一种检测TGFBI基因突变的试剂盒的制作方法

技术特征：
1.一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂和第四反应体系试剂，其中：第一反应体系试剂中包括：针对tgfbi基因r124位点的上游引物，针对tgfbi基因r124wt位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r555位点的上游引物，针对tgfbi基因r555w位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r124位点的探针，针对tgfbi基因r555位点的探针；第二反应体系试剂中包括：针对tgfbi基因r124位点的上游引物，针对tgfbi基因r124h位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r555位点的上游引物，针对tgfbi基因r555q位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r124位点的探针，针对tgfbi基因r555位点的探针；第三反应体系试剂中包括：针对tgfbi基因r124位点的上游引物，针对tgfbi基因r124l位点的下游arms引物，针对内参基因gapdh的上游引物和下游引物，针对tgfbi基因r124位点的探针，针对gapdh基因的检测探针；第四反应体系试剂中包括：针对tgfbi基因r124位点的上游引物，针对tgfbi基因r124c位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r555位点的上游引物，针对tgfbi基因r555wt位点的下游arms引物，针对tgfbi基因r124位点的探针，针对tgfbi基因r555位点的探针；第一反应体系试剂至第四反应体系试剂中，各个探针序列的5’和3’端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5’端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：fam、cy5或vic。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：第一反应体系试剂中包括：如seq id no.1所示序列的引物，如seq id no.2所示序列的引物，如seq id no.3所示序列的arms引物，如seq id no.4所示序列的arms引物，如seq id no.5所示序列的探针，如seq id no.6所示序列的探针；第二反应体系试剂中包括：如seq id no.1所示序列的引物，如seq id no.2所示序列的引物，如seq id no.7所示序列的arms引物，如seq id no.8所示序列的arms引物，如seq id no.5所示序列的探针，如seq id no.6所示序列的探针；第三反应体系试剂中包括：如seq id no.1所示序列的引物，如seq id no.9所示序列的arms引物，如seq id no.10所示序列的引物，如seq id no.11所示序列的引物，如seq id no.5所示序列的探针，如seq id no.12所示序列的探针；第四反应体系试剂中包括：如seq id no.1所示序列的引物，如seq id no.2所示序列的引物，如seq id no.13所示序列的arms引物，如seq id no.14所示序列的arms引物，如seq id no.5所示序列的探针，如seq id no.6所示序列的探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：如seq id no.5所示序列的探针的5’端的荧光基团为fam；如seq id no.6所示序列的探针的5’端的荧光基团为cy5；如seq id no.12所示序列的探针的5’端的荧光基团为vic。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：各个探针序列的3’端包括bhq淬灭基团。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括：用于荧光定量pcr的其他试剂。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：采用所述试剂盒检测的方法包括下述步骤：1)提取样本中的dna，将其作为dna模板，dna浓度不低于10ng/μl，dna的od260/od280值在1.7-2.0之间；2)将dna模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体
系试剂、第四反应体系试剂中；3)进行荧光定量pcr扩增反应；4)判断是否发生突变。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述样本为edta抗凝外周血样本或口腔拭子。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤3)中荧光定量pcr扩增的反应体系为4个总体积分别为20μl的如下体系：2
×
荧光定量pcr试剂10μl，10μm的各引物各0.4μl，10μm的各探针各0.4μl，50
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rox reference dye
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0.4μl，dna样本1μl，ddh2o 6.2μl；当总体积调整时，各试剂用量按比例调整。9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤3)中pcr扩增的反应条件如下：37℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 30sec，62℃ 35sec，40个循环；60℃ 34sec。10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：步骤4)判断是否发生突变的方法包括：检测结果有效的前提，gapdh基因荧光pcr的扩增曲线呈典型的s型，且ct值≦34；若gapdh基因无扩增曲线或ct值>34时，检测结果无效，需重新取样或提取基因组dna进行检测；依据所检测位点的特异性arms引物扩增的ct值与内参gapdh基因扩增的ct值之间的差值δct来判断检测位点的型别；(1)当针对r124wt的下游arms引物检测的δct<5时，按照以下方法判断r124位点的型别：当针对r124h的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124h杂合突变；当针对r124h的下游arms引物检测的δct≥5，则检测样本无r124h突变；当针对r124l的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124l杂合突变；当针对r124l的下游arms引物检测的δct≥5，则检测样本无r124l突变；当针对r124c的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124c杂合突变；当针对r124c的下游arms引物检测的δct≥5，则检测样本无r124c突变；(2)当针对r124wt的下游arms引物检测的δct≥5时，按照以下方法判断r124位点的型别：当针对r124h的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124h纯合突变；当针对r124h的下游arms引物检测的δct≥5，则检测失败，重新检测；当针对r124l的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124l纯合突变；当针对r124l的下游arms引物检测的δct≥5，则检测失败，重新检测；当针对r124c的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r124c纯合突变；当针对r124c的下游arms引物检测的δct≥5，则检测失败，重新检测；(3)当针对r555wt的下游arms引物检测的δct<5时，按照以下方法判断r555位点的型别：当针对r555w的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r555w杂合突变；当针对r555w的下游arms引物检测的δct≥5，则检测样本无r555w突变；当针对r555q的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r555q杂合突变；当针对r555q的下游arms引物检测的δct≥5，则检测样本无r555q突变；(4)当针对r555wt的下游arms引物检测的δct≥5时，按照以下方法判断r555位点的型别：
当针对r555w的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r555w纯合突变；当针对r555w的下游arms引物检测的δct≥5，则检测失败，重新检测；当针对r555q的下游arms引物检测的δct<5，则检测样本为r555q纯合突变；当针对r555q的下游arms引物检测的δct≥5，则检测失败，重新检测。

技术总结
本发明实施例涉及基因检测领域，具体涉及一种检测TGFBI基因突变的试剂盒。所述试剂盒包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂和第四反应体系试剂，第一反应体系试剂至第四反应体系试剂中包括：扩增引物和探针序列。本发明实施例中提供的检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个位点的试剂盒，利用ARMS-PCR的高特异性结合Tagman荧光定量PCR技术的高灵敏性，并优化出多重PCR扩增体系，通过四管反应，即可同时检测TGFBI基因R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L五个突变位点，操作简便、快速、准确性好，闭管操作，无PCR产物后续处理过程，大大降低了污染的发生。大大降低了污染的发生。大大降低了污染的发生。


技术研发人员：接英 田磊 张罗 潘志强 翟长斌 杨亚萍 张天赋
受保护的技术使用者：北京中因科技有限公司
技术研发日：2020.07.28
技术公布日：2022/2/6