一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用。


背景技术：

2.罗非鱼是世界上最重要的淡水养殖鱼类之一，是仅次于鲤科鱼的第二大养殖鱼类，每年全球产量约为450万吨，产值超75亿美元。罗非鱼在世界范围内超100个国家中均有养殖，为全球人民提供重要的动物蛋白食物。中国是世界上最大的罗非鱼生产国、消费国和出口国之一，罗非鱼产量约占世界总量的37％，罗非鱼养殖已成为我国渔民增收和出口创汇的重要产业之一。
3.罗非鱼湖病毒病(tilapia lake virus disease，tilvd)是由罗非鱼湖病毒(tilapia lake virus，tilv)感染所引起的传染性疾病。tilv是一种包膜病毒，由10个单股负链rna片段组成，具有10个基因组节段(segment 1
‑
10，s1
‑
s10)。罗非鱼湖病毒的暴发往往会给全球罗非鱼养殖带来巨大的经济损失，从而具有极大的威胁性。
4.相关技术中，对于罗非鱼湖病毒的检测，主要以基于pcr扩增技术的各种分子生物学检测方法为主，但这些分子生物学方法都是检测病毒的核酸存在与否，方法单一，而且容易导致假阳性和假阴性结果，难以对该病做到定量检测与确诊。而且，基于pcr扩增技术的各种分子生物学检测方法通常需要将鱼致死获取组织。因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法的不足，如elisa、免疫胶体金检测方法，但如何获得可以用于elisa或免疫胶体金检测方法的高特异性抗体对于本领域而言仍是一个挑战。
5.因此，制备一种高特异性的抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其稳定表达细胞株对于防控和诊断罗非鱼湖病毒的传播具有重大的意义。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株，本发明中的细胞株能够稳定分泌抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性识别罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白，从而能够有效鉴别罗非鱼湖病毒，具有极高的应用价值。
7.本发明的第一个方面，提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞tilv s10e3，于2020年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2020209。
8.本发明中的杂交瘤细胞tilv s10 e3能够稳定分泌高滴度的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体，从而能够有效用于规模化制备抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体。
9.在本发明的一些优选实施方式中，本发明中的杂交瘤细胞tilv s10 e3通过如下步骤制备得到：
10.(1)s10重组表达蛋白的纯化：
11.以罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株为模板，使用引物f/r进行pcr扩增；
12.引物f/r的核苷酸序列为：
13.f：5
’‑
tatctgtcaagcgacagtgactc
‑3’
(seq id no:1)；
14.r：5
’‑
ctaagactgcacgtcaagagac
‑3’
(seq id no:2)。
15.其可以扩增罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株s10节段编码蛋白扩增第16～342位核苷酸区域，共109个氨基酸。扩增完成后，取扩增产物，通过本领域常规方法利用pet
‑
32a原核表达载体构建重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
s10。将鉴定正确的重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
s10转化至大肠杆菌bl21(de3)中，将筛选得到的阳性克隆菌接种于含有氨苄的lb培养基中，加入异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达。ni
‑
凝胶纯化得到纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白。
16.(2)动物免疫：
17.使用步骤(1)得到的纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白作为特异性抗原免疫小鼠。
18.(3)细胞融合：
19.将生长状态良好的sp2/0骨髓瘤细胞和步骤(2)中获得的免疫小鼠的脾细胞进行细胞融合。
20.(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆：
21.以纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白作为抗原进行间接elisa筛选，得到阳性杂交瘤细胞株，其中，最终得到的elisa测定值最高的阳性小鼠杂交瘤细胞株即为tilv s10 e3。
22.罗非鱼湖病毒til
‑4‑
2011毒株被公认为是一株罗非鱼湖病毒的标准毒株，且其是第一株完成全基因组测定的罗非鱼湖病毒株。本发明所用的病毒株为tilv
‑
