一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽、制备方法与用途与流程

1.本发明属于抗菌肽领域，具体涉及一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽、制备方法与用途。


背景技术：

2.红蝎毒素又称芋螺毒素、芋螺抗皱素、芋螺肽、芋螺肉毒素等，是一款灵感来源于红蝎毒素、模拟芋螺毒素人工合成的功效可媲美botox的安全高效多肽，是一种高度折叠的胜肽，穿透力强，稳定性高，通过阻断神经肌肉的电流传导进而瞬间淡化皱纹，使肌肤回春看起来更年轻；能够有目标地针对肌肉达到放松的效果，具有非常强效的肌肉松弛作用，可以让使用者感受到即时、迅速的抗皱效果，广泛应用于抗皱产品中。红蝎毒素的氨基酸序列高度模拟snap-25蛋白c端序列，可与snap-25竞争形成不稳定的
“ꢀ
snare”复合蛋白，从而延缓神经递质信号的传递，影响肌肉收缩，达到安全管控表情纹的效果。而且红蝎毒素接枝具有抗菌性能的物质，可以使其在具有本身性能的同时兼具抗菌等其他性能。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种具有优良祛皱性、抗菌性，同时能够有效改善皮肤弹性、粗糙度以及角质层水分含量的抗菌肽，使其在化妆品领域具有广泛的应用。
4.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽的制备方法，包括：将μ-芋螺毒素、1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、缩合剂、dcc混合均匀，用dmf溶解完全后加入反应器中进行反应，洗涤，干燥，纯化，得到抗菌肽。
5.本发明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮缩合μ-芋螺毒素制得μ-芋螺毒素衍生物，该抗菌肽具有优良的抗菌性能，同时具有优良的祛皱性；除此之外，该抗菌肽能够改善皮肤的弹性、粗糙度，增加角质层的水分含量，具有较好的补水功效，进而达到祛皱、淡化细纹、改善皮肤的目的，在化妆品领域具有广泛的应用。
6.进一步地，需要说明地是，μ-芋螺毒素的氨基酸序列为arg-asp-cys-cys-thr-hyp-arg-lys-cys-lys-asp-arg-arg-cys-lys-hyp-met-lys-cys-cys-ala。
7.进一步地，需要说明地是，抗菌肽由1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮与μ-芋螺毒素缩合制得。
8.更进一步地，需要说明地是，按重量份计，1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮为0.5-3.5份、μ-芋螺毒素为60-90份。
9.进一步地，需要说明地是，一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽的制备方法，包括：按重量份计，将60-90份μ-芋螺毒素、0.5-3.5份1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、1.5-4.5份缩合剂、4-7份dcc混合均匀，用20-40份dmf溶解，完全后加入反应器中，室温反应5-8h，用0.1-0.2mol/l柠檬水溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤3-5遍，再用无水硫酸钠干燥25-35min，采用hplc纯化，流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为220-240nm，流
动相：a液为含0.1-0.2%tfa的水溶液，b液为含0.1-0.2% tfa的乙腈溶液，洗脱时间为30-40min，旋转蒸发除去体系中的乙腈和tfa，冷冻干燥，得到抗菌肽。
10.进一步地，需要说明地是，抗菌肽缩合所用缩合剂为hobt、hbtu、edci中的一种或几种混合。
11.本发明还公开了一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽。
12.本发明还公开了一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽在制备抗菌产品中的用途。
13.进一步地，抗菌肽在制备抗菌剂、护肤品或化妆品中的用途。
14.本发明还公开了一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽在制备改善皮肤弹性和/或粗糙度和/或角质层水分含量产品中的用途。
