位于信号检测区的互补区域即可。
59.在一个具体的实施方式中，第一检测基团和第二检测基团分别位于信号寡核苷酸的5’末端和3’末端。
60.在第四方式中，本发明的组合包括：
61.上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；
62.下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；和
63.信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，
64.其中，所述信号寡核苷酸被设计成所述上游引物和/或下游引物的一部分且位于靶序列结合区的上游，所述信号寡核苷酸自5’至3’依次包括第一茎区、环区和第二茎区，其中，所述第一检测基团位于所述第一茎区，而所述第二检测基团位于所述第二茎区，
65.并且其中，所述第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补。
66.可以理解，第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，从而能够与第二茎部一起构成茎环的茎部。
67.当使用第四方式的组合时，在信号寡核苷酸呈完整的“茎环”结构的情况下，第一检测基团与第二检测基团距离较近，荧光共振能量转移效率较高；在第一茎区被dna聚合酶的5
’‑3’
外切酶活性水解，或信号寡核苷酸的“茎环”结构被打开时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变远，荧光共振能量转移效率降低，导致荧光信号产生变化，从而被仪器检测到。
68.通过将信号寡核苷酸设计在上游引物和/或下游引物内，本发明进一步节省了传统arms法中探针的使用，在满足检测性能的同时降低了成本。
69.在示例性的实施方式中，第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于所述第二茎区；或者第二检测基团位于第一茎区，而第一检测基团位于第二茎区。
70.此外，本发明还提供了一种检测核酸的方法，包括以下步骤：
71.将本发明的组合、扩增试剂与样本混合；
72.对样本中可能存在的靶序列进行扩增；
73.获得所产生的信号变化；以及
74.根据所获得信号变化判断样本中是否存在靶核酸。
75.在具体的实施方式中，在判断样本中是否存在靶核酸的同时对靶核酸进行定量。
76.在一些实施方式中，在扩增步骤之前还包括将样本混合物分配到不同的反应单元中的步骤双链核酸变性为单链；任选地，在分配到不同的反应单元之前，还可以包括将双链核酸变性为单链核酸的步骤。
77.具体地，根据所获得的荧光信号判断是指检测第一检测基团与第二检测基团之间的荧光共振能量转移存在或不存在。
78.在具体的实施方式中，扩增包括是指通过pcr进行扩增，例如可包括预变性；变性、退火及延伸的多个循环。
79.在优选的实施方式中，所述待测模板为ctdna且所述样本为外周血。
80.在一些实施方式中，所述样本来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者。
附图说明
81.图1示出了本发明的一个方式在数字pcr平台上检测egfr基因18外显子点突变(c.2156g》c，p.g719》a突变)时的结果；
82.图2示出了对比例1中不同片段长度的方案对高、中和低值样本定量数据的线性回归分析结果；
83.图3示出了本发明的另一个方式在q-pcr检测平台上检测egfr基因18外显子点突变(c.2156g》c，p.g719》a突变)时的结果；
84.图4示出了本发明的又一个方式在数字pcr平台上检测egfr基因点突变(c.2369c》t，p.t790》m)时的结果；
85.图5示出了对比例2中不同片段长度的方案对高和低值样本定量数据的线性回归分析结果。
具体实施方式
86.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
87.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
88.在本文中，术语“核酸”是指核苷酸单体的单链和/或双链聚合物，包括但不限于通
过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物连接的2
’‑
脱氧核糖核苷酸(dna)和核糖核苷酸(rna)。核酸中的核苷酸单体可称为“核苷酸残基”。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括但不限于核苷酸、和/或核苷酸类似物(如修饰的核苷酸)。核酸的大小通常从几个核苷酸残基到几千个核苷酸残基不等。其中“寡核苷酸”通常指长度相对较短(例如小于80)的核苷酸聚合物。除非另外指出，否则每当呈现核酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5’到3’的顺序。非另行指出，否则“a”表示腺嘌呤，“c”表示胞嘧啶，“g”表示鸟嘌呤，“t”表示胸腺嘧啶，并且“u”表示尿嘧啶。
89.根据本领域习惯用语，核酸的长度可以碱基对(缩写为“bp”)、核苷酸(缩写为“nt”)或千碱基(缩写为“kb”)来表示。
90.在本文中，“碱基互补配对”是指a与t、a与u和g与c的对应关系互相以氢键相连的现象。相应地，“错配碱基”是指除“碱基互补配对”中所规定外的其他所有配对情形，如a与c、a与g、t与g，或t与c配对。