2017a，其全基因组大小为10323bp，10个基因组节段的大小分别为1641bp、1471bp、1370bp、1250bp、1099bp、1044bp、777bp、657bp、548bp和465bp，中间无碱基缺失或增加。各节段拥有共同的5'端保守序列ccaaa，以及3'端保守序列atttgc，与标准株til
‑4‑
2011大小一致。发明人使用各种生物信息学分析方法对tilv
‑
2017a核苷酸与氨基酸序列进行分析，发现其s1、s2、s4和s5节段与ad
‑
2016株聚为一类，s3和s6节段与罗湖病毒标准株til
‑4‑
2011、ad
‑
2016株、f3
‑
4株和ec
‑
2012株等毒株较为接近；而s7、s8、s9和s10节段则在进化上较为独立。完整的tilv
‑
2017a s10节段由465个碱基组成，正链上有单一的orf。tilv
‑
2017a s10节段能够编码一个长为113个氨基酸的蛋白质，分子量为12.7kda，其与罗非鱼湖病毒标准株tilv
‑4‑
2011节段10蛋白(s10编码)一致性和相似性均非常高，具有可以作为特异性靶点的特性。
23.本发明的第二个方面，提供一种抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体，该抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体由本发明第一个方面所述的杂交瘤细胞株分泌。
24.本发明中的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体由本发明第一个方面所述的杂交瘤细胞株获得，其抗体效价为1：156250，抗体ig亚型为igg2b。对罗非鱼湖病毒具有较好的特异性。
25.本发明的第三个方面，提供一种用于检测罗非鱼湖病毒的试剂，该试剂中含有本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体。
26.所述试剂类型包括粉剂、溶液剂、胶囊剂等各种本领域常见剂型，当然，本领域技术人员也可以选择其他类型的剂型，以应对不同的使用场景。
27.本发明的第四个方面，提供一种用于检测罗非鱼湖病毒的试纸条，该试纸条中含有本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体。
28.本发明的第五个方面，提供一种用于检测罗非鱼湖病毒的检测芯片，该检测芯片中含有本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体。
29.本发明的第六个方面，提供一种用于检测罗非鱼湖病毒的检测芯片，该检测芯片中含有本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体。
30.根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述罗非鱼湖病毒检测试剂盒包括胶体金检测试剂盒和elisa检测试剂盒。
31.本发明的第七个方面，提供本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体或本发明第三个方面所述的试剂在制备罗非鱼湖病毒检测试剂盒中的应用。
32.根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述罗非鱼湖病毒检测试剂盒中还包括包被液、二抗、酶的底物反应液、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色剂和反应终止液。
33.根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述罗非鱼湖病毒检测试剂盒包括胶体金检测试剂盒和elisa检测试剂盒。
34.根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述罗非鱼湖病毒检测试剂盒的使用方法为：
35.包被本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体，封闭液封闭，加入待测样品，加入使用标记物标记的二抗，加入反应底物和显色剂进行显色，根据od值判断待测样品中是否含有罗非鱼湖病毒。
36.在本发明的一些优选实施方式中，是否含有罗非鱼湖病毒的判断方法为：
37.若od值大于或等于0.10，则待测样品中含有罗非鱼湖病毒；
38.若od值小于0.10，则待测样品中不含罗非鱼湖病毒。
39.在本发明的一些更优选实施方式中，该方法具体为：
40.①
包被：使用包被液稀释上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体(包被浓度为2.5μg/ml)，包被过夜；
41.②
用10％脱脂牛奶作为封闭液，37℃条件下封闭60min；
42.③
用pbst洗涤，加入待检样品，用封板膜封板后36～38℃孵育1～2h；
43.④
吸出上清，用pbst洗涤，并加入生物素标记的二抗(如biotin
‑
tilv s8单克隆抗体)，36～38℃孵育1～2h；
44.⑤
用pbst洗涤，加入hrp标记亲和素，孵育，洗涤，加入tmb显色剂显色；
45.⑥
检测od值，当od
450nm
≥0.10时，则判定为阳性，说明待检样品中含有罗非鱼湖病毒；若当od
450nm
＜0.10时，则判定为阴性，说明待检样品中不含罗非鱼湖病毒。
46.本发明的第八个方面，提供本发明第二个方面所述的抗罗非鱼湖病毒单克隆抗体或本发明第三个方面所述的试剂在罗非鱼湖病毒治疗药物筛选中的应用。
47.本发明的有益效果是：
