一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗的制作方法

1.本发明涉及胸膜肺炎领域，具体涉及一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗。


背景技术：

2.猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，pcp)是猪的一种呼吸系统传染病。胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app)是一种革兰阴性短杆状细菌，是pcp的重要致病因子。
3.疫苗接种是防控pcp的重要手段，虽然有不少商品化疫苗上市，但是由于app血清型多达18种，还没有疫苗能对app提供完全保护。
4.近年来对app亚单位疫苗的发明成为热点，并且已经证实溶血外毒素(actinobacillus pleuropneumoniae-rtx-toxins，apx)有很好的免疫原性，本发明提供了一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，对apxi、apxii、apxiii进行截短表达，获得可溶性表达的蛋白，加之实验室前期表达的omp2蛋白，制备亚单位疫苗免疫小鼠，评价其对小鼠的免疫保护效果，为使用亚单位疫苗防控pcp提供参考。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种胸膜肺炎放线杆菌抗原组合及其在制备亚单位疫苗中的应用，以缓解现有技术中缺少一种效果好的胸膜肺炎亚单位疫苗。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.一种胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，包含氨基酸序列分别如seq id no.1-4所示的蛋白1-4。其中，蛋白1为apxi截短蛋白、蛋白2为apxii截短蛋白、蛋白3为apxiii截短蛋白、蛋白4为omp2重组蛋白。
8.进一步地，编码蛋白1-4的核苷酸序列分别如seq id no.5-8所示。
9.所述的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。
10.一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗，包含所述的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合，还包含佐剂，所述的佐剂优选为卡波姆971p佐剂。
11.本发明的有益效果是：
12.(1)本发明抗原蛋白组合中选择的截短蛋白在app所有血清型高度同源，将其制备成亚单位疫苗能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。
13.(2)本发明抗原蛋白组合中选择的截短蛋白都以可溶形式表达，易于生产，在增加免疫剂量的基础上达到了现有亚单位疫苗的免疫保护效果，总体成本低。
14.(3)重组亚单位疫苗主要引起体液免疫，本发明中利用间接elisa对小鼠血清抗体水平进行检测，亚单位疫苗组产生了针对rtapxi、rtapxii、rtapxiii和romp2四种蛋白的高水平的抗体，同时，产生的igg1水平均显著高于igg2a，表明其产生良好的体液免疫应答反
应，通过淋巴细胞增殖实验，验证了rtapxi、rtapxii、rtapxiii和romp2四种蛋白可以有效的引起机体的体液免疫应答反应。
15.(4)细胞因子在机体炎症、对抗细菌感染等方面有重要作用，细胞因子分为促炎细胞因子和抑炎细胞因子，前者主要包括tnf-α、il-2、il-6、il-8、il-12、ifn-γ等，后者主要包括il-4、il-13、il-10等，促炎与抗炎细胞因子相互作用形成复杂的网络，其动态平衡决定了炎症的发展与结局，本发明中灭活疫苗组和亚单位疫苗组的促炎细胞因子水平显著低于攻毒对照组，表明疫苗免疫起到了抵抗细菌感染的作用，il-10能够抑制促炎细胞因子的释放，亚单位疫苗组il-10水平的升高一定程度上反映其免疫效果受到抑制；
16.(5)肺脏组织切片he染色后结果显示攻毒对照组肺泡壁变厚，并伴有炎症细胞浸润，而且肺泡腔中存在血细胞，灭活疫苗组和亚单位疫苗组损伤水平都低于攻毒对照组，表明其可对肺脏提供良好的保护作用，脾脏组织切片he染色后结果显示攻毒对照组、灭活疫苗组和亚单位疫苗组均严重出血，亚单位疫苗组损伤较轻；