15.本发明还公开了1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮在提高抗菌肽祛皱性能中的用途。
16.本发明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮缩合μ-芋螺毒素制得μ-芋螺毒素衍生物，因而该抗菌肽具有如下有益效果：具有优良的抗菌性能，同时具有优良的祛皱性能；除此之外，该抗菌肽能够改善皮肤的弹性、粗糙度，增加角质层的水分含量，具有较好的补水功效，进而达到祛皱、淡化细纹、改善皮肤的目的，在化妆品领域具有广泛的应用。因此，本发明是一种具有优良祛皱性、抗菌性，同时能够有效改善皮肤弹性、粗糙度以及角质层水分含量的抗菌肽，使其在化妆品领域具有广泛的应用。
附图说明
17.图1为实施例1中μ-芋螺毒素与抗菌肽的红外光谱图；图2为抗菌肽的抑菌圈直径（a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10分别为阴性对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1）；图3为抗菌肽皮肤弹性的改善率（b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10分别为空白对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1）；图4为抗菌肽皮肤粗糙度的改善率（b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10分别为空白对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1）；图5为皮肤角质层水分含量的改善率（b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10分别为空白对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1）。
具体实施方式
18.在本发明的一些实施例中，为了进一步提高抗菌肽的祛皱性、抗菌性与改善皮肤的作用，采取的优选措施还包括：将制得的抗菌肽中氨基酸的侧链或n末端的氨基与表白桦脂酸进行反应，再进行纯化，得到抗菌肽衍生物。该抗菌肽衍生物具有更为优良的祛皱性能与抗菌性能，同时能够进一步改善皮肤弹性与皮肤粗糙度，进而达到祛皱、淡化细纹的作用。
19.进一步地，需要说明的是，抗菌肽衍生物的制备方法为：
按重量份，将60-80份抗菌肽、3.5-8.5份表白桦脂酸、3.5-7.5份缩合剂、8-15份dcc混合均匀，用35-75份dmf溶解，完全后加入反应器中，室温反应5-8h，用0.1-0.2mol/l的柠檬水溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤3-5遍，无水硫酸钠干燥30-60min后再进行纯化，纯化步骤同抗菌肽的制备方法。
20.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。
21.实施例1一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽的制备方法，包括：按重量份计，将76份μ-芋螺毒素（自制）、1.5份1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、2.5份hobt、5份dcc混合均匀，用25份dmf溶解，完全后加入反应器中，室温反应5h，用0.15mol/l柠檬水溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤3遍，再用无水硫酸钠干燥30min，采用hplc纯化，色谱柱为agilent zorbax sb-c18（4.6
×
150mm，5μm），流速为1.5ml/min，检测波长为240nm，流动相：a液为含0.15%tfa的水溶液，b液为含0.15%tfa的乙腈溶液，洗脱时间为30min，旋转蒸发除去体系中的乙腈和tfa，冷冻干燥，得到抗菌肽。
22.实施例2一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽的制备方法，与实施例1不同的是：按重量份计，将80份μ-芋螺毒素、2.5份1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮、3份edci、6.5份dcc混合均匀，用40份dmf溶解，完全加入反应器中。