48.1.本发明中的杂交瘤细胞tilv s10 e3是由sp2/0骨髓瘤细胞与免疫了罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的小鼠脾细胞融合得到，能够无限增殖并持续产生抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体。
49.2.本发明中的杂交瘤细胞tilv s10 e3所分泌的抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白单克隆抗体可以特异性识别罗非鱼湖病毒，其抗体效价为1：156250，抗体ig亚型为igg2b，对罗非鱼湖病毒具有较好的特异性。
50.3.本发明中的抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白单克隆抗体应用前景广阔，可用于各类体外检测、野毒株病毒筛选分离以及抗病毒药物筛选等多个方面，具有极高的应用及科研价值。
附图说明
51.图1为本发明实施例中的杂交瘤细胞tilv s10 e3的图像，其中，a为放大200倍下的图像，b为放大200倍下的图像；
52.图2为本发明实施例中的抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体的sds
‑
page电泳图，其中，1为marker，2为抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体；
53.图3为使用本发明实施例中的抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体的间接免疫荧光图像，其中，a是未感染病毒的正常tibc细胞，b为感染tilv
‑
2017a株病毒的tibc细胞。
具体实施方式
54.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
55.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
56.实验材料
57.罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株由中国水产科学研究院珠江水产研究所分离，经鉴定确认后保存在于实验室中。
58.抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体的制备
59.(1)s10重组表达蛋白的纯化：
60.设计靶向罗非鱼湖病毒s10节段序列的引物f/r，引物f/r的核苷酸序列为：
61.f：5
’‑
tatctgtcaagcgacagtgactc
‑3’
(seq id no:1)；
62.r：5
’‑
ctaagactgcacgtcaagagac
‑3’
(seq id no:2)。
63.以罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株为模板，使用上述引物f/r进行pcr扩增，其主要针对罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株s10节段编码蛋白扩增第16～342位核苷酸区域，共编码109个氨基酸。
64.扩增完成后，取扩增产物，通过本领域常规方法利用pet
‑
32a原核表达载体构建重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
s10，利用常规方法进行鉴定，检查pet
‑
32a原核表达载体是否构建成功。
65.将鉴定正确的重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
s10转化至大肠杆菌bl21(de3)中，筛选阳性克隆菌。将筛选得到的阳性克隆菌接种于含有氨苄的lb培养基中，加入异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达。使用ni
‑
凝胶纯化的方法对正确表达蛋白进行纯化，得到
纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白。
66.(2)动物免疫：
67.使用步骤(1)得到的纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白作为特异性抗原免疫小鼠，具体操作为：
68.取6只6周龄雌性balb/c小鼠，每只小鼠皮下注射步骤(1)得到的纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白进行基础免疫。第一次免疫时，将抗原与等量弗氏完全佐剂一起乳化，以100ug(抗原)/只的量进行免疫注射。第一次免疫两周后进行第二次免疫，将抗原与等量弗氏不完全佐剂一起乳化，以50ug(抗原)/只的量进行免疫注射。第二次免疫两周后进行第三次免疫，操作和使用剂量同第二次免疫，并以同样的间隔期进行第四次免疫(操作和使用剂量同第二次免疫)。第四次免疫一周后，进行小鼠断尾采血，检测抗体效价。第四次免疫两周后，选择效价检测结果最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫(操作和使用剂量同第二次免疫)。加强免疫3天后，取效价检测结果最高的小鼠的脾细胞与sp2/0细胞(骨髓瘤细胞)进行细胞融合。
69.(3)细胞融合：