17.(6)通过使用apxi、apxii和apxiii的重组蛋白作为疫苗抗原的亚单位疫苗在安全性和保护性方面显示出良好的功效。
附图说明
18.图1为本发明提供的重组质粒pcoldi-tapxi、pcoldi
–
tapxii、pcoldi-tapxiii的pcr和双酶切鉴定图。图a中各泳道：m、dl2000 dnamarker，1、tapxi基因，2、tapxiii基因。图b中各泳道：m、dl5000 dnamarker，1、pcoldi-tapxi双酶切，2、pcoldi-tapxiii双酶切。图c中各泳道：m、dl5000 dnamarker，1、tapxii基因。图d中各泳道：m、dl5000 dna marker，1、pcoldi-tapxii双酶切。
19.图2为本发明提供的重组蛋白rtapxi、rtapxiii、rtapxii的可溶性分析图。图a中各泳道：m、蛋白marker，1、rosetta/pcoldi-tapxi诱导全菌，2、rosetta/pcoldi-tapxi超声破碎后上清，3、rosetta/pcoldi-tapxi超声破碎后沉淀，4、rosetta/pcoldi-tapxiii诱导全菌，5、rosetta/pcoldi-tapxiii超声破碎后上清，6、rosetta/pcoldi-tapxiii超声破碎后沉淀。图b中各泳道：m、蛋白marker，1、rosetta/pcoldi-tapxii超声破碎后沉淀，2、rosetta/pcoldi-tapxii超声破碎后上清，3、rosetta/pcoldi-tapxii诱导全菌。
20.图3为本发明提供的重组蛋白rtapxii、rtapxi、rtapxiii的his单抗western blot鉴定及免疫反应性分析图。图a为重组蛋白rtapxii、rtapxi、rtapxiii的his单抗westernblot鉴定图，其各泳道：m、蛋白marker，1、rtapxii，2、rtapxi，3、rtapxiii。图b为重组蛋白rtapxii、rtapxi、rtapxiii的猪多抗western blot鉴定图，其各泳道：m、蛋白marker，1、rtapxii，2、rtapxi，3、rtapxiii。
21.图4为本发明提供的重组蛋白rtapxi、rtapxiii纯化的sds-page结果分析图。图a为重组蛋白rtapxi纯化的sds-page结果分析图，其各泳道：m、蛋白marker，1、超声破碎后上清，2～3、流穿液，4～5、洗涤缓冲液，6～8、纯化后蛋白。图b为重组蛋白rtapxiii纯化的sds-page结果分析图，其各泳道：m、蛋白marker，1、诱导后菌液，2、超声破碎后上清，3、超声破碎后沉淀，4～6、流穿液，7～9、洗涤缓冲液，10～11、纯化后蛋白。
22.图5为本发明提供的重组蛋白rtapxi、rtapxii、rtapxiii纯化的sds-page结果图。图a各泳道：m、蛋白marker，1、rtapxi，2、rtapxiii。图b各泳道：m、蛋白marker，1、rtapxii。
23.图6为本发明提供的app血清5型的生长曲线及od
600nm
与菌落数的关系图。图a为app血清5型的生长曲线图。图b为app血清5型od
600nm
与菌落数的关系图。
24.图7为本发明提供的首免前、一免两周后、二免两周后抗体水平检测图。图a为亚单位疫苗组血清分别与rtapxi、rtapxii、rtapxiii和omp2蛋白反应图。图b为灭活疫苗组血清与app血清5型反应图。
25.图8为本发明提供的二免两周后igg1、igg2a抗体水平检测图。
26.图9为本发明提供的淋巴细胞增殖实验图。图a为1640、tapxii、rtapxiii、romp、cona刺激灭活疫苗组淋巴细胞图。图b为1640、tapxii、rtapxiii、romp、cona刺激亚单位疫苗组淋巴细胞图。图c为1640、tapxii、rtapxiii、romp、cona刺激空白组淋巴细胞图。
27.图10为本发明提供的攻毒后存活率图。
28.图11为本发明提供的攻毒后细胞因子检测图。
29.图12为本发明提供的攻毒后不同分组肺脏和脾脏病理学观察图。图中，a为灭活疫苗组，b为亚单位疫苗组，c为攻毒对照组，d为空白组。
具体实施方式
30.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
31.1材料方法
32.1.1实验动物
33.64只4周龄无特定病原体(spf级)的icr小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
