与多个Fc同种型和亚类偶联的抗原结合片段的制作方法

与多个fc同种型和亚类偶联的抗原结合片段1.本技术要求于2019年3月18日提交的美国临时申请62/819,748的权益，其通过引用整体并入本文。2.发明背景3.通过体外筛选技术(包括噬菌体展示、细菌展示或核糖体展示)从文库(如pcr衍生库、半合成库或全合成库)分离的抗体通常以抗原结合片段(例如，scfv或fab)的形式表达。这是因为细菌表达系统通常不允许功能性全长抗体的表达。制备含有抗原结合片段的抗体库的其他原因包括基于内在结合亲和力而不是基于抗体二价性引起的亲合力来选择所需抗体。在鉴定所需抗原结合片段的典型选择实验(例如淘选)后，将编码所需抗体的基因富集池亚克隆到细菌表达载体中以供进一步分析。4.从这些文库中分离的抗原结合片段通常需要随后转化为不同同种型(isotype)和亚型(subclass)的全长抗体，如人igg1-4、iga、ige或igm，或转化为具有不同物种(如小鼠、大鼠、兔、山羊或鸡)fc区的抗体。含有所需抗原结合片段的全长抗体用于抗原结合片段的具体实际应用。5.例如，全长抗体可以用作诊断分析中的阳性对照或校准品，在诊断分析中，测定患者样本是否存在针对给定靶标的抗体。这通常在诊断传染病或自身免疫性疾病时进行。在这些情况下，阳性对照抗体需要包含将要检测的抗体的fc片段，例如igg1或ige或igm，以使同种型和亚类特异性抗fc检测试剂与对照抗体结合。或者，在同一实验中，具有来自预先确定的物种的fc和预先确定的同种型的全长抗体可与来自不同物种或具有不同同种型的其他抗体组合使用，即多重化，例如在western印迹或ihc实验中，如果使用物种特异性或同种型特异性二抗进行检测。6.将抗原结合片段转化为全长抗体以及随后的生产需要几个步骤，这是一个耗时数周的繁冗过程。首先，编码抗体可变结构域的基因通常被重新合成，以采用用于抗体生产的哺乳动物表达系统的密码子用法。有时，在所选抗原结合片段的cdr区域中存在潜在的糖基化位点，在真核细胞中表达前需要通过定点突变去除。cdr区的这种突变可能改变抗体亲和力或特异性。其次，将合成的可变重(vh)链和可变轻(vl)链基因片段克隆到哺乳动物表达载体中，该表达载体包含编码抗体恒定区的必要基因片段(例如，igg1的cl和ch1铰链-ch2-ch3)。第三，制备质粒dna并用于转染合适的哺乳动物细胞系。第四，将转染的细胞系在培养物中扩增数天，直到获得含有抗体的上清液。第五，从细胞培养上清液中纯化抗体。如果作为具有多个同种型和亚类(例如，igg1和igg2)的全长抗体或来自多个物种的fc片段需要相同的抗原结合位点，则必须对每一类型重复克隆和表达步骤。7.蛋白连接8.有几种技术可以使多肽在特定的预先确定的位点共价偶联。一个例子是分选酶系统(schmohl等，2014)，其中短肽(分选基序)遗传融合到一个多肽的c端，两个甘氨酸残基遗传融合到第二多肽的n端(或反之亦然)。在存在分选酶的情况下，两种修饰的多肽融合在一起。其他酶促蛋白连接酶系统基于蝶豆粘酶(nguyen等，2014)或肽基连接酶(toplak等，2016)。9.另一个例子是将编码一个或多个半胱氨酸的核苷酸框内添加到两条多肽的c端或n端。当这种含游离半胱氨酸的多肽在氧化条件下混合时，它们将形成二硫键。然而，这类系统的问题是有许多副产物被合成以及还原条件下二硫键的不稳定性。10.第三个例子是所谓的spytag/spycatcher(reddington等，2015)系统。在此，自然存在的蛋白质中自发的异肽形成的概念被用于将一个多肽共价连接到另一个多肽上。包含这样的异肽键的酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)蛋白fbab的一个结构域被分为两部分。一个部分是spytag，其是一种13个氨基酸的肽，其中包含自催化中心的一部分。另一部分是spycatcher，其是一个116个氨基酸的蛋白质结构域，包含中心的其他部分。混合这两种多肽可恢复自催化中心并导致异肽键的形成，从而将spytag(seqidno:7)与spycatcher(seqidno:8)共价连接(zakeri等人，2012)。进一步的工程改造获得spycatcher的缩短版本，其只有84个氨基酸(seqidno:9)，以及优化的版本spytag002(seqidno:34)和spycatcher002(seqidno:28)(li等，2014和keeble等，2017)以及spytag003(seqidno:43)和spycatcher003(seqidno:44)，其具有加快的反应(keeble等,2019)；它们都在此通过引用将其全文并入本文。该系统的另一种改进是spyligase的发明(fierer等，2014)，其是通过将fbab结构域分为spytag、k-tag和spyligase三个部分实现的。spytag和k-tag都是通过添加spyligase而共价融合的短肽。11.此类系统的应用包括通过环化稳定蛋白质、疫苗生成、通过将链霉亲和素/生物素与spytag/spycatcher整合实现蛋白质的多聚化(reddington等人，2015年)，亲合体和fab多聚化(fierer等人，2014年)、从模块生成抗体(alam等人，2017年)以及抗体药物偶联物的产生(siegmund等人，2016年)，以及双特异性抗体的产生(yumura等人，2017年)。使用肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)的粘附素rrga开发了一种类似的系统，称为snooptag/snoopcatcher(veggiani等人，2016)，后来开发了snoopligase系统(buldun等人，2018)。