91.如前文所述，本发明的靶序列结合区可设置有1-5个错配碱基，错配可与3’末端的碱基共同作用，使引物在于其3’末端不互补的模板中的扩增率显著降低。设置这样的错配碱基属于本领域技术人员的能力范围之内。在一些实施方式中，在上游引物和/或下游引物的倒数第三位引入错配。
92.在一些实施方式中，本发明的方法是对核酸突变进行检测。
93.在本发明中，“突变”可以选自以下项：碱基置换突变、插入突变和缺失突变。在示例性的实施方案中，突变是碱基置换突变，即待检测的两种靶序列(野生型和突变型)之间没有碱基数目的差别，而是一个或多个碱基的类型不同。
94.在一些实施方式中，本发明的突变是单核苷酸突变。
95.在本发明中，“特异检测位点”是指能够将靶核酸与其他核酸进行区分的碱基位点，例如，针对点突变情况，野生型核酸与突变型核酸之间或不同的突变型核酸之间存在突变碱基，则“特异检测位点”即为该突变碱基；针对核酸分型(例如对一些病毒进行分型)的情况，与突变类似，不同型别的核酸之间存在一个或若干个碱基差异，则“特异检测位点”即为其中的某个差异碱基。
[0096]“上游引物和下游引物的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补”，即上游引物和下游引物的3’末端均与靶核酸的同一特异检测位点互补。例如，针对点突变情况，本发明的组合中，上游引物和下游引物的3’末端均与该突变碱基互补；针对核酸分型情况，本发明的组合中，上游引物3’末端与某个差异碱基互补，下游引物的3’末端也与该差异碱基互补。由于采用这样的设计，在引物的3’末端不与特异检测位点互补的情况下，引物的延伸被阻滞，从而实现靶序列的检测。
[0097]
在本文中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性dna聚合酶“引发”dna合成，即例如寡核苷酸的3
’‑
端提供游离3
’‑
oh基团，可以通过模板依赖性dna聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3
’‑
oh基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
[0098]
在本文中，术语“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶标”可互换使用且意指要扩增、检测或扩增并检测的核酸序列部分，其可在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进
行退火或杂交。
[0099]
术语“杂交”表示两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体的形成。可以理解，并不要求它们在全长上具有100％互补性才可实现杂交。
[0100]
在本文中，术语“上游引物”，也称正向引物，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“下游引物”，也称反向引物，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。其中，正链即有义链、正义链，也称编码链，一般位于双链dna上端，方向从左到右为5
’‑3’
，碱基序列和该基因mrna基本相同；与该链结合的引物为反向引物；负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的正向和反向引物命名也可随之互换。
[0101]
在本文中，“上游”、“位于/在
……
上游”、“上游具有
……”
等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近5’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。相应地，本文所用的术语“下游”、“位于/在
……
下游”、“下游具有
……”
等，在描述核酸序列的语境下是表示在同一核酸序列上比指代区域更靠近3’端的部分，例如可以是紧邻指代区域，也可以与指代区域有一个或多个碱基的间隔。应了解，除另有说明外，在描述的核酸为双链核酸时，“上游”和“下游”的表示方法通常以正义链的5’端和3’端为准。
[0102]
在本文中，术语“taqman探针(taqman probe)”与“水解探针(hydrolysis probe)”可互换使用。taqman探针是在real-time pcr技术平台发展出的荧光检测技术，探针的5’端含有第一检测基团，3’端含有第二检测基团。探针完整时，第一检测基团发射的荧光信号被第二检测基团吸收，当进行pcr扩增时，taq dna聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得第一检测基团和第二检测基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与pcr产物形成完全同步。
[0103]
在本文中，“严格条件”，可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，如为5
×
ssc、5
×
denhardt溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、32℃的条件；此外，“中严格条件”，如为5
×
ssc、5
×