34.1.2主要试剂
35.igg1和igg2a抗体购于南京天为公司；反转录酶购于诺唯赞公司；限制性核酸内切酶sac i、xho i、hind iii、蛋白分子质量标准品购于赛默飞世尔科技(中国)公司；小鼠外周血淋巴细胞分离液kit购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；卡波姆971p、isa-15a购于法国赛比克公司；其余试剂为进口/国产分析纯。
36.1.3 apxi、apxii和apxiii截短基因片段的扩增
37.按照tianamp bacteria dnakit说明，将app血清2型和5型菌液转接至tsb，培养过夜后，取3ml用于提取app基因组dna。根据genbank中收录的app apxi基因序列,app apxii基因序列和app apxiii基因序列，应用dnastarprotean软件进行亲水性分析及b细胞抗原表位预测，选取亲水性好且b细胞抗原表位集中的序列，设计引物(表1)。pcr扩增体系和扩增条件见表2。
38.表1扩增tapxi、tapxii和tapxiii基因的引物
[0039][0040]
注：下划线为酶切位点
[0041]
表2基因的扩增体系和条件
[0042][0043]
1.4原核表达质粒pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii和pcoldi-tapxiii的构建
[0044]
将1.3中获得的pcr产物跑电泳后，回收目的片段。tapxi和tapxiii基因回收后的产物和pcoldi载体分别使用限制性内切酶xho i和hind iii在37℃水浴中酶切2h，酶切体系见表3。
[0045]
表3酶切体系
[0046][0047][0048]
通过核酸凝胶电泳，回收产物后进行连接，连接体系见表4，22℃连接1h。转化连接产物进入dh5α内，经37℃1h复苏后，将菌液离心，弃去上清，用100μllb液体培养基重悬涂板。37℃培养12-14h后，挑取单菌落在含有氨苄酶素的lb液体培养基中培养。按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，进行双酶切鉴定同时测序，经鉴定正确的重组质粒命名为pcoldi-tapxi和pcoldi-tapxiii。
[0049]
表4 pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii和pcoldi-tapxiii的连接体系
[0050][0051]
1.5重组蛋白tapxi、tapxiii、tapxii的表达及可溶性分析
[0052]
将pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii、pcoldi-tapxiii转化进入rosetta(de3)感受态细胞中，经37℃1h复苏后，取100μl涂板。挑取单菌落接种于3ml的液体lb(含ampr)中，37℃200rpm振荡培养至od
600nm
值为0.4至0.6，每管中加入终浓度为1mmol
·
l-1
的诱导剂iptg用于诱导外源目的蛋白的表达，继续培养24h后，13000rpm离心1min，弃上清，用500μl无菌pbs重悬。取100μl重悬液加入25μl 5
×
sds loading buffer，在100℃水中煮10min。将剩余洗涤后的菌液在冰水混合物中进行超声波破碎，直至菌液澄清透光，离心沉淀后收集上清液，并用500μl无菌pbs重悬沉淀，煮样。分别取20μl煮好的样品加入到12.5％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。将电泳后的凝胶浸没于考马斯亮蓝中均匀染色2h，脱色后用蛋白胶曝光仪分析凝胶中的蛋白表达形式。
[0053]
1.6重组蛋白的western-blot鉴定及免疫反应性分析
[0054]
使用rosetta/pcoldi-tapxi、rosetta/pcoldi-tapxii、rosetta/pcoldi-tapxiii的诱导表达后的上清进行sds-page，将其转印到nc膜上，nc膜用5％脱脂乳室温封闭3h，pbst洗涤三次后，以1：5000稀释的6
×
his标签单抗为一抗，室温作用1h；洗涤后，与以hrp-山羊抗鼠igg抗体在室温下孵育45min；洗涤后，将膜均匀涂布发光混合液，用ecl曝光仪进行曝光分析。另外，以1:100稀释的临床猪阳性血清为一抗，spa作为二抗，按以上步骤进行实验。
[0055]
1.7重组蛋白的纯化
