用于修饰SCN9A或SCN10A基因的基因编辑系统及其使用方法与流程

用于修饰scn9a或scn10a基因的基因编辑系统及其使用方法
1.相关申请
2.本技术依据35 u.s.c.
§
119(e)要求2019年4月12日提交的美国临时申请号62/833,523的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文中。


背景技术：

3.基因编辑(包括基因组编辑)是一种类型的基因工程，其中在dna序列中，例如在靶向细胞的基因组中插入、缺失/或取代一个或多个核苷酸/核酸。最近利用rna引导的核酸内切酶(例如cas9)的基因编辑策略能够实现位点特异性dna修饰；然而，已经发现并非所有rna引导的核酸内切酶向导rna对高效地进行编辑。因此，仍然迫切需要鉴定有效地修饰所关注的基因的有效rna引导的核酸内切酶向导rna对。


技术实现要素：

4.本公开至少部分基于用于修饰电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(scn9a)或钠电压门控通道α亚基10(scn10a)的有效基因编辑系统的开发。在一些实施方案中，基因编辑系统依赖于对用于有效修饰电压门控钠通道基因而具有低脱靶发生率的有效rna引导的核酸内切酶和向导rna对(例如，本文所公开的那些)的鉴定。
5.因此，在一些方面，本公开涉及用于修饰电压门控钠通道基因，例如scn9a或scn10a的基因编辑系统。这种基因编辑系统可以包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码rna引导的dna核酸内切酶的第一核苷酸序列，或rna引导的dna核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导rna(grna)的第二核苷酸序列。
6.在一些实施方案中，基因编辑系统可以修饰scn9a基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码rna引导的dna核酸内切酶的第一核苷酸序列，或rna引导的dna核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导rna(grna)的第二核苷酸序列，其中所述grna包含seq id no:1-20中任一者的核苷酸序列。如本文所用的多核苷酸部分可以是独立的核酸分子。或者，多核苷酸部分可以是核酸分子的一部分，这部分可以含有一个或多个另外的多核苷酸部分。
7.这种基因编辑系统的rna引导的核酸内切酶可以是酿脓葡萄球菌(staphylococcus pyogenes)(spcas9)，它可以与包含seq id no:1-10中任一者的核苷酸序列的grna配对。或者或另外，这种基因编辑系统的rna引导的核酸内切酶可以是金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9(sacas9)，它可以与包含seq id no:11-20中任一者的核苷酸序列的grna配对。
8.在一些实施方案中，基因编辑系统可以修饰scn10a基因并且包含：(a)第一多核苷酸部分，所述第一多核苷酸部分包含编码rna引导的dna核酸内切酶的第一核苷酸序列，或rna引导的dna核酸内切酶；以及(b)第二多核苷酸部分，所述第二多核苷酸部分包含编码向导rna(grna)的第二核苷酸序列，其中所述grna包含seq id no:21-40中任一者的核苷酸序
列。这种基因编辑系统的rna引导的核酸内切酶可以是spcas9，它可以与包含seq id no:21-30中任一者的核苷酸序列的grna配对。或者或另外，这种基因编辑系统的rna引导的核酸内切酶可以是sacas9，它可以与包含seq id no:31-40中任一者的核苷酸序列的grna配对。
9.在一些实施方案中，(a)中编码rna引导的dna核酸内切酶的第一核苷酸序列还可以包含编码核定位信号(nls)的核苷酸序列，所述核苷酸序列与rna引导的dna核酸内切酶框内融合。在一些实施方案中，nls是sv40 nls。
10.在一些实施方案中，(b)中的第二核苷酸序列还可以包含支架序列。在一些实例中，支架序列可以由sacas9识别。这种支架序列可以包含核苷酸序列guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuu(seq id no:41)。在其它实例中，支架序列可以由spcas9识别。应了解，由于编码grna的第二核苷酸序列可以是dna序列或rna序列，因此这个序列中的任何尿嘧啶(u)都可以被胸腺嘧啶(t)置换。
11.在一些实施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的多核苷酸，其中至少一者可以是载体。载体可以是病毒载体，例如腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分是不同的aav载体。
12.在一些实施方案中，单个多核苷酸包含(a)的第一多核苷酸部分和(b)的第二多核苷酸部分。单个多核苷酸可以是载体，所述载体可以是病毒载体，例如aav载体。在一些实施方案中，aav是aav1。
13.在本公开的范围内还有核酸和病毒颗粒或病毒颗粒组，它们集合地包含本文所公开的任何基因编辑系统。在一些实施方案中，病毒颗粒或病毒颗粒组是一种或多种aav颗粒。
14.在其它方面，本公开涉及编辑电压门控钠通道基因，例如scn9a或scn10a的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：(i)本文所公开的任何基因编辑系统；(ii)包含基因编辑系统的核酸；或(iii)病毒颗粒或病毒颗粒组，它们集合地包含基因编辑系统。
15.在一些实施方案中，接触步骤通过向有需要的受试者施用(a)的基因编辑系统、(b)的核酸或(c)的一个或多个病毒颗粒来进行。在一些实施方案中，受试者是患有疼痛的人类患者。
16.在一些实施方案中，细胞是自体细胞。或者，细胞可以是异源细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，例如ipsc细胞或间充质干细胞。在一些实例中，所述方法还可以包括向有需要的受试者(例如，患有疼痛的人类患者)施用具有编辑基因的细胞。
17.在本公开的范围内还有本文所描述的任何基因编辑系统或其组分用于治疗疼痛的用途，以及其用于制造供预期医学治疗用的药剂的用途。
18.下文描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。本公开的其它特征或优点从若干实施方案的详细描述以及随附权利要求书将显而易见。
附图说明
19.以下图式构成本说明书的一部分并且包括在内以进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些图式中的一者或多者并结合本文所呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地了解这些方面。应了解，图式中说明的数据决不限制本公开的范围。
20.图1a-1d描绘了不同细胞模型中40个优先化grna的目标编辑效率。优先化grna包括(图1a)靶向scn9a的spcas9的十个grna，(图1b)靶向scn10a的spcas9的十个grna，(图1c)靶向scn9a的sacas9的十个grna，以及(图1d)靶向scn10a的sacas9的十个grna。这些grna在ipsc、稳定表达cas9的ipsc和源自ipsc的感觉神经元中筛选。值代表平均值
±
标准偏差。
具体实施方式
21.基因编辑(包括基因组编辑)是一种类型的基因工程，其中在dna序列中，例如在靶向细胞的基因组中插入、缺失/或取代一个或多个核苷酸/核酸。靶向基因编辑能够在靶向细胞的基因组中(例如，在靶向基因或靶向dna序列中)的预选位点处插入、缺失和/或取代。当例如通过一个或多个核苷酸/核酸的缺失、插入或取代来编辑内源基因的序列时，包含受影响序列的内源基因可能由于序列变异而被敲除或敲落。因此，靶向编辑可以用于破坏内源基因表达。或者或另外，可以将所需核酸插入dna序列中(例如，内源基因中)的靶位点中，称为靶向整合。“靶向整合”是指涉及插入一个或多个外源序列，而在插入位点处缺失或不缺失内源序列的过程。当存在含有外源序列的供体模板时，靶向整合可以由靶向基因编辑促成。
22.本公开至少部分基于用于修饰电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(scn9a)或钠电压门控通道α亚基10(scn10a)的有效基因编辑系统的开发。钠通道是形成通过细胞膜的离子通道的整合膜蛋白。电压门控钠通道是响应电压变化而“打开”(即，允许钠离子流过通道)的钠通道。钠通道的α亚基形成通道的核心并且独立发挥功能(即，在不存在任何相应的β亚基或其它辅助蛋白的情况下)。钠电压门控通道家族有九个成员。这些通道的α亚基是nav1.1、nav1.2、nav1.3、nav1.4、nav1.5、nav1.6、nav1.7、nav1.8和nav1.9，分别由scn1a、scn2a、scn3a、scn4a、scn5a、scn8a、scn9a、scn10a和scn11a编码。
23.nav1.7(由scn9a编码)例如在背根神经节、三叉神经节和交感神经节神经元中表达。nav1.8(由scn10a编码)例如在背根神经节中、在称为c纤维的无髓鞘小直径感觉神经元中表达。nav1.7和nav1.8两者都涉及伤害感受(即，提供导致疼痛感的信号的感觉机制)。