denhardt溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、42℃的条件；“高严格条件”，如为5
×
ssc、5
×
denhardt溶液、0.5％sds、50％甲酰胺、50℃的条件。在这些条件下，预期温度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如dna。虽然影响杂交的严格度的因素有多种，如温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等，但本领域技术人员可通过适当选择这些要素得到类似的严格度。
[0104]
在本文中，“柔性寡核苷酸”是指寡核苷酸在单链状态因分子柔性使其成卷曲状，而在杂交或退火延伸变为双链状态后，因氢键作用而使其固定为较为刚性的双螺旋结构，使得柔性寡核苷酸上标记的第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，从而产生可检测的信号。例如，可以参照us9845492b2的记载获得柔性寡核苷酸。
[0105]
在一些实施方式中，本发明第一检测基团和第二检测基团的一者可以是荧光基团，另一者可以是淬灭基团或其它能与荧光基团通过荧光共振能量转移产生信号变化的基团。
[0106]
在示例性的实施方式中，通过荧光共振能量转移产生信号变化的基团可以是cy3或cy5，这是因为它们之间能够通过fret作用产生荧光信号变化。
[0107]
在本发明中，荧光基团例如可选自以下项所组成的组：fam、hex、vic、rox、cy3、cy5
和cy5.5。
[0108]
在本发明中，淬灭基团例如可选自以下项所组成的组：tamra、bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、qxl和ddqi。
[0109]
在一些实施方式中，信号寡核苷酸与上游引物和下游引物的预扩增产物发生退火并延伸，第一检测基团和第二检测基团被整合到延伸所产生的双链扩增产物中，由此产生距离的变化(增加)。
[0110]
在一些实施方式中，本发明的组合可以为试剂盒，所述试剂盒还包括扩增试剂。
[0111]
在本发明中，术语“扩增试剂”是指用于pcr的试剂，包括但不限于dntp、dna聚合酶、以及一些促进pcr反应的试剂，例如kcl、mgcl2、tris-hcl、二硫苏糖醇(dtt)等。
[0112]
在本发明中，组合和试剂盒中的各组分可以单独分装的形式存在，或可以预先混合的形式存在。
[0113]
在本发明中，“预变性”和“变性”的目的是破坏双链dna上成对的互补碱基之间的氢键，从而允许双链分开成两条单链。例如，可以通过加热含有双链dna混合物的方法来形成单链，如将混合物加热至90℃、92℃、95℃或98℃来解离双链dna。解离完成后，将其冷却至室温或室温以下。又例如，单链的形成还可以通过改变溶液离子强度(例如，加入酸、碱、盐等)来破坏双链dna之间的氢键，也可以采用酶(例如，解旋酶)来实现将双链dna解离成单链dna。此外，在涉及热启动聚合酶的反应中，“预变性”步骤还对该聚合酶进行了热激活；而在涉及数字pcr平台的情况下，在变性为单链之后，“预变性”还包括对将该单链分配至微滴/微孔中，以增加参与反应的有效靶标数量，从而提高反应灵敏度的操作。
[0114]
一些实施方式中，扩增可以分为两个循环扩增阶段，第一循环阶段循环数可为3-15个循环；第二循环扩增阶段的循环数可为30-50个循环。
[0115]
扩增所适用的程序及常用反应条件(如温度、时间)是本领域技术人员所熟知的。在一些示例性的实施方案中，具体反应条件可以是：92℃-96℃预变性5-15分钟；92℃-95℃变性10-60秒，55℃-75℃退火及延伸30-90秒，共进行3-15个循环；92℃-95℃变性10-60秒，45℃-65℃退火及延伸30-90秒，共进行35-50个循环；4℃-15℃终止反应。可选地，在热循环步骤之后还可以包括灭活步骤，如94℃-98℃，5-15分钟。在另一些示例性的实施方式中，扩增包括90℃-96℃预变性5-15分钟；90℃-95℃变性10-60秒，50℃-75℃退火及延伸30-90秒，35-50个循环；4℃-15℃终止反应。可选地，在热循环步骤之后还可以包括灭活步骤，如94℃-98℃，5-15分钟。在一个具体的实施方式中，扩增包括为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火延伸60秒，共进行45个循环；10℃终止反应。
[0116]
在仅用于对样本中的靶序列进行预扩增的情况下，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为15nm-150nm，优选为30nm-90nm，更优选45nm；否则，上游引物或下游引物在反应体系中的浓度例如可以为150nm-1800nm，优选为300nm-900nm，更优选450nm。
[0117]
在信号寡核苷酸独立存在的情况下，其在反应体系中的浓度例如可以为150nm-1500nm，优选300nm-600nm，更优选450nm。
[0118]
在本发明中，表述“第一”和“第二”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
[0119]
在本发明中，待测样品可以选自由外周血样本、其它人源或微生物来源的游离核酸样本、福尔马林固定石蜡包埋组织(ffpe)样本、新鲜组织样本、尿液样本、灌洗液样本、脑