[0056]
将100ml经iptg诱导的菌液用pbs洗涤2次后，用结合缓冲液重悬，进行超声破碎，13000r/min离心10min后取上清用0.22μm滤器过滤后作为蛋白样品。参照ni-nta说明书，先将10倍柱体积结合缓冲液通过镍柱，然后加入蛋白样品，之后用洗涤缓冲液洗涤树脂，至流穿液中溶质含量保持稳定，最后以5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱树脂，收集纯化样品。
[0057]
1.8菌种复苏及培养
[0058]
挑取实验室保存的app血清5型菌的冻干粉在(tsa)划板，挑菌镜检，确定无污染后，接种于加入血清和辅酶的tsb中放入37℃摇床振荡培养。
[0059]
1.9细菌培养特性的检测
[0060]
挑取tsa平板上app单菌落，在3ml tsb中过夜培养。接500μl菌液至50ml tsb中，隔1h测一次od
600nm
，绘制生长曲线。在对应时间点，对活菌菌落计数，建立回归方程，绘制app对数期的菌落数与od
600nm
的关系。
[0061]
1.10疫苗的制备
[0062]
亚单位疫苗组：rtapxi、rtapxii、rtapxiii、romp2蛋白各30μg/只，按佐剂与抗原1:2(v/v)加入卡波姆971p佐剂；
[0063]
灭活疫苗组：app血清5型灭活菌体1
×
109cfu/只，按佐剂与抗原1:9(v/v)加入isa-15a佐剂。
[0064]
1.11动物免疫
[0065]
64只4周龄雌性icr小鼠随机分为4组，即灭活疫苗组、亚单位疫苗组、攻毒对照组、空白组，每组16只。免疫途径为背部皮下分点注射，免疫剂量为0.2ml/只，首免后三周进行二免，共免疫2次。
[0066]
1.12小鼠血清中特异性抗体水平测定
[0067]
首免前、首免2周后、二免2周后，各组随机选3只断尾采血，分离血清，根据实验室优化的各反应条件，采用间接elisa检测小鼠血清各特异性抗体水平。rtapxi、rtapxii、rtapxiii、romp2蛋白的包被浓度为2μg/ml，待检血清的稀释度为1∶100，抗体反应条件为37℃孵育1h。二免2周后同步检测igg1和igg2a抗体水平。
[0068]
1.13淋巴细胞增殖实验
[0069]
二免2周后，灭活疫苗组、亚单位疫苗组和空白组每组分别取三只小鼠分离脾脏，将脾脏剪成小块，将组织块放在细胞筛网研磨，边研磨边加入1640。组织研磨液经以1000rpm/min的速度离心5min，并用1ml 1640悬浮脾细胞。加入3ml红细胞裂解缓冲液处理脾细胞悬液。37℃水浴锅内孵育3min。用1640将脾细胞洗涤2次，然后悬浮在含有10％fbs和1％pen-strep的完全1640培养基中。将分离的淋巴细胞调整密度至106个/ml，于96孔细胞板中分别加入100μl淋巴细胞。在5％co2培养箱中于37℃孵育4小时后，分别加入100μl的cona(终浓度为5μg/ml)、100μl的rtapxi、rtapxii、rtapxiii、romp2蛋白(5μg/孔，1640稀释)、100μl1640刺激细胞，做3个重复。将96孔细胞培养板置于恒温培养箱37℃，5％co2培养72h后每孔避光加20ul cck-8，37℃培养4h后酶标仪测各孔od
450nm
。
[0070]
1.14免疫后攻毒
[0071]
利用reed-muench法确定app血清5型的ld50。二免2周后，用5ld50的剂量腹腔攻app血清5型。攻毒后1周内观察并记录小鼠状态和死亡情况，计算各组死亡率和保护率。
[0072]
1.15细胞因子检测
[0073]
攻毒后，攻毒组取3只濒死小鼠分离外周血淋巴细胞，同步分离灭活疫苗组、亚单位疫苗组和空白组3只小鼠外周血淋巴细胞，进行淋巴细胞总rna提取，rna反转录，通过sybr green实时荧光定量pcr检测小鼠细胞因子tnf-α、ifn-γ、il-6和il-10。
[0074]
1.16制作病理切片
[0075]
攻毒对照组小鼠死后立即剖检3只，采集肺脏和脾脏，制作病理切片。疫苗组和空白组各取3只存活小鼠剖检，采集肺脏和脾脏，制作病理切片。
[0076]
2结果
[0077]
2.1重组质粒pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii和pcoldi-tapxiii的鉴定
[0078]