24.使用本文所描述的任何方法编辑scn9a和/或scn10a基因可以用于治疗、预防和/或减轻疾病和病症的症状，例如但不限于先天性疼痛不敏感、嗅觉丧失、仿佛人格、边缘型人格障碍、乳腺恶性肿瘤、非小细胞肺癌、寒冷耐受不良、热性惊厥、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、解离性障碍、癫痫、红斑肢痛症、原发性红斑肢痛症、面部疼痛、疱疹病毒科感染、遗传性感觉自主神经病5型、增生、神经痛、遗传性感觉和自主神经病、退行性多关节炎、疼痛、肢体疼痛、术后疼痛、帕金森病(parkinson disease)、带状疱疹后遗神经痛、前列腺肿瘤、瘙痒、癫痫发作、躯体形式障碍、烟草使用障碍、三叉神经痛、滑膜囊肿、慢性疼痛、急性发作型疼痛、先天性副肌强直(障碍)、萎靡、感觉不适、灼痛、疼痛淡漠、炎性痛、机械痛、头皮痛、遗传性运动和感觉神经病ii型、普通偏头痛、疼痛感缺失、前列腺恶性肿瘤、疼痛障碍、膝骨关节炎、神经病、复杂区域疼痛综合征、强直阵挛性癫痫发作、遗传性神经病、前列腺癌、乳腺癌、婴儿严重肌阵挛性癫痫发作、粘液样囊肿、通道病、阵发性极度疼痛障碍、疼痛性神经病、压迫性神经病、常染色体隐性先天性疼痛淡漠、全面性癫痫伴热性惊厥附加症2型、全面性癫痫伴热性惊厥附加症7、家族性热性惊厥3b和小纤维神经病(成年发作型称为小纤维神经病)。
25.已知scn9a基因的突变会导致疼痛知觉障碍，包括原发性红斑肢痛症、阵发性极度疼痛障碍、先天性疼痛不敏感和小纤维神经病。scn9a基因的功能获得性突变导致自发性疼痛，如在原发性红斑肢痛症和阵发性极度疼痛障碍中所观察到的。因此，在患有原发性红斑肢痛症或阵发性疼痛障碍的患者中scn9a基因的敲除或敲落可以用于治疗、预防和/或减轻相关症状。
26.原发性红斑性肢痛症是一种罕见的常染色体显性病症，所述病症的特征是脚部和手部因热和运动而出现灼痛。受影响的个体通常在幼儿期发展出体征和症状，但在较轻的病例中，症状可能在生命中的较后期出现。这种疾患的管理主要是对症的。除了避免疼痛触发因素(如热、锻炼和酒精)以外，治疗选项还包括冷却和抬高肢体、使用如利多卡因(lidocaine)和美西律(mexilitine)等麻醉剂，以及在极端情况下使用阿片类药物。
27.阵发性极度疼痛障碍是另一种罕见的病症，所述病症的特征是直肠、眼部和下颌区域中的严重发作性疼痛以及皮肤发红。这种疾患的症状常常在新生儿期或幼儿期开始，并且可能终生保持。用于治疗慢性神经病性疼痛障碍的剂常常用于减轻由疾病引起的疼痛发作。钠通道阻断剂卡马西平(carbamazepine)已经证明是这些治疗中最有效的。
28.已知scn10a基因的突变也会导致疼痛知觉障碍，包括家族性发作性疼痛综合征2型和小纤维神经病。因此，在患有家族性发作性疼痛综合征2型或小纤维神经病的患者中scn10a基因的敲除或敲落可以用于治疗、预防和/或减轻相关症状。
29.家族性发作性疼痛综合征2型是一种罕见的常染色体显性神经病症，所述病症的特征是足部区域中的阵发性疼痛的成年发作。发作一般由热、冷、化学物质和某些表面触发。患者还可能发展出触摸过敏反应和对疼痛刺激的反应升高。目前没有可用于这种疾病的治疗。保暖已经显示出缓解疼痛发作。
30.小纤维神经病是以严重疼痛发作和疼痛不敏感为特征的疾患。疼痛发作通常描述为麻木、刺痛或灼痛，或异常的皮肤感觉，如麻刺感或发痒。目前，小纤维外周神经病无法治愈。治疗选项包括静脉内免疫球蛋白(ivig)和血浆置换术。
31.如本文所描述，确定包含rna引导的核酸内切酶(例如，spcas9或sacas9)和特异性向导rna对的基因编辑系统的插入缺失率和插入缺失模式。本文所描述的基因编辑系统依赖于促进电压门控钠通道基因，例如scn9a或scn10a的有效修饰而具有低脱靶发生率的有效rna引导的核酸内切酶和向导rna对的特定对(例如，本文所公开的那些)的鉴定。
32.因此，本文提供了用于有效修饰电压门控钠通道基因的基因编辑系统及其用途。基因编辑系统的组分和应用基因编辑系统所产生的基因修饰的细胞也在本公开的范围内。
33.i.用于电压门控钠通道基因的基因修饰的基因编辑系统
34.在一些方面，本公开涉及用于修饰电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(scn9a)或钠电压门控通道α亚基10(scn10a)的基因编辑系统。“基因编辑系统”是指用于编辑靶基因(例如，scn9a或scn10a)的组分的组合，或用于产生这类组分的一种或多种剂。举例来说，基因编辑系统可以包含：(a)核酸酶，或用于产生这种酶的剂(例如，编码核酸酶的核酸)；和/或(b)向导rna(grna)，或用于产生这种grna的剂(例如，能够表达grna的载体)。
35.如本文所描述的基因编辑系统在修饰电压门控钠通道基因，例如scn9a或scn10a中可以展现一种或多种优势。举例来说，基因编辑系统将达成高基因编辑率，例如引起移码
的插入缺失率(例如，至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％，如通过本文所描述或本领域中已知的方法评估)或例如总插入缺失率(例如，至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％，如通过本文所描述或本领域中已知的方法评估)。此外，由本文所公开的基因编辑系统编辑的细胞相对于未编辑的对照可以具有高存活率(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)。
36.在一个示例性实施方案中，如本文所描述的基因编辑系统可以包含：(a)核酸内切酶(例如，rna引导的dna核酸内切酶)或产生此种酶的剂(例如，编码核酸内切酶的多核苷酸)；以及(b)grna或产生此种grna的剂(例如，用于表达grna的载体)。此外，本文所描述的任何基因编辑系统还可以包含编码供体模板的多核苷酸序列。在一些实例中，本文所描述的基因编辑系统包含核酸内切酶、grna和任选的供体模板。这种基因编辑系统可以包含提供供体模板并产生grna的一个多核苷酸。或者，基因编辑系统可以包含供体模板和单独的核酸，所述核酸可以是grna本身或产生grna的多核苷酸。在其它实例中，基因编辑系统可以包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸共同产生核酸内切酶、grna和任选的供体模板。在一些实例中，基因编辑系统可以包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码核酸内切酶的第一多核苷酸序列和编码grna的第二多核苷酸序列。或者，基因编辑系统可以包含两个多核苷酸：第一者包含编码核酸内切酶的第一多核苷酸序列，并且第二者包含编码grna的第二多核苷酸序列。
37.a.rna引导的核酸内切酶
38.rna引导的核酸内切酶是利用rna:dna碱基配对以靶向多核苷酸并使其裂解的酶。rna引导的核酸内切酶可以使单链多核酸或双链多核苷酸的至少一条链裂解。基因编辑系统可以包含一种rna引导的核酸内切酶。或者，基因编辑系统可以包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个)rna引导的核酸内切酶。
39.crispr-cas9系统是原核生物中天然存在的防御机制，所述机制已经重新意图作为用于基因编辑的rna引导的dna靶向平台。所述系统依赖于dna核酸酶cas9和两个非编码rna-crisprrna(crrna)和反式激活rna(tracrrna)-以靶向dna的裂解。crrna经由通常与靶dna中20个核苷酸(nt)的序列进行沃森-克里克碱基配对(watson-crick base pairing)来驱动crispr-cas9复合物的序列识别和特异性。改变crrna中5'20nt的序列允许crispr-cas9复合物靶向特异性基因座。crispr-cas9复合物仅结合含有与crrna的前20nt匹配的序列的dna序列，条件是靶序列之后是特异性短dna基序(具有序列ngg)，称为前间区序列邻近基序(pam)。tracrrna与crrna的3'端杂交形成rna双链体结构，所述结构与cas9核酸内切酶结合形成催化活性的crispr-cas9复合物，然后可以使靶dna裂解。
40.一旦crispr-cas9复合物在靶位点处结合至dna，cas9酶内的两个独立的核酸酶结构域各自使pam位点上游的dna链中的一条链裂解，留下双链断裂(dsb)，其中dna的两条链都以碱基对(平端)终止。
41.基因编辑系统可以包含crispr核酸内切酶(例如，crispr相关蛋白9或cas9核酸
酶)。在一些实施方案中，核酸内切酶来自金黄色链球菌(streptococcus aureus)(例如，sacas9)或酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)(例如，spcas9)，但可以使用其它crispr同源物。应了解，cas9可以被本领域中已知的另一种rna引导的核酸内切酶，例如cpf1取代。最后，应了解，可以使用野生型rna引导的核酸内切酶或可以使用修饰型式(例如，cas9、cas9直向同源物、cas9嵌合/融合蛋白或其它cas9功能变体的进化型式)。举例来说，在一些实施方案中，对rna引导的核酸内切酶进行修饰以包含核定位信号(nls)，例如sv40 nls或核质蛋白(nucleoplasmine)nls。其它核定位信号的实例是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，nls包括sv40 nls和核质蛋白nls。
42.b.向导rna
43.本公开提供了基因组靶向核酸或用于产生这种核酸的剂(例如，包含编码grna的核苷酸序列的多核苷酸)，它可以将相关多肽(例如，rna引导的核酸内切酶)的活性导向靶核酸内的特异性靶序列。基因组靶向核酸可以是rna。基因组靶向rna在本文中称为“向导rna”或“grna”。在一些实施方案中，基因编辑系统包含一个grna。在其它实施方案中，基因编辑系统包含至少两个grna(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个grna)。