脊液样本、人工培养的细胞系样本、人工合成的质粒样本及其组合中组成的组。
[0120]
以下通过具体实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。
[0121]
实施例1在ddpcr平台检测egfr基因18外显子点突变c.2156g》c，p.g719》a
[0122]
样本制备：
[0123]
使用qiagen公司qiaamp dna mini and blood mini kit按照该试剂盒的操作说明书提取hek-293t细胞dna，将hek-293t细胞dna与上海生工提供的g719a质粒dna分别超声打断并经磁珠筛选纯化，得到野生型模板(hek-293t细胞系dna)与突变型模板(g719a质粒dna)，将两种模板按照一定的比例混合，得到含egfr基因g719a点突变的模拟临床样本。同时使用片段化野生型dna制备成阴性对照(neg)，使用te buffer作为无模板对照(ntc)。
[0124]
引物及信号寡核苷酸设计：针对egfr 18外显子点突变设计上游引物、下游引物和信号寡核苷酸，其序列如表1所示。
[0125]
表1
[0126][0127]
其中，突变型上游引物(seq id no:1)全长40bp，其3’端第1至第20个碱基为靶序列结合区，其5’端的第1至第20个碱基与信号寡核苷酸(seq id no:3)的3’端的第1至第20个碱基(锚定区)相同。突变型下游引物(seq id no:2)引物全长17bp，与靶序列结合。信号寡核苷酸(seq id no:3)引物全长37bp，其3’端第1至第20个碱基为锚定区，5’端8个碱基为其第一茎区，5’端第9个碱基至第16个碱基为其第二茎区。
[0128]
反应体系配制如下表2所示。
[0129]
表2
[0130]
试剂组分浓度2x ddpcr supermix for probes1x突变型上游引物45nm突变型下游引物450nm信号寡核苷酸450nmdna样本15ng超纯水加至20μl
[0131]
配置完成后，将含有待测模板的20μl反应液放置于金属浴中，95℃变性1min，然后立即放置2～8℃冰箱冷却2～3min。
[0132]
将冷却后的20μl pcr反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μl微滴发生油(bio-rad，1863005)至微滴发生卡(bio-rad，1864008)的油孔中，最后使用密封条(bio-rad，1863009)对微滴发生卡进行密封。
[0133]
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μl的微滴至96孔pcr板(bio-rad，1200192)。
[0134]
扩增读取：
[0135]
将96孔板封膜处理后，放置于pcr热循环仪(bio-rad，px1 pcr plate sealer)中，依次进行靶核酸序列的特异性富集、富集后模板的特异性扩增以及荧光信号的检测。反应程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，65℃退火延伸60秒，共进行45个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
[0136]
反应过程中，首先在pcr反应的前几个循环，突变型上游引物以及突变型下游引物特异性的扩增靶核酸序列。扩增后，会新增一段与上游引物“信号检测区”互补的序列，供后续的信号寡核苷酸进行配对识别。
[0137]
在上述反应完成后，信号寡核苷酸以及突变型下游引物可以与对应的富集后模板进行配对并扩增，突变型下游引物扩增至锚定区时，dna聚合酶利用其5
’‑3’
外切酶活性水解第一茎区，使荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光信号，从而检测到突变型模板。
[0138]
数据分析：
[0139]
使用bio-rad公司quantasoft数字pcr分析软件进行数据分析，结果如图1所示。其中，“e02”为无模板对照(ntc)的检测结果，“f02”为阴性对照(neg)的检测结果，“h02”为模拟临床样本结果。由图1可知，阴性对照和无模板对照中均无非特异性扩增，在模拟临床样本中能够特异性识别出c.2156g》c，p.g719》a突变。
[0140]
对比例1
[0141]
在前述实施例1中，上游引物与下游引物皆特异性识别egfr基因18外显子点突变。为了考察两个引物皆特异性识别突变基因与仅单个引物特异性识别突变基因的方案在检测效果上的区别，进行以下实验。
[0142]
样本制备：
[0143]
野生型模板(hek-293t细胞系dna)与突变型模板(g719a质粒dna)的制备过程同实施例1。将两种模板按照不同的比例混合，得到含egfr基因g719 a点突变的高值样本(理论浓度393拷贝/μl)、中值样本(理论浓度44拷贝数/μl)、低值样本(理论浓度4拷贝/μl)。同时使用片段化野生型dna制备成阴性对照(neg)，使用te buffer作为无模板对照(ntc)。
[0144]
引物和信号寡核苷酸设计：
[0145]
两个引物皆特异性识别突变基因的方案采用表1中的设计；而单个引物特异性识别突变基因的方案的所采用如表3所示的设计。
[0146]
表3
[0147][0148]
表3中的下游引物和信号寡核苷酸与表1中相同。并此外，设计了一组上游引物，这些上游引物不特异性识别点突变。