pcr扩增结果如图1中左侧的图a所示，分别出现大小为1700bp、1500bp和1300bp左右的条带，符合预期。pcoldi-tapxi经hind iii和xho i双酶切获得1700bp左右的基因片段及4400bp左右的载体片段；重组质粒pcoldi-tapxii经sac i和xho i双酶切，得到1500bp左右的基因片段和4400bp左右的载体片段。重组质粒pcoldi-tapxiii经sac i和xho i双酶切，得到1300bp左右的基因片段和4400bp左右的载体片段。测序结果正确，表明重组表达质粒pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii和pcoldi-tapxiii构建成功。
[0079]
2.2重组蛋白tapxi、tapxii和tapxiii的表达与可溶性分析
[0080]
将重组质粒pcoldi-tapxi、pcoldi-tapxii和pcoldi-tapxiii转化至rosetta(de3)诱导表达，进行sds-page分析，在63、56和50kda大小左右的位置出现目的条带，符合预期，如图2所示。将诱导后的细菌洗涤后超声波破碎，收集上清和沉淀经sds-page及染色分析。rosetta/pcoldi-tapxi、rosetta/pcoldi-tapxii、rosetta/pcoldi-tapxiii在上清均表达。
[0081]
2.3重组蛋白的western-blot鉴定及免疫反应性分析
[0082]
rtapxi、rtapxii、rtapxiii经sds-page，以小鼠抗6
×
his组氨酸igg为一抗，hrp-羊抗鼠igg为二抗，进行westernblot鉴定，结果如图3中左侧a图所示，在63、56和50kda相应位置出现特异性抗原抗体结合带。同时，以临床阳性猪血清作为一抗，以葡萄球菌a蛋白(spa)为二抗进行western-blot分析，结果说明可溶性的表达的蛋白能够与app天然抗体发生特异性反应。
[0083]
2.4重组蛋白的纯化
[0084]
在20mmol/l咪唑结合缓冲液、60mmol/l咪唑洗涤缓冲液的条件下纯化了apxi(图4中左侧的a图)在30mmol/l咪唑结合缓冲液、100mmol/l咪唑洗涤缓冲液的条件下纯化了apxiii(图4中右侧的b图)。
[0085]
虽然在上述条件下纯化了rtapxi、rtapxii和rtapxiii，但是rtapxi和rtapxii纯化效果不理想且产量低，rtapxiii产量也不高，不过由于使用pcoldi载体进行低温诱导表达蛋白，杂蛋白量很少，因此本实验对rosetta/pcoldi-tapxi、rosetta/pcoldi-tapxii、rosetta/pcoldi-tapxiii培养菌液至od＝0.4时，加入iptg进行诱导表达，对超裂后的上清脱除内毒素，经sds-page鉴定(图5)，目的蛋白纯度较高，可用于动物实验。(图5右侧的图b)
[0086]
2.5细菌培养特性的检测
[0087]
app血清5型在2h左右开始进入对数期；约6h后进入平台期(图6左侧的a图)。app对数生长期菌落数与od
600nm
之间呈线性关系(图6右侧的b图)。
[0088]
2.6免疫后小鼠血清特异性抗体的检测结果
[0089]
首免前，小鼠血清均为阴性。首免2周后，灭活疫苗组抗体水平显著上升(p＜0.01)(图7中的图b)，亚单位疫苗组针对rtapxii(p＜0.01)、rtapxiii(p＜0.05)抗体水平显著上升(图7中的图a)。二免2周后，灭活疫苗组和亚单位疫苗组抗体水平均显著升高(p＜0.001)。表明本发明中的灭活疫苗和亚单位疫苗均能够有效刺激小鼠机体产生强的免疫应答。
[0090]
二免2周后，用灭活疫苗组血清与app血清5型反应，用亚单位疫苗组血清分别与rtapxi、rtapxii、rtapxiii和omp2蛋白反应，产生的igg1水平均显著高于igg2a(p＜0.001)(图8)，表明灭活疫苗和亚单位疫苗主要刺激小鼠产生体液免疫应答反应。
[0091]
2.7淋巴细胞增殖实验
[0092]
灭活疫苗组小鼠淋巴细胞受rtapxi蛋白刺激后，淋巴细胞增殖水平均显著升高(p《0.01)，受tapxii、rtapxiii、romp蛋白刺激后，淋巴细胞增殖水平均显著升高(p《0.001)(图9中的图a)。亚单位疫苗组小鼠淋巴细胞受到rtapxi、rtapxii、rtapxiii、romp蛋白刺激后，淋巴细胞增殖水平均显著升高(p《0.001)(图9中的图b)。同时，用cona刺激细胞后也检测淋巴细胞增殖(p《0.001)。空白组淋巴细胞增殖水平均与1640对照无显著差异(p＞0.05)
(图9中的图c)。
[0093]
2.8攻毒保护实验
[0094]
本实验app血清5型的攻毒剂量为2.4
×