44.基因编辑系统的grna可以按合成形式提供。举例来说，向导rna可以通过化学方式合成，如下文所说明和本领域中所描述。虽然化学合成程序不断扩大，但随着多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸，通过如高效液相色谱法(避免使用凝胶，例如page)等程序纯化这类rna往往变得更具挑战性。用于产生长度更长的rna的一种方法是产生两个或更多个接合在一起的分子。长得多的rna更容易通过酶促产生。可以在化学合成和/或酶促产生rna期间或之后引入各种类型的rna修饰，例如，增强稳定性、降低先天免疫反应的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如本领域中所描述。
45.或者，基因编辑系统可以包含用于产生grna的剂。举例来说，基因编辑系统可以包含编码grna的核苷酸序列的核苷酸序列和促进grna表达/产生的另外的核苷酸序列。
46.grna可以是双分子向导rna。双分子grna包含rna的两条链。第一链可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和包含最小crispr重复序列的支架序列。第二链包含最小tracrrna序列(与最小crispr重复序列互补)、3'tracrrna序列和任选的tracrrna延伸序列。
47.或者，grna可以是包含间隔区序列和支架序列的单分子向导rna(sgrna)。支架序列可以包含如本文所描述的tracrrna序列。sgrna(例如，在ii型系统中)可以在5'至3'方向上包含任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小crispr重复序列、单分子向导接头、最小tracrrna序列、3'tracrrna序列和任选的tracrrna延伸序列。任选的tracrrna延伸可以包含对向导rna贡献另外的功能性(例如，稳定性)的元件。单分子向导接头将最小crispr重复和最小tracrrna序列连接形成发夹结构。任选的tracrrna延伸包含一个或多个发夹。或者，sgrna(例如，在v型系统中)可以在5'至3'方向上包含最小crispr重复序列和间隔区序列。
48.单分子grna可以在grna序列的3'端不包含尿嘧啶。或者，grna可以在grna序列的3'端包含一个或多个尿嘧啶。举例来说，grna可以在grna序列的3'端包含1个尿嘧啶(u)。grna可以在grna序列的3'端包含2个尿嘧啶(uu)。grna可以在grna序列的3'端包含3个尿嘧啶(uuu)。grna可以在grna序列的3'端包含4个尿嘧啶(uuuu)。grna可以在grna序列的3'端
包含5个尿嘧啶(uuuuu)。grna可以在grna序列的3'端包含6个尿嘧啶(uuuuuu)。grna可以在grna序列的3'端包含7个尿嘧啶(uuuuuuu)。grna可以在grna序列的3'端包含8个尿嘧啶(uuuuuuuu)。
49.应进一步了解，上文所描述的grna的核苷酸可以在任何核苷酸位置处包含修饰的核酸。因此，grna可以是未修饰的或修饰的。举例来说，修饰的grna可以包含一个或多个2'-o-甲基硫代磷酸酯核苷酸。另外的修饰的核酸的实例是本领域技术人员已知的。参见例如wo2018007976和wo2018007980，各自的相关公开内容出于本文所提及的目的和/或主题以引用的方式并入。
50.(i)grna间隔区
51.如本领域普通技术人员所了解，设计每个grna以包括与其基因组靶序列互补的间隔区序列。参见jinek等,science,337,816-821(2012)和deltcheva等,nature,471,602-607(2011)。间隔区序列是定义所关注的靶核酸的靶序列(例如dna靶序列，如基因组靶序列)的核苷酸序列。grna可以包含在grna序列的5'端具有17-30个核苷酸的可变长度间隔区序列。在一些实施方案中，间隔区序列是15至30个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区序列是15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区序列是20个核苷酸。
[0052]“靶序列”与pam序列相邻并且是由rna引导的核酸酶(例如，cas9)修饰的序列。“靶核酸”是双链分子：一条链包含靶序列并称为“pam链”，并且另一条互补链称为“非pam链”。本领域技术人员认识到，grna间隔区序列与位于所关注的靶核酸的非pam链中的靶序列的反向互补序列杂交。因此，grna间隔区序列是靶序列的rna等价物。举例来说，如果靶序列是5
′‑
agagcaacagtgctgtggcc-3
′
(seq id no:498)，那么grna间隔区序列是5
′‑
agagcaacagugcuguggcc-3
′
(seq id no:499)。grna的间隔区经由杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与所关注的靶核酸相互作用。因此，间隔区的核苷酸序列取决于所关注的靶核酸的靶序列而变化。
[0053]
设计间隔区序列以与位于系统中使用的cas9酶的pam 5'的靶核酸区域杂交。间隔区可能与靶序列完美匹配或可能有错配。每个cas9酶具有在靶dna中所识别的特定pam序列。举例来说，酿脓链球菌(s.pyogenes)cas9在靶核酸中识别包含序列5'-nrg-3'的pam，其中r包含a或g，其中n是任何核苷酸并且n紧邻间隔区序列靶向的靶核酸序列的3'。酿脓链球菌cas9的典型pam是5'-ngg-3'，但如前一句所指示，酿脓链球菌cas9也可以识别非典型pam5'-nag-3'。类似地，对于金黄色葡萄球菌(s.aureus)cas9，pam包含序列5'-nngrrt-3'。
[0054]
在一些实施方案中，靶核酸序列包含20-22个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸包含少于20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸包含多于20个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸序列包含紧邻pam的第一个核苷酸的5'的20-22个碱基。举例来说，在包含5'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnrg-3'(seq id no:489)或5'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngrrt-3'(seq id no:490)的序列中，靶核酸包含对应于没有下划线的n的序列，其中n是任何核苷酸，并且加下划线的nrg序列和nngrrt序列分别是酿脓链球菌pam和金黄色葡萄球菌pam。
[0055]
在一些实施方案中，本文所用的grna可以包含20个核苷酸的间隔区序列。在一些实施方案中，这种grna与spcas9一起使用。在其它实施方案中，本文所用的grna可以包含22个核苷酸的间隔区序列。在一些实施方案中，这种grna与sacas9一起使用。
[0056]
在一些实施方案中，本文所用的grna可以包含表1-4中所列的间隔区序列。在一些实例中，本文所用的grna可以包含表1中所列的间隔区序列与spcas9组合用于编辑scn9a。在一些实例中，本文所用的grna可以包含表2中所列的间隔区序列与sacas9组合用于编辑scn9a。在一些实例中，本文所用的grna可以包含表3中所列的间隔区序列与spcas9组合用于编辑scn10a。在一些实例中，本文所用的grna可以包含表4中所列的间隔区序列与sacas9组合用于编辑scn10a。这些grna中的任一者可以包含表1和表3中的任一者中所列的间隔区序列(与spcas9酶组合)，具有大于40％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更高)的平均总插入缺失百分比和/或大于40％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％或更高)的引起移码的平均插入缺失百分比。或者，这些grna中的任一者可以包含表2和表4中的任一者中所列的间隔区序列(与sacas9酶组合)，具有大于15％(例如，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或更高)的平均总插入缺失百分比和/或大于15％(例如，20％、25％、30％、35％、40％、45％或更高)的引起移码的平均插入缺失百分比。
[0057]
示例性grna可以包含以下间隔区序列之一：
[0058]
·
caauuugggugguaccugau(seq id no:1)；
[0059]
·
gcuucgccuugcagaaaaca(seq id no:2)；
[0060]
·
gccuaugcccuucgacacca(seq id no:3)；
[0061]
·
auaggcgagcacaugaaaag(seq id no:4)；
[0062]
·
cggcugaauauacaaguauu(seq id no:5)；
[0063]
·
ggaacaccacccaaugacug(seq id no:6)；
[0064]
·
caggccugaagacaauugua(seq id no:7)；
[0065]
·
ggaauguccccauagaugaa(seq id no:8)；
[0066]
·
ccaccaaugcugccggugaa(seq id no:9)；
[0067]
·
cagucaccacucagcauucg(seq id no:10)；
[0068]
·
aagcagaauuaugggccucuca(seq id no:11)；
[0069]
·
gccuugcagaaaacaaggagcc(seq id no:12)；
[0070]
·
acgacaaaauccagccaguucc(seq id no:13)；
[0071]
·
cugggaaaaccuuuaccaacag(seq id no:14)；
[0072]
·
ucccaaccucagacagagagca(seq id no:15)；
[0073]
·
gauguuacugcugcgucgcucc(seq id no:16)；