[0149]
两种方案均采用了同样的突变型下游引物而不同的突变型上游引物\上游引物使得对应的靶序列长度不同，具体如表4所示。
[0150]
表4
[0151]
引物名称编号对应靶序列长度突变型上游引物seq id no:136bp上游引物1seq id no:741bp上游引物2seq id no:860bp上游引物3seq id no:982bp上游引物4seq id no:10100bp上游引物5seq id no:11114bp
[0152]
反应体系配制如下表5所示。
[0153]
表5
[0154]
试剂浓度2x ddpcr supermix for probes1x突变型上游引物或上游引物1\2\3\4\545nm突变型下游引物450nm信号寡核苷酸450nmdna样本15ng超纯水加至20μl
[0155]
在微滴生成之前，将配制完成的含有待测模板的20μl反应液放置于金属浴中，95℃变性1min后，立即放置2～8冰箱2～3min。
[0156]
将冷却后的20μl pcr反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μl微滴发
生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
[0157]
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μl的微滴至96孔pcr板。
[0158]
扩增读取：
[0159]
将96孔板进行封膜处理后，放置于pcr热循环仪中进行pcr扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火延伸60秒，共进行48个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
[0160]
待pcr扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择fam/hex通道进行信号读取。
[0161]
统计分析：
[0162]
使用quantasoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到egfr基因18外显子点突变突变型的拷贝数及浓度，结果如表6所示。
[0163]
表6
[0164][0165][0166]
从表6中可以看出靶序列的片段越短，对于样本定量的能力越高，即检测到g719a突变型片段的能力越高。
[0167]
将表6中数据做线性回归分析，分析结果如图2所示。可以看到在检测突变型高值样本、中值样本、低值样本时，其检测能力与靶序列长度呈负相关。靶序列越短，检测到突变型的片段越多，检测能力越高，反之，检测能力越低。
[0168]
实施例2在q-pcr平台检测egfr基因18外显子点突变g719a
[0169]
样本制备：
[0170]
使用qiagen公司qiaamp dna mini and blood mini kit按照该试剂盒的操作说明书提取hek-293t细胞dna，将hek-293t细胞dna与上海生工提供的g719a质粒dna分别超声打断并经磁珠筛选纯化，得到野生型模板(hek-293t细胞系dna)与突变型模板(g719a质粒dna)，将两种模板按照一定的比例混合，得到含egfr基因g719a点突变的模拟临床样本。同时使用片段化野生型dna制备成阴性对照(neg)，使用te buffer作为无模板对照(ntc)。
[0171]
反应配制：
[0172]
引物及信号寡核苷酸设计：针对egfr 18外显子点突变设计上游引物、下游引物和信号寡核苷酸，其序列如表7所示。
[0173]
表7
[0174][0175]
反应体系配制如下表8所示。
[0176]
表8
[0177][0178][0179]
扩增读取：
[0180]
将pcr管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将pcr管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量pcr仪(abi 7500实时荧光定量pcr系统)的托盘中。所使用程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，共进行10个循环，不采光；56℃退火延伸30秒，共进行30个循环，采光，10℃终止反应。
[0181]
数据分析：
[0182]
使用q-pcr检测平台进行数据分析，结果如图3所示。由图3可知，阴性对照和无模板对照中均无非特异性扩增，在模拟临床样本中能特异性识别出g719a片段。
[0183]
实施例3在ddpcr平台检测egfr基因点突变c.2369c》t，p.t790》m
[0184]
样本制备：
[0185]
使用qiagen公司qiaamp dna mini and blood mini kit按照该试剂盒的操作说明书提取hek-293t细胞dna和nci-h1975细胞系dna，并将两种细胞系dna分别超声打断并经磁珠筛选纯化，得到egfr野生型模板(hek-293t细胞系dna)与egfr t790m突变型模板(nci-h1975细胞系dna)，将两种模板按照一定的比例混合，得到含egfr基因t790m点突变的模拟临床样本。同时使用片段化野生型dna制备成阴性对照(neg)，使用te buffer作为无模板对照(ntc)。
[0186]
引物序列如表9所示。