70.将生长状态良好的sp2/0骨髓瘤细胞和步骤(2)中获得的免疫小鼠的脾细胞进行混合，开始细胞融合，其中，sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞的为1：10。两者混合后，加入1ml预热(37℃)的聚乙二醇(peg)，静置30～60s，沿管壁缓慢滴加5ml预热的1640培养液，然后加快滴加速度，加入15ml预热的1640培养液。加入20ml sp2/0骨髓瘤细胞培养液，混合均匀后，离心弃上清，将细胞混合液重悬至100ml预热的含15％fbs的hat培养基中，然后以100μl/孔的量将混合细胞液转移至96孔细胞培养板上，在37℃条件下孵育10天。
71.(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆：
72.孵育完成后，吸取培养上清液，以纯化的罗非鱼湖病毒s10重组表达蛋白作为抗原进行间接elisa筛选。
73.筛选出的阳性杂交瘤细胞株进一步用有限稀释法进行克隆，具体操作步骤如下：使用本领域常规方法计数阳性孔的活细胞数，加入1640培养液进行10倍比稀释。稀释后的稀释液加入接种有阳性杂交瘤细胞株的96孔细胞板中，置于37℃的细胞培养箱中孵育。
74.对孵育得到的细胞株连续进行2次检测，其中，取2次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法连续克隆2～3次。
75.最终得到的elisa测定值最高的阳性小鼠杂交瘤细胞株tilv s10 e3(图1)已于2020年11月5日保藏于武汉大学保藏中心(简称cctcc，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc no.c2020209)。
76.(5)腹水诱生及单抗纯化：
77.取6～8周龄雌性balb/c小鼠，腹腔内注射无菌液体石蜡，注射量为0.5ml/只。注射7天后，取效价较高同时细胞状态好的杂交瘤细胞重悬于无血清培养基中，按1
×
106个细胞/0.5ml/只的剂量注射试验小鼠，接种杂交瘤细胞后7～10天，可观察到实验腹部明显膨大，此时，抽取实验小鼠腹水，3000rpm离心10min，收集上清，用protein g亲和层析柱纯化，即得抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体。
78.使用sds
‑
page对纯化的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体进行检测，可以发现，纯化后的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体纯度高(图2)。
79.抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体特性检测
80.(1)抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体效价鉴定：
81.采用间接elisa法对上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体进行效价鉴定。
82.结果发现，上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体效价为1：156250，表明上述实施例中的杂交瘤细胞株tilv s10 e3具有分泌高滴度抗体的能力。
83.(2)抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体的亚型鉴定：
84.使用southern biotech的分型试剂盒(sba clonotyping
tm
system/hrp)对上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体进行ig亚型鉴定，具体操作方法可参考试剂盒说明书。
85.结果发现，上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体为igg2b型抗体。
86.(3)抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体的特异性检测：
87.采用间接免疫荧光法对上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体进行特异性检测，具体步骤如下：
88.将罗非鱼脑细胞(tibc细胞)在细胞培养板中传代培养，待细胞长至单层铺满80％左右后，使用罗非鱼湖病毒tilv
‑
2017a株病毒进行病毒感染。感染病毒5天后，吸尽细胞培养板中的培养基，用0.01mol/l的pbs洗涤3次，加入
‑
20℃预冷的甲醇溶液，并在
‑
20℃孵育30min，孵育结束后，除去甲醇，室温干燥1h。向干燥处理后的细胞板中每孔加100μl的稀释过(单克隆抗体与稀释液的稀释比为1：1000，稀释液为磷酸盐吐温缓冲液(pbst))的上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体(鼠抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体)，37℃孵育1h。使用pbst洗涤3次，加入稀释比为1:3000(稀释液为pbst)的羊抗鼠igg
‑
fitc标记的荧光二抗100μl，37℃孵育1h。使用pbst洗涤3次，加入细胞核染料pi反应5min，于显微镜下观察荧光情况。设置阴性对照(未感染病毒的正常tibc细胞)。
89.结果如图3所示。
90.由图3可以看出，间接免疫荧光试验结果显示，上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体能使感染tilv