[0074]
·
caugauccugacuguguucugu(seq id no:17)；
[0075]
·
cucguguguagucaguguccag(seq id no:18)；
[0076]
·
aaacugauugccauggauccau(seq id no:19)；
[0077]
·
agaaaacaaggagccacgaaug(seq id no:20)；
[0078]
·
gcuccccgaucaguucugcu(seq id no:21)；
[0079]
·
uguagucaccauggcguaug(seq id no:22)；
[0080]
·
ggaagcuccgcagcacagac(seq id no:23)；
[0081]
·
uccuuacaaccagcgcagga(seq id no:24)；
[0082]
·
acuucugaccccuuacugug(seq id no:25)；
[0083]
·
gagcucccagcagaacugau(seq id no:26)；
[0084]
·
ccgagacaucgacagcucca(seq id no:27)；
[0085]
·
auccguucuacagcacacac(seq id no:28)；
[0086]
·
ucacguaccugagagauccu(seq id no:29)；
[0087]
·
cgcaggugcuagcagcacua(seq id no:30)；
[0088]
·
cccuggagcugucgaugucucg(seq id no:31)；
[0089]
·
uagauccguucuacagcacaca(seq id no:32)；
[0090]
·
agugagaggaaagcccaagcaa(seq id no:33)；
[0091]
·
accuuuccgggcccaaagggca(seq id no:34)；
[0092]
·
cuuugacugcaucaucgucacu(seq id no:35)；
[0093]
·
cacuucuucuggaaauaauagu(seq id no:36)；
[0094]
·
auuuuagcgucauuacccuggc(seq id no:37)；
[0095]
·
aacaacuuccgucgcuuuacuc(seq id no:38)；
[0096]
·
gccgagauaucucacucccuga(seq id no:39)；
[0097]
·
ugguguucaucuucuccaugcc(seq id no:40)。
[0098]
(ii)grna支架
[0099]
在一些实施方案中，grna还包含支架序列。支架序列可以包含最小crispr重复序列、单分子向导接头、最小tracrrna序列、3'tracrrna序列和/或任选的tracrrna延伸序列的序列。各种crispr蛋白的示例性支架序列是本领域普通技术人员已知的。
[0100]
支架序列的选择可以取决于将在如本文所用的基因编辑系统中使用的rna引导的dna核酸内切酶，例如，本领域技术人员已知的sacas9或spcas9。举例来说，如果要使用spcas9，那么可以选择spcas9可识别的支架序列。spcas9支架序列的实例是本领域中已知的。参见例如zhang等,plant mol biol.2018；96(4):445-456；www.addgene.org。单分子向导rna中的一个示例性支架序列可以包含核苷酸序列gtttaagagctatgctggaaacagcatagcaagtttaaataaggctagtcc gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(seq id no:42)。
[0101]
或者，如果要使用sacas9核酸内切酶，那么可以选择sacas9可识别的支架序列。sacas9的单分子向导rna中的支架序列可以包含核酸序列guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuu(seq id no:41)。单分子向导rna还可以包含任选的间隔区延伸。
[0102]
应了解，由于编码grna的核苷酸序列可以是dna序列或rna序列，因此描述grna的序列中的任何尿嘧啶(u)都可以被胸腺嘧啶(t)置换。同样地，在指代grna的序列中的任何t(胸腺嘧啶)在rna分子的情形中将指代u(或尿嘧啶)。本文中含有t(胸腺嘧啶)的序列将涵盖dna分子和rna分子两者(其中t是指u)。
[0103]
(iii)示例性rna引导的核酸内切酶-grna对
[0104]
在一些实施方案中，基因编辑系统依赖于对用于有效修饰电压门控钠通道基因的有效rna引导的核酸内切酶向导rna对(例如，本文所公开的那些)的鉴定。
[0105]
举例来说，用于修饰钠电压门控通道α亚基9(scn9a)基因的基因编辑系统可以包
含酿脓葡萄球菌(spcas9)和包含seq id no:1-10中任一者的核苷酸序列的grna。或者或另外，用于修饰钠电压门控通道α亚基9(scn9a)基因的基因编辑系统可以包含金黄色葡萄球菌(sacas9)和包含seq id no:11-20中任一者的核苷酸序列的grna。
[0106]
在另一个实例中，用于修饰钠电压门控通道α亚基10(scn10a)基因的基因编辑系统可以包含spcas9和包含seq id no:21-30中任一者的核苷酸序列的grna。或者或另外，用于修饰钠电压门控通道α亚基10(scn10a)基因的基因编辑系统可以包含sacas9和包含seq id no:31-40中任一者的核苷酸序列的grna。
[0107]
(iv)核糖核蛋白复合物
[0108]
在一些情况下，本文所公开的基因编辑系统可以包含核糖核蛋白复合物(rnp)，其中grna和核酸酶(例如，如上文所描述)形成复合物。如本文所用，术语“核糖核蛋白”或“rnp”是指结构上与核酸(dna或rna)相关联的蛋白质。举例来说，在一些实施方案中，基因编辑系统的cas9 rna引导的核酸内切酶和grna呈rnp形式。
[0109]
c.供体模板
[0110]
供体模板包含将插入dna序列中(例如，内源基因中)的靶位点处的核酸序列。基因编辑系统的供体模板可以按合成形式提供。或者，基因编辑系统可以包含用于产生供体模板的剂(例如核酸，如载体)。举例来说，基因编辑系统可以包含用于产生供体模板的核酸(例如，载体)。
[0111]
供体模板可以包含一个或多个同源臂以允许在所关注的基因组位置处进行有效的同源依赖性重组(hdr)。同源臂的长度可能有变化。举例来说，同源臂的长度可以是至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、至少950个或至少1000个核苷酸。同样地，同源臂的长度可以是50至100个、50至200个、50至300个、50至400个、50至500个、50至600个、50至700个、50至800个、50至900个、50至1000个、100至200个、100至300个、100至400个、100至500个、100至600个、100至700个、100至800个、100至900个、100至1000个、200至300个、200至400个、200至500个、200至600个、200至700个、200至800个、200至900个、200至1000个、300至400个、300至500个、300至600个、300至700个、300至800个、300至900个、300至1000个、400至500个、400至600个、400至700个、400至800个、400至900个、400至1000个、500至600个、500至700个、500至800个、500至900个、500至1000个、600至700个、600至800个、600至900个、600至1000个、700至800个、700至900个、700至1000个、800至900个、800至1000个或900至1000个核苷酸。特别地，同源臂的长度可以是500个核苷酸。
[0112]
举例来说，在一些实施方案中，供体模板包含5'同源臂(即，位于第一核苷酸序列上游)和3'同源臂(即，位于第一核苷酸序列下游)，其中5'同源臂包含与所关注的基因组位置上游的区域同源的核酸序列，并且其中3'同源臂包含与所关注的基因组位置下游的区域同源的核酸序列。
[0113]
在其它实施方案中，供体模板可以包含5'同源臂并且缺乏3'同源臂。在其它实施方案中，供体模板可以包含3'同源臂并且缺乏5'同源臂。
[0114]
或者，供体模板可能缺乏同源臂。举例来说，在一些情况下，供体模板可以在靶位点处裂解后通过nhej依赖性末端连接进行整合。
[0115]
供体模板还可以包含编码所关注基因或其部分(例如，scn9a、scn10a或其部分)的多核苷酸序列。或者或另外，供体模板可以包含编码调控元件(例如，scn9a或scn10a的调控元件)的多核苷酸序列。
[0116]
供体模板可以是单链和/或双链的dna或rna，并且可以按线性或环状形式引入细胞中。如果以线性形式引入，供体序列的末端可以通过本领域技术人员已知的方法加以保护(例如，免于核酸外切降解)。举例来说，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'端和/或将自互补寡核苷酸接合至一端或两端。参见例如chang等,(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:4959-4963；nehls等,(1996)science 272:886-889。用于保护外源多核苷酸免于降解的另外的方法包括但不限于添加一个或多个末端氨基以及使用修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和o-甲基核糖或脱氧核糖残基。
[0117]
可以将供体模板引入细胞中作为载体分子的一部分，所述载体分子具有另外的序列，例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体模板可以作为裸核酸、作为与如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)等剂复合的核酸引入，或者可以由病毒(例如，腺病毒、aav、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(idlv))递送。