[0187]
表9
[0188][0189]
反应体系配制如下表10所示。
[0190]
表10
[0191]
试剂组分浓度2x ddpcr supermix for probes1x突变型上游引物360nm野生型上游引物360nm突变型下游引物360nmdna样本15ng超纯水加至20μl
[0192]
配置完成后，将含有待测模板的20μl反应液放置于金属浴中，95℃变性1min，然后立即放置2～8℃冰箱冷却2～3min。
[0193]
将冷却后的20μl pcr反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μl微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
[0194]
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μl的微滴至96孔pcr板。
[0195]
扩增读取：
[0196]
将96孔板进行封膜处理后，放置于pcr热循环仪中进行pcr扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，共进行48个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
[0197]
待pcr扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择fam/hex通道进行信号读取。
[0198]
数据分析：
[0199]
用bio-rad公司quantasoft数字pcr分析软件进行数据分析，结果如图4所示。其中，“a02”为无模板对照(ntc)的检测结果；“a03”为阴性对照(neg)的检测结果；“f01”为模拟临床样本结果。本发明方案在ddpcr检测平台中阴性对照和无模板对照中均无非特异性扩增，在h1975样本中能特异性识别出t790m片段。
[0200]
对比例2
[0201]
在前述实施例3中，上游引物与下游引物皆特异性识别egfr基因20外显子点突变。本发明方案突变型f、突变型r皆特异性识别该突变位点；为了考察两个引物皆特异性识别突变基因与仅单个引物特异性识别点突变基因在检测效果上的区别，进行以下实验。样本
制备：
[0202]
野生型模板(hek-293t细胞系dna)与突变型模板(nci-h1975细胞系dna)的制备过程同实施例3。将两种模板按照不同的比例混合，得到含egfr基因t790m点突变的高值样本(理论浓度150拷贝/μl)、低值样本(理论浓度15拷贝/μl)。同时使用片段化野生型dna制备成阴性对照(neg)，使用te buffer作为无模板对照(ntc)。
[0203]
引物设计：
[0204]
两个引物皆特异性识别点突变的方案采用表10中的设计；而单个引物特异性识别点突变的方案采用如表11所示的设计。
[0205]
表11
[0206][0207]
表11中的突变型上游引物和野生型上游引物与表10中相同。此外，设计了一组下游引物，这些下游引物不特异性识别点突变。
[0208]
两种方案均采用了同样的突变型上游引物和野生型上游引物，而不同的突变型下游引物\下游引物使得对应的靶序列长度不同，具体如表12所示。
[0209]
表12
[0210]
引物名称编号对应靶序列长度突变型下游引物seq id no:1441bp下游引物1seq id no:1561bp下游引物2seq id no:1697bp下游引物3seq id no:17128bp
[0211]
反应体系配制如表13所示。
[0212]
表13
[0213]
试剂浓度2x ddpcr supermix for probes1x突变型上游引物360nm野生型上游引物360nm突变型下游引物或下游引物1/2/3360nm
dna样本15ng超纯水加至20μl
[0214]
将配制完成的含有待测模板的20μl反应液放置于金属浴中，95℃变性1min后，立即放置2～8℃冰箱2～3min。
[0215]
将冷却后的20μl pcr反应液加入到微滴发生卡的样本孔中，然后加入70μl微滴发生油至微滴发生卡的油孔中，最后使用密封条对微滴发生卡进行密封。
[0216]
将制备好的微滴发生卡放入微滴发生器中，开始微滴生成。大约2分钟后，微滴制备完成，取出卡槽，从最上排孔中小心地转移出约40μl的微滴至96孔pcr板。
[0217]
扩增读取：
[0218]
将96孔板进行封膜处理后，放置于pcr热循环仪中进行pcr扩增。所使用程序为：95℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃退火延伸60秒，共进行48个循环；98℃灭活10分钟；10℃终止反应。
[0219]
待pcr扩增结束，将96孔板放置于微滴分析仪中选择fam/hex通道进行信号读取。
[0220]
数据分析：
[0221]
使用quantasoft分析软件对荧光信号的强度、数目进行分析，得到egfr基因20外显子t790m突变型的拷贝数及浓度，结果如表14所示。
[0222]
表14
[0223][0224]
从表14中可以看出靶序列的片段越短，对于样本定量的能力越高，即检测到t790m突变型片段的能力越高。
[0225]
将表14中数据做线性回归分析，分析结果如图5所示。可以看到在检测突变型高值样本、低值样本时，其检测能力与靶序列长度呈负相关。靶序列越短，检测到突变型的片段越多，检测能力越高，反之，检测能力越低。