23.实施例3一种衍生自红蝎毒素的抗菌肽的制备方法，与实施例1不同的是：采用hplc进行纯化，流速为1.5ml/min，检测波长为240nm，流动相：a液为含0.2%tfa的水溶液，b液为含0.1%tfa的乙腈溶液，洗脱时间为40min，旋转蒸发除去体系中的乙腈和tfa，冷冻干燥，得到抗菌肽。
24.实施例4一种抗菌肽衍生物的制备方法，包括：按重量份，将60份实施例1的抗菌肽、6.5份表白桦脂酸、4.5份edci、10份dcc混合均匀，用55份dmf溶解，完全后加入反应器中，室温反应8h，用0.15mol/l柠檬水溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤3遍，无水硫酸钠干燥50min，再进行纯化，纯化步骤同实施例1中抗菌肽的制备方法。
25.实施例5一种抗菌肽衍生物的制备方法，与实施例4不同的是：按重量份，将70份实施例1的抗菌肽、8.5份表白桦脂酸、7份edci、15份dcc混合均匀，用75份dmf溶解，完全后加入反应器中。
26.实施例6一种抗菌肽衍生物的制备方法，与实施例4不同的是：将实施例1的抗菌肽替换为实施例2的抗菌肽。
27.实施例7一种抗菌肽衍生物的制备方法，与实施例4不同的是：将实施例1的抗菌肽替换为实施例3的抗菌肽。
28.实施例8
一种μ-芋螺毒素衍生物的制备方法，包括：按重量份，将60份μ-芋螺毒素、6.5份表白桦脂酸、4.5份hobt、10份dcc混合均匀，用55份dmf溶解，完全后加入反应器中，室温反应8h，用0.15mol/l柠檬水溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤3遍，再用无水硫酸钠干燥50min，采用hplc纯化，色谱柱为agilent zorbax sb-c18（4.6
×
150mm，5μm），流速为1.5ml/min，检测波长为240nm，流动相：a液为含0.15%tfa的水溶液，b液为含0.15%tfa的乙腈溶液，洗脱时间为30min，旋转蒸发除去体系中的乙腈和tfa，冷冻干燥，得到抗菌肽。
29.对比例1将μ-芋螺毒素作为对比例1。
30.试验例1抗菌肽红外光谱的测定称取1.5mg与200mg纯溴化钾研磨至细粉，混匀后压片，置于红外光谱仪（ir prestige-21）中进行测试。
31.图1为实施例1中μ-芋螺毒素与抗菌肽的红外光谱图；曲线a、b分别为μ-芋螺毒素和抗菌肽；由图1可以看出，μ-芋螺毒素的红外光谱图中，在702.5cm-1
、538.7cm-1
附近出现的特征吸收峰为二硫键的伸缩振动，抗菌肽在3086.3cm-1
附近出现的特征吸收峰为苯环中c-h的伸缩振动，且在841.7附近特征吸收峰增强，此为苯环中c-h的面外弯曲振动峰叠加；由此可知，采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性成功制得抗菌肽。
32.试验例2抗菌肽祛皱性能的测定将正常肌细胞置于含1.5mmol/l l-谷氨酰胺、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素、5%胎牛血清培养基（2/3mem同1/3m199混合）中，在37℃、5%二氧化碳、明胶包被的平板中培养形成单层肌原纤维。将出生10d、具有背根神经节的小鼠胚胎脊髓外植体置于所述肌细胞单层上，共培养48h，可观察到从外植体生长出的神经突与肌细胞接触，100h后开始发生收缩。共培养4周后，神经和肌肉连接，形成神经肌肉接头充分成熟分化的横纹肌纤维模型，在这一阶段，肌原纤维可以进行规律的收缩。
33.培养模型中分别加入终浓度为0.5mmol/l的待检测的抗菌肽在1min、2h和48h时用显微镜观察并记录肌肉在30s内的收缩频率，取8次记录的平均值。不添加任何抗菌肽的培养模型作为空白对照。
34.表1 不同抗菌肽诱导肌肉收缩的次数组别1min2h48h空白对照组113108101实施例1900实施例21100实施例3800实施例4500实施例5700实施例6800
实施例7700实施例82120对比例13470由表1可以看出，加入抗菌肽1min后，实施例1-3诱导肌肉收缩的次数低于12次，在2h和48h后均未出现肌肉收缩；同对比例1、空白对照组相比，实施例1的肌肉收缩次数低于对比例1，并远低于空白对照组，这说明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性制得的抗菌肽，提高了μ-芋螺毒素控制肌肉收缩的能力，使其具有更高的活性以达到优良的抗皱效果；对比实施例1与实施例4、实施例2与实施例6、实施例3与实施例7、实施例8与对比例1可以看出，实施例4的肌肉收缩次数低于实施例1，实施例6的肌肉收缩次数低于实施例2，实施例7的肌肉收缩次数低于实施例3，实施例8的肌肉收缩次数低于对比例1，说明采用表白桦脂酸对抗菌肽进一步改性或采用表白桦脂酸对μ-芋螺毒素改性，进一步提高了μ-芋螺毒素的祛皱效果。