[0118]
在一些实施方案中，插入供体模板以使其表达由内源启动子驱动，例如驱动供体所插入的内源基因表达的启动子。
[0119]
此外，外源序列还可以包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2a肽和/或聚腺苷酸化信号的序列。
[0120]
应了解，上文所描述的供体模板的核苷酸可以在任何核苷酸位置处包含修饰的核酸。
[0121]
d.基于病毒载体/病毒颗粒的基因编辑系统
[0122]
在一些实施方案中，本文所公开的基因编辑系统可以包含多核酸(例如载体，如病毒载体)或包含这类多核酸的病毒颗粒。一个或多个多核酸产生用于编辑如本文所描述的电压门控钠通道基因的组分(例如，核酸酶和grna)。
[0123]
在一些实例中，基因编辑系统包含能够产生基因编辑系统的所有组分(包括核酸酶和grna)的一个多核酸。在其它实例中，基因编辑系统包含两个多核酸，一者编码核酸酶并且另一者编码grna。
[0124]
核酸(或核酸组中的至少一个核酸)可以是载体，例如病毒载体，如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体和单纯疱疹病毒(hsv)载体。
[0125]
在一些实例中，基因编辑系统可以包含一个或多个病毒颗粒，所述病毒颗粒携带用于产生如本文所公开的基因编辑系统的组分的基因材料。病毒颗粒(例如，aav颗粒)可以包含基因编辑系统(例如，如本文所描述)的一种或多种组分(或用于产生一种或多种组分的剂)。病毒颗粒(或病毒粒子)包含编码病毒基因组的核酸和蛋白质的外壳(即，衣壳)。在一些情况下，病毒颗粒还包含包围蛋白质外壳的脂质包膜。
[0126]
在一些实例中，病毒颗粒包含能够产生基因编辑系统的所有组分(包括核酸酶和grna)的多核酸。在其它实例中，病毒颗粒包含能够产生基因编辑系统的一种或多种组分的多核酸。举例来说，病毒颗粒可以包含能够产生核酸酶的多核酸。或者，病毒颗粒可以包含能够产生grna的多核酸。
[0127]
本文所描述的病毒颗粒可以来源于本领域中已知的任何病毒颗粒，包括但不限于
逆转录病毒颗粒、腺病毒颗粒、腺相关病毒(aav)颗粒或单纯疱疹病毒(hsv)颗粒。在一些实施方案中，病毒颗粒是aav颗粒。在一些实施方案中，aav颗粒是aav1颗粒。
[0128]
在一些实施方案中，病毒颗粒组包含多于一个基因编辑系统。在一些实施方案中，病毒颗粒组中的每个病毒颗粒是aav颗粒。在其它实施方案中，病毒颗粒组包含多于一种类型的病毒颗粒(例如，逆转录病毒颗粒、腺病毒颗粒、腺相关病毒(aav)颗粒或单纯疱疹病毒(hsv)颗粒)。
[0129]
e.另外的示例性基因编辑系统
[0130]
另外，本文所公开的基因编辑系统可以包含如本文所公开的核酸酶(例如，cas9酶)。这种基因编辑系统还可以包含grna。核酸酶和grna可以形成用于递送的rnp。此外，基因编辑系统还可以包含grna和用于产生供体模板的多核酸(例如载体，如本文所描述的那些)。核酸酶和grna可以形成rnp复合物。或者，基因编辑系统还可以包含用于产生grna和供体模板的一个或多个多核酸。
[0131]
或者，本文所公开的基因编辑系统可以包含用于产生核酸酶的剂，例如表达载体，例如能够表达核酸酶的如本文所公开的病毒载体。这种基因编辑系统还可以包含grna或用于产生这种grna的剂。
[0132]
包含用于修饰电压门控钠通道基因的如本文所公开的组分或产生这类组分的剂的基因编辑系统的任何其它形式都在本公开的范围内。
[0133]
ii.编辑电压门控钠通道基因的方法
[0134]
在一些方面，本公开涉及使用本文所公开的任何基因编辑系统编辑电压门控钠通道基因，例如钠电压门控通道α亚基9(scn9a)或钠电压门控通道α亚基10(scn10a)的方法。编辑事件可以在钠电压门控通道(例如，scn9a或scn10a)中引入突变或校正突变。基因(例如，scn9a或scn10a)的一个或多个拷贝(即，等位基因)可以被校正和/或突变。
[0135]
编辑电压门控钠通道基因的方法可以包括使细胞与以下接触：如本文所描述的基因编辑系统；包含如本文所描述的基因编辑系统的病毒颗粒或病毒颗粒组；和/或包含如本文所描述的基因编辑系统的核酸或核酸组。举例来说，这些方法可以对存在于活受试者内(例如，体内)的一个或多个细胞进行。或者或另外，这些方法可以对存在于培养物中(例如，离体)的一个或多个细胞进行。在一些情况下，然后向受试者施用在培养物中编辑的细胞(本文中归类为“基于细胞的疗法”)。
[0136]
a.递送方法
[0137]
细胞(或受试者)与基因编辑系统、病毒颗粒或病毒颗粒组和/或核酸或核酸组的接触可以经由各种递送方法进行。举例来说，核酸酶和/或grna可以使用载体系统递送，包括但不限于质粒载体、dna微环、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体，以及它们的组合。
[0138]
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于在细胞中引入编码核酸酶和grna的核酸。非病毒载体递送系统包括dna质粒、dna微环、裸核酸以及与如脂质体或泊洛沙姆等递送运载体复合的核酸。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，所述病毒在递送至细胞后具有游离基因组或整合基因组。
[0139]
核酸的非病毒递送方法包括但不限于电穿孔、脂质转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸dna、裸rna、加帽rna、人工病毒
20％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-80％、5％-90％、10％-20％、10％-30％、10％-40％、10％-50％、10％-60％、10％-70％、10％-80％、10％-90％、20％-30％、20％-40％、20％-50％、20％-60％、20％-70％、20％-80％、20％-90％、30％-40％、30％-50％、30％-60％、30％-70％、30％-80％、30％-90％、40％-50％、40％-60％、40％-70％、40％-80％、40％-90％、50％-50％、50％-70％、50％-80％或50％-90％。
[0153]
在其它实施方案中，本公开的基因编辑的细胞相对于未编辑的对照展现增加的电压门控钠通道活性(例如，增加至少30％、50％、100％、2倍、5倍或10倍)。举例来说，nav1.7和/或nav1.8活性的水平相对于未编辑的对照细胞可以增加至少30％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％。在一些实施方案中，nav1.7和/或nav1.8活性的水平相对于未编辑的对照细胞可以增加30％-50％、30％-100％、30％-200％、30％-500％、30％-1000％、50％-100％、50％-200％、50％-500％、50％-1000％、100％-200％、100％-500％、100％-1000％、200％-500％、200％-1000％或500％-1000％。
[0154]
在一些实施方案中，可以进行患者外周神经的活检。可以从患者的皮肤或腿部分离神经组织。然后，从活检材料中分离外周神经系统的细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞(schwann cell)或神经节中的卫星神经胶质细胞)。然后，可以使用本文所描述的材料和方法编辑外周神经系统细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)的染色体dna。最后，将外周神经系统的编辑细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)植入患者体内。任何来源或类型的细胞都可以用作祖细胞。
[0155]
在其它实施方案中，可以创造患者特异性诱导多能干细胞(ipsc)。然后，可以使用本文所描述的材料和方法编辑这些ipsc细胞的染色体dna。接下来，基因组编辑的ipsc可以分化为外周神经系统的细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)。最后，将外周神经系统的分化细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)植入患者体内。
[0156]
或者，可以从患者分离间充质干细胞，所述间充质干细胞可以从患者的骨髓或外周血中分离。接下来，可以使用本文所描述的材料和方法编辑这些间充质干细胞的染色体dna。接下来，基因组编辑的间充质干细胞可以分化为外周神经系统的细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)。最后，将外周神经系统的分化细胞(例如神经元或神经胶质细胞，如神经中的许旺细胞或神经节中的卫星神经胶质细胞)植入患者体内。
[0157]
可以向受试者施用任何基因编辑的细胞。施用步骤可以包括通过使引入的细胞至少部分定位于所需部位的方法或途径将基因工程细胞放置(例如，移植)于受试者体内，从而产生一种或多种所需作用并且其中至少一部分植入的细胞或细胞的组分保持存活。向受试者施用后细胞的存活期可以短至几小时，例如二十四小时，至几天，至长达数年，或甚至受试者的寿命，即，长期植入。在一些实施方案中，向受试者的呼吸道施用。
[0158]
施用模式包括注射、输注、滴注或摄入。注射包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，途径是静脉内。
[0159]
在一些实施方案中，全身施用基因工程细胞，这是指以除了直接施用于靶部位、组