108cfu。攻毒对照组小鼠于24h内全部死亡(10/10)。灭活疫苗组小鼠在24h内死亡4只(4/10)，余下小鼠全部存活(6/10)。亚单位疫苗组小鼠在24h内死亡6只(6/10)，余下小鼠全部存活(4/10)(图10)。存活小鼠在刚攻毒后均有精神萎靡，食欲不振，聚堆的现象，但在48h后逐渐恢复正常状态。
[0095]
2.9细胞因子检测
[0096]
应用sybr green实时荧光定量pcr方法对tnf-α、ifn-γ、il-6和il-10四种细胞因子进行检测，其中tnf-α、ifn-γ和il-6为促炎细胞因子，il-10为抑炎细胞因子。攻毒对照组tnf-α、ifn-γ、il-6三种细胞因子水平均显著高于灭活疫苗组和亚单位疫苗组(p＜0.001)，而il-10细胞因子水平与灭活疫苗组无显著差异(p＞0.05)，且显著低于亚单位疫苗组(p＜0.01)(图11)，表明攻毒对照组发生明显的炎性反应。灭活疫苗组促炎细胞因子水平高于亚单位疫苗组，由于促炎细胞因子在一定范围内可以反应机体免疫应答水平，表明灭活疫苗组产生的免疫应答水平可能优于亚单位疫苗组。
[0097]
2.10病理切片
[0098]
攻毒对照组小鼠肺脏严重出血，组织病理学观察发现，肺泡出血，肺泡壁变厚，有炎性细胞浸润，脾脏出血严重，有炎性细胞浸润。灭活疫苗组和亚单位疫苗组肺组织损伤水平都低于攻毒对照组，而脾脏出血现象较为严重(图12)。这表明灭活疫苗组和亚单位疫苗组能够对肺脏提供较好的保护效果，而对脾脏保护效果较差。图中，a为灭活疫苗组，b为亚单位疫苗组，c为攻毒对照组，d为空白组。
[0099]
本发明可溶性表达了rtapxi、rtapxii、rtapxiii，与本实验室已可溶性表达的romp2蛋白，共同作为有效抗原成分，制备亚单位疫苗。
[0100]
重组亚单位疫苗主要引起体液免疫。本发明中利用间接elisa对小鼠血清抗体水平进行检测，亚单位疫苗组产生了针对rtapxi、rtapxii、rtapxiii和romp2四种蛋白的高水平的抗体。同时，产生的igg1水平均显著高于igg2a，表明其产生良好的体液免疫应答反应。通过淋巴细胞增殖实验，验证了rtapxi、rtapxii、rtapxiii和romp2四种蛋白可以有效的引起机体的体液免疫应答反应。
[0101]
本发明以卡波姆佐剂构建亚单位疫苗，以icr小鼠作为动物模型，进行免疫攻毒保护实验，同时设立灭活疫苗组，攻毒对照组和空白组。结果显示，灭活疫苗组对app血清5型的感染有一定的免疫力，亚单位疫苗组免疫力较弱，可能是由于本实验采用的蛋白为截短蛋白而非全蛋白，有些关键的起保护作用的抗原表位没有包含在截短蛋白中。
[0102]
细胞因子在机体炎症、对抗细菌感染等方面有重要作用。细胞因子分为促炎细胞因子和抑炎细胞因子，前者主要包括tnf-α、il-2、il-6、il-8、il-12、ifn-γ等，后者主要包括il-4、il-13、il-10等，促炎与抗炎细胞因子相互作用形成复杂的网络，其动态平衡决定了炎症的发展与结局。本发明中灭活疫苗组和亚单位疫苗组的促炎细胞因子水平显著低于攻毒对照组，表明疫苗免疫起到了抵抗细菌感染的作用。il-10能够抑制促炎细胞因子的释放，亚单位疫苗组il-10水平的升高一定程度上反映其免疫效果受到抑制。
[0103]
肺脏组织切片he染色后结果显示攻毒对照组肺泡壁变厚，并伴有炎症细胞浸润，而且肺泡腔中存在血细胞。灭活疫苗组和亚单位疫苗组损伤水平都低于攻毒对照组，表明
其可对肺脏提供良好的保护作用。脾脏组织切片he染色后结果显示攻毒对照组、灭活疫苗组和亚单位疫苗组均严重出血，亚单位疫苗组损伤较轻。
[0104]
以上结果表明，利用原核表达的rtapxi、rtapxii、rtapxiii和romp2蛋白制备的亚单位疫苗能激发小鼠强烈的免疫反应，对国内流行的app5型具有一定的保护效果。
[0105]
本发明成功表达了apxi、apxii、apxiii截短蛋白，并与实验室前期已表达纯化的omp2蛋白配制成亚单位疫苗。加强免疫后灭活疫苗组和亚单位疫苗组抗体水平显著升高(p＜0.001)，亚单位疫苗组淋巴细胞增殖水平显著升高(p＜0.001)，与攻毒对照组相比，灭活疫苗组和亚单位疫苗组细胞因子水平有显著差异(p＜0.001)。灭活疫苗组存活率为60％，亚单位疫苗组存活率为80％。灭活疫苗组和亚单位疫苗组对肺脏有较好保护作用。本发明中利用原核表达的apxi、apxii、apxiii毒素蛋白和omp2外膜蛋白制备的亚单位疫苗具有一定的免疫保护效果。
[0106]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。