35.试验例3抗菌肽抗菌性能的测定将金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌和大肠杆菌的菌种涂布在lb固体培养基上，37℃培养24h，挑取活化菌种接种于含50ml lb液体培养基的培养瓶内，37℃振荡培养48h。
36.各取200μl无菌生理盐水配制的1
×
105cfu/ml菌悬液，均匀涂布在20ml固体培养基上，静置片刻后在培养皿适当位置放置3个牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，从牛津杯分别加入0.5ml 2.5mg/ml抗菌肽（0.5ml磷酸盐缓冲液作为阴性对照组），37℃培养24h，观察拍照并测量抑菌环直径。
37.图2为抗菌肽的抑菌圈直径。a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10分别为阴性对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1，由图2可以看出，实施例1-3中抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径高于17.5mm、对坚强芽孢杆菌的抑菌圈直径高于12mm、对大肠杆菌的抑菌圈直径高于17mm；同对比例1、阴性对照组相比，实施例1中抗菌肽对金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌与大肠杆菌的抑菌圈直径均远高于对比例1和阴性对照组，说明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性制得的抗菌肽具有优良的抗菌性能；实施例4-7中抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径高于22mm、对坚强芽孢杆菌的抑菌圈直径高于15.5mm、对大肠杆菌的抑菌圈直径高于21mm；对比实施例1与实施例4、实施例2与实施例6、实施例3与实施例7、实施例8与对比例1，实施例4中金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌与大肠杆菌的抑菌圈直径均高于实施例1，实施例6中抗菌肽对金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌与大肠杆菌的抑菌圈直径均高于实施例2，实施例7中金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌与大肠杆菌的抑菌圈直径均高于实施例3，实施例8中金黄色葡萄球菌、坚强芽孢杆菌与大肠杆菌的抑菌圈直径均高于实施例对比例1，说明采用表白桦脂酸对抗菌肽进一步改性或采用表白桦脂酸对μ-芋螺毒素改性进一步提高了μ-芋螺毒素的抗菌性能。
38.试验例4将含有20mm抗菌肽的眼霜与不含抗菌肽的空白基础眼霜作为试验样品。
39.选取健康志愿者30名，纳入标准：1）30-65岁（妊娠或哺乳期妇女除外）；2）眼部有明显干纹或皱纹；3）无严重系统疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病；4）无过敏性疾病；5）非
体质高度敏感者；6）近一个月未使用激素类药物及免疫抑制剂；7）现在或最近三个月受试部位未参加其他临床试验者。终止和剔除标准：1）因个人原因要求中止试验；2）产生不良反应以至无法继续试验；3）测试中使用其他对本试验有影响的护肤品等。
40.测试方法：30名志愿者，按随机双盲原则，选取左眼或右眼周围皮肤作为测试组，另一只眼周围皮肤作为空白对照组。每天早晚各用1次含抗菌肽的眼霜（空白对照组使用不含抗菌肽的空白眼霜），连续4周。试验期间不与其他祛皱护肤品同用。
41.每次测试前，受试者需用清水清洁眼部，使用不含荧光剂的纸巾擦干水分，在20-22℃、相对湿度40-60%的恒温恒湿环境下静坐至少20min，由测量人员进行测定；其中b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10分别为空白对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、对比例1。