织或器官以外的方式施用细胞群体，从而替代地使其进入受试者的循环系统并且因此经受代谢和其它类似过程。
[0160]
为了用于本文所描述的各个方面，有效量的基因工程细胞包括至少102个细胞、至少5x102个细胞、至少103个细胞、至少5x103个细胞、至少104个细胞、至少5x104个细胞、至少105个细胞、至少2x105个细胞、至少3x105个细胞、至少4x105个细胞、至少5x105个细胞、至少6x105个细胞、至少7x105个细胞、至少8x105个细胞、至少9x105个细胞、至少1x106个细胞、至少2x106个细胞、至少3x106个细胞、至少4x106个细胞、至少5x106个细胞、至少6x106个细胞、至少7x106个细胞、至少8x106个细胞、至少9x106个细胞，或它们的倍数。在本文所描述的一些实例中，细胞在向有需要的受试者施用前在培养物中扩增。
[0161]
(ii)体内基因疗法
[0162]
或者，本文所公开的基因编辑方法和材料可以应用于在体内对靶基因(scn9a或scn10a)进行基因修饰。可以使用本文所描述的材料和方法编辑患者中的细胞的染色体dna。在一些方面，基于体内的疗法中的靶细胞可以是外周神经系统的神经元。
[0163]
尽管某些细胞呈递离体治疗和疗法的有吸引力的标靶，但递送效率的增加可以允许直接体内递送至这类细胞。理想地，靶向和编辑将针对相关细胞。通过靶向递送和/或使用仅在某些细胞中和或发育阶段有活性的启动子也可以防止其它细胞中的裂解。另外的启动子是可诱导的，并且因此如果核酸酶作为质粒递送，那么所述启动子可以在时间上受到控制。也可以使用治疗或为了改变半衰期所添加的结构域来调整递送的rna和蛋白质留在细胞中的时间量。体内治疗将消除许多治疗步骤，但较低的递送速率可能需要较高的编辑速率。体内治疗可以消除离体治疗以及神经元和神经胶质细胞适当植入和植入后整合至现有脑回路中所致的问题和损失。
[0164]
在一些方面，本公开涉及向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的基因编辑系统、包含如本文所描述的基因编辑系统的病毒颗粒或病毒颗粒组、包含如本文所描述的基因编辑系统的核酸或核酸组、或如本文所描述的编辑细胞的组合物的方法。
[0165]
受试者可以是需要诊断、治疗或疗法的任何受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是患有疼痛的人类患者。在一些实施方案中，人类患者是儿童。
[0166]
有效量是指预防或减轻医学疾患(即，疼痛)的至少一种或多种体征或症状所需的基因编辑系统、包含基因编辑系统的病毒颗粒或病毒颗粒组、包含基因编辑系统的核酸或核酸组、或基因工程细胞群体的量，并且涉及足以提供所需作用(即，治疗患有疼痛的受试者)的组合物的量。有效量还包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)、或逆转疾病症状的量。应了解，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可以使用常规实验确定适当的有效量。
[0167]
包含用于治疗医学疾患的组合物的治疗的功效可以由熟练的临床医师确定。如果体征或症状中的任一者或全部，例如功能标靶的水平以有益的方式改变(例如，增加至少10％)，或疾病的其它临床上接受的症状或标志(例如，疼痛)得到改进或改善，那么治疗被视为“有效治疗”。还可以通过受试者不会经历如以住院治疗或需要医疗干预所评估的恶化(例如，中断或至少减缓疾病的进展)来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对受试者疾病的任何治疗并且包括：(1)抑制疾病，例
approach(d.catty.编,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd和c.dean编,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow和d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti和j.d.capra编,harwood academic publishers,1995)；dna cloning:a practical approach,第i卷和第ii卷(d.n.glover编,1985)；nucleic acid hybridization(b.d.hames和s.j.higgins编(1985)；transcription and translation(b.d.hames和s.j.higgins编(1984)；animal cell culture(r.i.freshney编(1986)；immobilized cells and enzymes(lrl press,(1986)；以及b.perbal,a practical guide to molecular cloning(1984)；f.m.ausubel等(编)。
[0176]
在未进一步详述的情况下，据信本领域技术人员可以基于上述描述在最大程度上利用本公开。因此，以下具体实施方案应解释为仅具有说明性，并且无论如何都不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文引用的所有出版物都以引用的方式并入。
[0177]
实施例
[0178]
实施例1.靶向ipsc中的scn9a和scn10a的spcas9和sacas9 grna的功效筛选.
[0179]
方法
[0180]
向导rna设计和合成
[0181]
计算机向导rna设计由crispr therapeutics完成。计算机设计靶向scn9a的外显子2-15和scn10a的外显子1-14的spcas9和sacas9向导rna，并且使用脱靶预测算法进行评价。选择具有良好脱靶型态的向导rna用于合成和进一步中靶评价。选定的grna包括靶向scn9a的99个spcas9 grna(表1)和68个sacas9 grna(表2)以及靶向scn10a的166个spcas9 grna(表3)和73个sacas9 grna(表4)。
[0182]
向导rna由synthego corporation定制排序用于合成。使用标准化学修饰对向导rna进行排序，所述修饰包括最初和最末3个核苷酸中的2'-o-甲基3'硫代磷酸酯修饰。对于spcas9 grna，表1和表3中列出了20个核苷酸的基因组靶向序列，并且添加标准的80聚体spcas9支架序列以创造向导rna。对于sacas9 grna，表2和表4中列出了22个核苷酸的基因组靶向序列，并且用于与以下sacas9支架序列合成以产生向导rna：guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaa
[0183]
ggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuu(seq id no:41)。
[0184]
使用系统对ipsc进行核转染
[0185]
野生型ipsc以及稳定表达cas9的工程ipsc用于grna筛选的不同步骤。通过将靶向构建体插入aavs-1基因座中从野生型ipsc产生在强力霉素(doxycycline)控制下表达spcas9或sacas9的ipsc。在这种构建体中，两个盒在由is2绝缘子元件隔开的相反方向上表达。第一表达盒是在casi启动子控制下的teton3g蛋白-2a-puro，并且第二表达盒是在tre3g启动子控制下的spcas9或sacas9。
[0186]
使用lonza系统和p3原代细胞96孔nucleofector
tm
试剂盒(lonza，目录号：v4sp-3096)与程序cm137一起对ipsc进行电穿孔。在mtesr1(stemcell technologies，目录号：85850)中培养ipsc。核转染之前，使用accutase(stemcell technologies，目录号：07920)使细胞解离并且再悬浮于p3核转染溶液中。在96孔格局中，
根据制造商的说明书，使用每孔400ng cas9mrna(trilink)和400ng合成grna(synthego)对每孔180,000个细胞进行电穿孔。核转染之后，在dna提取和基于下一代测序(ngs)的插入/缺失(插入缺失)检测之前在预涂有基质胶的96孔细胞培养板中将ipsc维持于补充有10um y27632(stemcell technologies，目录号：72308)的mtesr1中72小时。每个电穿孔实验中包括两个重复，并且进行两个独立的实验。对于稳定的spcas9和sacas9细胞系实验，在amaxa核转染之前将细胞用1ug/ul强力霉素处理72小时。
[0187]
使用lonza y单元对源自ipsc的感觉神经元进行核转染
[0188]
为了产生源自ipsc的感觉神经元培养物(isn)，在涂有基质胶的烧瓶中在小分子发育路径抑制剂混合液存在下使ipsc细胞分化。在分化div11时，使细胞解离并接种至384板中，并且维持于包含生长因子混合液的成熟培养基中，在此所述细胞成熟至div26-28。这些神经元表达伤害感受器的典型标志，包括trpv1、brn3a、外周标志isl1、neun和scn9a(nav1.7)，并且可以概括生理相关神经元亚型的功能特性。
[0189]
使用lonzay单元和ad14d-nucleofectortm y试剂盒(lonza，目录号：v4yp-1a24)与程序eh158一起对源自ipsc的感觉神经元(isn)进行电穿孔。在24孔格局中，根据制造商的说明书，用核糖核蛋白复合物(rnp)对细胞进行电穿孔。通过将425pmol spcas9或sacas9蛋白(aldevron)与531pmol合成grna(synthego)在室温下孵育20分钟来产生rnp复合物。核转染之后，在dna提取和基于下一代测序(ngs)的插入/缺失(插入缺失)检测之前将isn维持于培养物中72小时。每个电穿孔实验中包括两个重复，并且进行两个独立的实验。
[0190]
用aav转导源自ipsc的感觉神经元
[0191]