‑
2017a株病毒的tibc细胞能产生特异性的荧光，而在未感染病毒的正常tibc细胞中没有观察到荧光信号，说明上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体可以特异性识别感染tibc中tilv
‑
2017a株病毒粒子上的对应蛋白，从而具有抗罗非鱼湖病毒特异性。
91.抗罗非鱼湖病毒s10节段编码蛋白的单克隆抗体在双抗夹心elisa检测中的应用
92.上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体能可用于常规双抗夹心elisa检测，具体操作步骤如下：
93.(1)确定抗体工作浓度：
94.将上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体用碳酸氢盐包被液(ph＝8.6)进行梯度稀释(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、0.078125μg/ml)。包被96孔酶标板，在每孔中分别加入100μl不同稀释浓度的单克隆抗体包被液混合物，4℃包被过夜。然后向每孔中加入300μl的10％脱脂牛奶(10g脱脂奶粉加100ml的水)进行封闭，37℃孵育1h。用pbst洗涤3次，每次3～
5min。将纯化的罗非鱼湖病毒稀释为100ng/ml，向每孔加入100μl进行elisa棋盘滴定，37℃孵育1h。用pbst洗涤3次，每次3～5min。选择biotin
‑
tilv s8单克隆抗体(本实验室表达罗非鱼湖病毒s8重组蛋白并免疫小鼠，制备鼠抗罗非鱼湖病毒s8重组蛋白的单克隆抗体，选取效价最高的tilv s8 a2杂交瘤细胞株纯化单克隆抗体，并用生物素标记)作为二抗(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml)，每孔分别加入100μl，37℃孵育1h。用pbst洗涤3次，每次3～5min。加入1:2000稀释的辣根过氧化酶标记的亲和素，37℃温箱中孵育1h，用pbst洗涤3次，每次3～5min。加入100μl显色底物(tmb)，37℃避光显色10min。用50μl 2mol/l h2so4终止反应。测定各孔od
450
nm值，确定抗体工作浓度。
95.棋盘滴定结果表明，当上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体的包被浓度为2.5μg/ml时，biotin
‑
tilv s8单克隆抗体的最佳工作浓度为5μg/ml时，p/n值最大，阳性样品od
450nm
值高于1.0，阴性样品od
450nm
值小于0.1。说明上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体最适包被浓度为2.5μg/ml，且可以用于双抗夹心elisa检测。
96.(2)最佳封闭液和封闭时间的确定：
97.①
封闭液选择实验：
98.分别选择1％脱脂牛奶、2.5％脱脂牛奶、5％脱脂牛奶、10％脱脂牛奶、20％脱脂牛奶和1％bsa作为封闭液进行封闭试验。其他操作步骤同步骤(1)。
99.②
封闭时间选择实验：
100.分别选择30min、60min、90min、120min作为封闭时间进行封闭试验。其他操作步骤同步骤(1)。
101.结果表明，在封闭液选择选择实验中，用10％脱脂牛奶作为封闭液的p/n值最高，而且阳性样品od
450nm
值大于1.0，阴性血清od
450nm
值小于0.1，封闭效果最好，因此，10％脱脂牛奶为最佳封闭液。而在封闭时间选择实验中，37℃条件下封闭60min时p/n值最高，因此，60min为最佳封闭时间。
102.(3)构建罗非鱼湖病毒双抗夹心elisa检测方法：
103.根据步骤(1)和(2)的结果，构建罗非鱼湖病毒双抗夹心elisa检测方法，包括如下步骤：
104.①
包被：使用包被液稀释上述实施例中获得的抗罗非鱼湖病毒s10重组蛋白的单克隆抗体(包被浓度为2.5μg/ml)，包被过夜；
105.②
用10％脱脂牛奶作为封闭液，37℃条件下封闭60min；
106.③
用pbst洗涤，加入待检样品，用封板膜封板后36～38℃孵育1h；
107.④
吸出上清，用pbst洗涤，并加入生物素标记的二抗(如biotin
‑
tilv s8单克隆抗体)，36～38℃孵育1h；
108.⑤
用pbst洗涤，加入hrp标记亲和素，孵育，洗涤，加入tmb显色剂显色；
109.⑥
检测od值，当od
450nm
≥0.10时，则判定为阳性，说明待检样品中含有罗非鱼湖病毒；若当od
450nm
＜0.10时，则判定为阴性，说明待检样品中不含罗非鱼湖病毒。
110.(4)罗非鱼湖病毒双抗夹心elisa检测方法的最低检测限：
111.使用步骤(3)中的方法，以初始浓度为2.5mg/ml的纯化罗非鱼湖病毒液(以pbs进行2倍倍比稀释)为检测对象，以未免疫的正常罗非鱼血清为阴性对照进行检测。
112.结果如表1所示。
113.表1罗非鱼湖病毒双抗夹心elisa法的检测结果(od值≥0.10判为阳性)
[0114][0115][0116]
根据表1中的病毒浓度与平均od值，绘制标准曲线方程，其方程为：
[0117]
y＝2e
‑
07x3‑
0.0002x2 0.0389x 0.0017；
[0118]
r2＝0.9991。
[0119]
以od值≥0.10为检测结果阳性，通过方程可计算出上述方法的最低检测浓度为0.47ng/ml罗非鱼湖病毒。
[0120]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。