42.基础眼霜的成分如表2所示：组分酥梨油神经酰胺乙基己基甘油pgd芦荟胶含量5ml2ml2ml1g0.5g（1）抗菌肽改善皮肤弹性的测试采用cutometer dual mpa 580皮肤弹性测试仪（德国ck公司）测试皮肤的弹性r2值（无负压时的皮肤回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近1，说明皮肤弹性越好），将4周后的弹性r2值与0周时的弹性r2值进行比较，皮肤弹性改善率的计算公式如下：弹性改善率（%）=（4周后的弹性r2值-0周时的弹性r2值）/0周时的弹性r2值
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100%图3为抗菌肽对皮肤弹性的改善率。可以看出，4周后，实施例1-3的皮肤弹性改善率高于15%，其中实施例1的皮肤弹性改善率高于对比例1，并远高于空白对照组，这说明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性制得的抗菌肽提高了μ-芋螺毒素对眼部皮肤弹性的改善率，使其具有较好的改善皮肤弹性的功效；实施例4-7的皮肤弹性改善率高于17%，其中实施例4的皮肤弹性改善率高于实施例1，实施例6的皮肤弹性改善率高于实施例2，实施例7的皮肤弹性改善率高于实施例3，实施例8的皮肤弹性改善率高于对比例1，说明采用表白桦脂酸对抗菌肽进一步改性或采用表白桦脂酸对μ-芋螺毒素改性进一步提高了μ-芋螺毒素对眼部皮肤弹性的改善率，达到了改善皮肤弹性的目的，使其在护肤产品中具有广泛的应用前景。
43.（2）抗菌肽改善皮肤粗糙度的测试采用primos皮肤快速三维成像系统测试志愿者左右眼周围皱纹皮肤的位置，记录粗糙度sa值；将4周后的sa值与0周时的sa值进行比较，皮肤粗糙度改善率的计算公式如下：皮肤粗糙度改善率（%）=（0周后的sa值-4周时的sa值）/0周时的sa值
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100%图4为抗菌肽对皮肤粗糙度的改善率。可以看出，4周后，实施例1-3的皮肤粗糙度改善率高于12.5%，其中实施例1的皮肤粗糙度改善率高于对比例1并远高于空白对照组，说明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性制得的抗菌肽，其提高了μ-芋螺毒素对皮肤粗糙度的改善率，使得皮肤光滑细致；实施例4-7的皮肤粗糙度改善率高于16%，其中实施例4的皮肤粗糙度改善率高于实施例1，实施例6的皮肤粗糙度改善率高于实施例2，实施例7的皮肤粗糙度改善率高于实施例3，实施例8的皮肤粗糙度改善率高于对比例1，说明采用表白桦脂酸对抗菌肽进一步改性或采用表白桦脂酸对μ-芋螺毒素改性进一步提高了μ-芋螺毒素对眼部皮肤粗糙度的改善率，达到了改善皮肤粗糙度的目的。
44.（3）皮肤角质层水分含量的测试采用msc1001角质层水分含量测试仪测试志愿者左右眼周固定区域位置，记录角质层水分含量值；将4周后的角质层水分含量值与0周时的角质层水分含量值进行比较，皮肤角质层水分含量改善率的计算公式如下：皮肤角质层水分含量改善率（%）=（4周后的角质层水分含量值-0周时的角质层水分含量值）/0周时的角质层水分含量值
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100%图5为抗菌肽对皮肤角质层水分含量的改善率。可以看出，4周后，实施例1-3的皮肤角质层水分含量改善率高于21.5%，其中实施例1的皮肤角质层水分含量改善率高于对比例1并远高于空白对照组，说明采用1-(4-氨基苯基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮对μ-芋螺毒素改性制得的抗菌肽提高了μ-芋螺毒素对眼部皮肤角质层水分含量的改善率，使其具有较好的提高角质层水分含量的作用即补功效；对比实施例1与实施例4、实施例2与实施例6、实施例3与实施例7、实施例8与对比例1，实施例4的皮肤角质层水分含量改善率与实施例1无明显区别，实施例6的皮肤角质层水分含量改善率与实施例2无明显区别，实施例7的皮肤角质层水分含量改善率与实施例3无明显区别，实施例8的皮肤角质层水分含量改善率与对比例1无明显区别，说明采用表白桦脂酸对抗菌肽进一步改性或采用表白桦脂酸对μ-芋螺毒素改性对眼部皮肤角质层水分含量的改善率无明显影响。
45.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
46.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。