在384孔格局中，用在单个载体中表达sacas9和sacas9 grna的aav-1载体转导每孔约12,000个isn。用aav载体以750,000的感染复数(moi)转导isn。转导之后，在dna提取和基于ngs的插入/缺失(插入缺失)检测之前将isn维持于培养物中7天。每个转导实验中包括两个重复，并且进行两个独立的实验。
[0192]
基于下一代测序(ngs)的插入/缺失(插入缺失)检测
[0193]
根据制造商的说明书，使用lucigen quick extract 2x dna提取溶液(lucigen，目录号：qe09050)在电穿孔后72小时从ipsc中提取dna。然后，使用kapa2g robust hotstart readymix(sigma aldrich，目录号：kk5702)的两步pcr方法用于产生ngs文库。第一pcr用于创造扩增子，而第二pcr用于添加nextera dna index(i7/i5)适配子序列。pcr#1的反应包括1ul提取的gdna、1x kapa2g robust hotstart readymix、0.5um正向引物和0.5um反向引物。引物序列列于表5和表6中。pcr#2的反应包括1ul pcr#1产物、1x kapa2g robust hotstart readymix、0.5um index 1 n7xx适配子和0.5um index 2 n5xx适配子。pcr#1和pcr#2两者的循环条件如下：(1)95℃持续3分钟，(2)95℃持续15秒，(3)60℃持续15秒，(4)72℃持续15秒，(5)重复步骤(2)-(4)20次，(6)72℃持续1分钟，(7)4℃无限保持。然后使用zymo dna清洁和浓缩试剂盒(zymo，d4034)汇集并纯化样品，并且在agilent 2100生物分析仪(agilent，目录号：g2939ba)上进行定量。然后，在illumina的miseq上运行文库以获得配对末端读数(2x150)。
[0194]
对于每个样品，然后过滤读数以获得30的最低phred33质量评分。随后使用flash(短读快速长度调整)合并配对末端读数，要求至少有1bp的重叠。然后使用尼德曼-翁施算
法(needleman-wunsch algorithm)将所得合并的读数与相应的参考扩增子序列进行最佳对齐。对与预期切割位点3bp内的插入缺失对齐的读取进行计数，然后仅过滤移码插入缺失，其中插入缺失长度不是3的倍数。将总编辑的估计值计算为具有接近切割位点的插入缺失的读数比例，而将生产性编辑计算为每个样品的具有接近切割位点的移码插入缺失读数的读数比例。
[0195]
一旦分析了每个样品，然后通过要求每个样品具有至少90％成功合并的测序读数和70％成功对齐的测序读数来进行样品的质量控制。另外，要求样品具有至少1000个成功对齐的读数。最后，以批次感知的方式，通过丢弃最终对齐的读数计数与其相应批次样品的平均值相差超过2个标准偏差的任何样品来进行质量控制。将通过的样品取平均值并计算标准偏差。包括阳性和阴性对照，其中要求阴性对照展现低于2％的插入缺失率，指示低水平的背景噪音，而阳性对照样品必须显示高于背景的编辑水平。此外，通过在我们的两个技术重复之间比较相应样品来确认重现性；观察到强线性拟合，具有0.85的高r2。
[0196]
靶向ipsc中的scn9a和scn10a的spcas9 grna的脱靶评价
[0197]
对于初始脱靶评价，执行计算机提名步骤，其中基于序列相似性预测候选脱靶序列。然后，经由靶向下一代测序直接评价这些位点，以鉴定哪些位点(如果有的话)显示crispr-cas诱导的脱靶编辑的证据。
[0198]
a)脱靶位点的计算预测
[0199]
使用三种计算算法基于序列相似性预测脱靶位点。具体来说，cctop和cosmid各自用于鉴定具有至多3个错配或至多2个错配的候选脱靶位点，其中1个dna或rna凸出来自中靶序列。用于鉴定脱靶位点的pam序列是spcas9向导的nrg和sacas9向导的nngrrt。然后将从两种算法鉴定的向导合并在一起，包括对具有相同基因组坐标的位点进行去重。表7中提供了40个向导中预测的1,471个假定脱靶位点的总列表。
[0200]
b)ipsc的杂交捕获
[0201]
使用上文所描述的lonza条件进行使用两个不同野生型供体的ipsc转染。使用两个生物重复，并且汇集基因组dna以获得杂交捕获所必需的量。使用dneasy 96血液和组织试剂盒(qiagen，目录号：69581)在电穿孔后72小时从ipsc中提取dna。使用qubit 1x dsdna hs测定(thermofisher，目录号：q33231)和envision板读取器通过4pl计算对样品进行定量。使用sureselect xt试剂盒(aglient，目录号：g9704a)获得并处理最少200ng的每个样品用于杂交捕获。简单来说，使用covaris le220将样品片段化为150-200bp并且进行末端修复、da加尾和适配子接合。然后使用herculase ii fusion dna聚合酶在以下循环条件下扩增文库：(1)98℃持续2分钟，(2)98℃持续30秒，(3)65℃持续30秒，(4)72℃持续1分钟，(5)重复步骤(2)-(4)10次，(6)72℃持续5分钟，(7)4℃无限保持。使用基于珠粒的净化来纯化文库，ampure xp(beckman coulter，目录号：a63881)。使文库与标靶特异性捕获文库杂交，并且用链霉亲和素包被的磁性珠粒捕获靶分子。然后使用上述相同条件对捕获的文库进行扩增和纯化。在tapestation(agilent，目录号：5067-5584)和/或生物分析仪(aglient，目录号：5067-1504)上使用dna高灵敏度试剂盒对样品进行qc，并且在illumina hiseq平台上进行测序，达到每个候选脱靶位点2,272x的中位测序覆盖率。
[0202]
c)靶向二代测序的计算分析
[0203]
对于本研究中所包括的每个假定脱靶位点，进行以下分析以确定crispr-cas治疗
诱导的脱靶编辑的证据力度。首先，使用默认参数在mem模式下使用对齐工具bwa将下一代测序读数与hg38人类参考基因组对齐，继而将sam和bam文件进行转换和分类，并且通过samtools进行读取重复的去除。然后，通过使用python程序包pysam堆积具有预期切割位点3bp内的插入缺失的读数并且用插入缺失读数的数目除以覆盖那个位点的读数的总数来测量插入缺失形成率。
[0204]
然后，在每个ipsc供体的经过处理的样品与那个相同ipsc供体所匹配的未处理(仅电穿孔)的阴性对照样品之间比较在每个预测脱靶位点处测量的插入缺失率。如果观察到所述位点处的插入缺失率大于阴性对照样品的程度》0.2％，那么那个候选位点的数据进入统计检验。唯一的例外是观察到具有种系插入缺失基因变体的候选位点，其中在一个或多个供体的匹配的未处理和经过处理的样品中都观察到约50％或约100％的插入缺失率。对于进入统计检验的位点，对两个供体进行配对t检验，以确定在那个位点处经过处理和未处理的插入缺失率。任何使得p值小于0.05的检验位点都被视为具有确认的脱靶编辑。大量的中靶编辑(平均插入缺失率为9.35％-52.25％)在向导中确认为本研究的阳性对照。
[0205]
表1：靶向scn9a基因(nav1.7)的spcas9向导rna的名称和序列
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210][0211]
表2：靶向scn9a基因(nav1.7)的sacas9向导rna的名称和序列
[0212]
[0213]
[0214][0215]
表3：靶向scn10a基因(nav1.8)的spcas9向导rna的名称和序列
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224][0225]
表4：靶向scn10a基因(nav1.8)的sacas9向导rna的名称和序列
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230][0231]
表5：用于对crispr介导的scn9a基因(nav1.7)编辑进行测序分析的引物的名称、序列和靶向外显子
[0232]
[0233]
[0234]
[0235][0236]
表6：用于对crispr介导的scn10a基因(nav1.8)编辑进行测序分析的引物的名称、序列和靶向外显子
[0237]
[0238]
[0239]
[0240][0241]
表7：在40个向导中预测的1,471个假定脱靶位点的总列表
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263][0264]
结果
[0265]
靶向ipsc中的scn9a和scn10a的spcas9和sacas9 grna的筛选
[0266]
在ipsc中进行两轮grna筛选和测序分析之后，在考察每个grna的预测切割位点处插入和缺失(插入缺失)的总百分比下，基于每个样品的四次重复计算平均切割效率。出于敲除scn9a和scn10a基因的目的，还计算了将导致移码突变的插入缺失的平均百分比。按平
均总插入缺失百分比和引起移码的平均插入缺失百分比对向导rna排等级。基于引起移码的平均插入缺失百分比按等级顺序列出向导rna，并且包括乱序的非靶向grna以及未处理的细胞作为阴性对照(表8-11)。
[0267]
表8：由靶向ipsc中的scn9a的spcas9 grna产生的平均总插入缺失百分比和引起移码的平均插入缺失百分比
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272][0273]
表9：由靶向ipsc中的scn9a的sacas9 grna产生的平均总插入缺失百分比和引起移码的平均插入缺失百分比
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278][0279]
表10：由靶向ipsc中的scn10a的spcas9 grna产生的平均总插入缺失百分比和引起移码的平均插入缺失百分比
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291][0292]
表11：由靶向ipsc中的scn10a的sacas9 grna产生的平均总插入缺失百分比和引起移码的平均插入缺失百分比
[0293]
[0294]
[0295]
[0296][0297]
在稳定表达spcas9或sacas9的ipsc中以及源自ipsc的感觉神经元中筛选靶向scn9a和scn10a的顶级grna
[0298]
基于在ipsc中初始grna筛选的中靶功效，将40个向导优先化用于在另外的细胞模型，例如稳定表达cas9的ipsc和源自ipsc的感觉神经元(isn)中进行进一步中靶编辑研究(图1a-1d)。具体来说，从四个类别中的每一者中选择十个向导：1)靶向scn9a的spcas9的十个grna，2)靶向scn10a的spcas9的十个grna，3)靶向scn9a的sacas9的十个grna，以及4)靶向scn10a的sacas9的十个grna(表12和表13)。
[0299]
在稳定表达spcas9或sacas9的工程ipsc中筛选这40个优先化grna。将合成的grna电穿孔至相应的细胞系中。已经针对isn中的中靶编辑效率来筛选这40个grna。在isn中，将
rnp复合物电穿孔至所有40个grna的粘附神经元培养物中。另外，由表达sacas9和grna的一体化aav载体也将20个sacas9 grna递送至isn。如方法中所描述，从经过处理的细胞中纯化基因组dna用于测序分析。
[0300]
在每个模型中，进行两个独立的实验。在考察每个grna的预测切割位点处插入和缺失(插入缺失)的总百分比下，基于每个样品的四次重复计算平均切割效率。出于敲除scn9a和scn10a基因的目的，还计算了将导致移码突变的插入缺失的平均百分比。按引起移码的平均插入缺失百分比对向导rna排等级。不同细胞模型中这40个优先化grna的中靶编辑效率的汇总可以在图1a-1d中以及表12和表13中找到。
[0301]
表12：不同细胞模型中优先化spcas9 grna的中靶编辑效率的汇总
[0302]
[0303]
[0304][0305]
表13：不同细胞模型中优先化sacas9 grna的中靶编辑效率的汇总
[0306]
[0307]
[0308]
[0309][0310]
靶向ipsc中的scn9a和scn10a的spcas9和sacas9 grna的脱靶评价
[0311]
基于ipsc中初始grna筛选的中靶功效，也将40个向导优先化用于脱靶评价。具体来说，从四个类别中的每一者中选择十个向导：1)靶向scn9a的spcas9的十个grna，2)靶向scn10a的spcas9的十个grna，3)靶向scn9a的sacas9的十个grna，以及4)靶向scn10a的sacas9的十个grna。
[0312]
在研究中所包括的40个grna当中，将29个grna归类为“1级”(表14)，其中研究中所包括的脱靶位点不进入统计检验；这29个grna包括4个在序列相似性准则下未预测到脱靶位点的grna。基于本研究，这29个grna视为没有脱靶编辑的证据。另外，将七个grna归类为“2级”(表15)，其中至少一个与所述grna相关的脱靶位点可能已进入统计检验，但未发现统计上显著的。这些grna的这些脱靶型态视为本研究中非确定性的。另外，将四个grna归类为“3级”(表16)，其中发现至少一个脱靶位点具有统计上显著的脱靶编辑。基于这些脱靶编辑结果，这些grna优先级大大降低。发现靶基因(scn9a或scn10a)和酶(spcas9或sacas9)的所有组合具有至少5个1级向导。
[0313]
表14：29个归类为1级且没有脱靶编辑证据的grna
[0314]
[0315][0316]
*scn10a sp外显子10_t7由于0.2％的阈值要求具有一个测试位点，但由于种系突变最终排除那个位点。
[0317]
表15：具有非确定性脱靶编辑型态的七个归类为2级的grna
[0318]
[0319][0320]
表16：在一个或多个位点处确认脱靶编辑(p《0.05)的四个归类为3级的grna
[0321]
[0322][0323]
其它实施方案
[0324]
本说明书中公开的所有特征可以按任何组合形式进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确规定，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实例。
[0325]
从前面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不背离本发明精神和范围的情况下可以对本公开作出各种变化和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求内。
[0326]
等效方案
[0327]
虽然本文中已经描述和图解了若干本发明实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得结果和/或本文所描述的一个或多个优点的多种其它方式和/或结构，并且这类变更和/或修改中的每一者都视为处于本文所描述的本发明实施方案的范围内。更一般来说，本领域技术人员将容易了解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和配置意在作为示例并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教义所用于的一种或多种具体应用。本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所描述的具体的本发明实施方案的许多等效方案。因此，应了解，前述实施方案仅作为实例呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以按不同于具体描述和要求的方式来实践本发明实施方案。本公开的发明性实施方案涉及本文所描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，两个或更多个这类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，那么就包括于本公开的发明范围内。
[0328]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、以引用的方式并入的文献中的定义和/或所定义的术语的普通含义。
[0329]
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请关于每一者所引用的主题以引用的方式并入，在一些情况下可以涵盖整个文献。
[0330]
除非相反地明确指示，否则在本文中如说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为意指“至少一个/种”。
[0331]
在本文中如说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此联合的要素中的“任一者或两者”，即，在一些情况下联合存在且在其它情况下不联合存在的要素。以“和/或”列出的多个要素应以相同方式解释，即，如此联合的要素中的“一者或多者”。除了由“和/或”子句具体标识的要素以外，可以任选地存在其它要素，无论与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与如“包含”等开放式语言结合使用时，提
及“a和/或b”可以在一个实施方案中仅指a(任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中仅指b(任选地包括除a以外的要素)；在又一个实施方案中指a和b两者(任选地包括其它要素)；等等。
[0332]
在本文中如说明书和权利要求书中使用，“或”应理解为与如上文所定义的“和/或”具有相同的含义。举例来说，当分隔清单中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包括性的，即，包括许多或一列要素和任选地另外未列出的项目中的至少一者，但也包括多于一者。只有相反地明确指示的术语，例如“仅一者”或“确切一者”或当在权利要求书中使用时“由
……
组成”将指包括许多或一列要素中的确切一个要素。一般来说，当前面有排他性术语，例如“任一个”，“其中一个”、“仅其中一个”或“确切一个”时，如本文使用的术语“或”应仅仅解释为指示排他性替代方案(即，“一个或另一个但不是两个”)。“基本上由
……
组成”在权利要求书中使用时，应具有专利法领域中使用的普通含义。
[0333]
在本文中如说明书和权利要求书中使用，关于一个或多个要素的清单的短语“至少一个”应理解为意指选自要素清单中的任一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素清单内具体列出的每个要素中的至少一者并且不排除要素清单中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素清单内具体标识的要素以外的要素，无论与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一者”(或等效地“a或b中的至少一者”，或等效地“a和/或b中的至少一者”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个a，而不存在b(并且任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个b，而不存在a(并且任选地包括除a以外的要素)；在又一个实施方案中指至少一个，任选地包括多于一个a，和至少一个，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其它要素)；等等。
[0334]
还应了解，除非相反地明确指示，否则在本文要求的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于所叙述的方法的步骤或动作的顺序。