snooptag(seqidno:35)/snoopcatcher(seqidno:36)技术在此通过引用全部合并。12.发明概述13.本发明的某些实施方式提供了一种全长抗体，其包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段(术语“fccatcher”在实施例部分中用于描述该结构)，其中所述第一结合基序和所述第二结合基序能够通过蛋白质连接彼此共价偶联，并且其中所述抗原结合片段和所述fc片段来自不同物种。本发明的特定实施方式还提供了多个全长抗体，其中每个全长抗体包括特异性结合到独特抗原的抗原结合片段，并包括位于c端的第一结合基序和属于物种、同种型和亚类独特组合的fc片段，且包括n端的第二结合基序，其中每个抗体的第一结合基序和第二结合基序可通过蛋白质连接彼此共价结合。14.本发明的特定实施方式提供多个fc片段，每个fc片段在n端包含结合基序，其中结合基序可通过蛋白质连接共价偶联到适当的抗原结合片段，该抗原结合片段在其c端具有另一结合基序。此外，在多个fc片段中，每个fc片段属于物种、同种型和/或亚类的独特组合。通过使用这样的多个fc片段，可以通过fc片段和抗原结合片段的蛋白质连接产生全长抗体或全长抗体样结构，其中每一个片段包含适当的结合基序。由此产生的全长抗体群可用于多种应用，例如多重免疫分析。15.有助于在fc片段和抗原结合片段之间形成共价键的第一和第二结合基序包括spytag序列、spycatcher序列、snooptag序列、snoopcatcher序列、isopeptag/断裂spy0128、sdytag/sdycatcherdang短、spyligase、snoopligase、分选酶基序、蝶豆粘酶底物和肽基连接酶底物。还提供了通过将样本与多个全长抗体接触来检测样本中多个抗原的分析。还提供了编码多个全长抗体的核酸构建体。16.附图简要说明17.图1显示了考马斯染色的sds-page凝胶的图像，该凝胶显示了如实施例3所述，将fab-spytag2与人igg1-fccatcher3连接时的产物形成动力学。18.图2显示了如实施例4所述的elisa滴定实验的结果，将与人igg1形式的相同抗体与连接到higg1-fccatcher3的fab-spytag2抗体相比。使用人抗fc:hrp二抗进行检测。19.图3显示了实施例5所述的fab-spytag与来自不同物种的fccatcher连接反应的还原产物的经考马斯染色的sds-page凝胶图像。20.图4显示了免疫荧光研究中使用的三种一抗和二抗的方案，以及u2os细胞染色的最终免疫荧光图像，如实施例5所述。21.图5显示jurkat细胞与小鼠抗cd3fab-spytag2/higg1-fccatcher3连接产物以及小鼠抗cd45fab-spytag2/rbigg-fccatcher3连接产物和荧光标记的抗人和抗兔抗fc二抗共同染色的流式细胞术数据，如实施例6所述。技术实现要素：22.本发明实现蛋白质连接以避免目前从抗原结合片段生产全长抗体所需的步骤。本发明提供修饰的fc片段，其配备有允许位点特异性蛋白质偶联的基序。这种修饰的fc片段可以从来自不同物种、同种型和亚类的fc序列信息制备，例如人igg1、小鼠igg2a或兔igg等。在与抗原结合片段结合之前，修饰的fc片段也可与合适的标记物偶联，例如荧光染料或检测酶，如hrp。23.因此，本发明的某些实施方式提供了一种全长抗体，其包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段，其中，第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接彼此共价偶联。为了产生这种全长抗体，制备c端带有第一结合基序的抗原结合片段，以及n端带有第二结合基序的fc片段，将抗原结合片段-第一结合基序融合蛋白与fc片段-第二结合基序融合蛋白在适当条件下混合以促使第一结合基序和第二结合基序的蛋白质连接以产生全长抗体。由此产生的全长抗体可进一步纯化。例如，该反应可产生仅含有一个连接到fc的fab的抗体。例如，可通过使用蛋白质a柱或特异性结合到引入到fc或fab片段上的标签的柱的尺寸排阻层析或亲和层析去除此类副产物。24.通常，抗原结合片段从第一物种获得，fc片段从不同于第一物种的第二物种获得。例如，如果抗原结合片段是从人抗体获得的，则fc片段可以从小鼠抗体获得。可以使用不同物种的任意组合。在优选实施方式中，连接到fc片段的抗原结合片段结合到相同表位。抗原结合片段和fc片段可从人类、非人灵长类动物、啮齿动物(如小鼠和大鼠、兔子、仓鼠)、山羊、绵羊、牛、猪、马、狗、猫和骆驼等衍生而来。可用于本发明的其他物种在本领域中是众所周知的，并且此类实施方式在本发明的范围内。25.在某些实施方式中，本发明提供可用于相同分析反应(即用于多重化)的多个全长抗体。因此，这样的实施方式提供了多种全长抗体，其中每种全长抗体包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段，其中，第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接彼此共价偶联。此外，在一组多个全长抗体中，每个抗原结合片段特异性结合到独特抗原，并且每个fc片段属于独特物种、同种型和亚类。在这样的实施方式中，抗原结合片段和fc片段可以是异源的(源自不同的人类或非人动物物种，例如，人抗原结合片段通过结合基序共价偶联到小鼠fc片段)或同源的(来源于同一物种，例如，通过结合基序与人类fc片段共价偶联的人抗原结合片段)。26.在进一步的实施方式中，本发明提供抗原结合片段和fc片段，其中抗原结合片段和fc片段可偶联以形成全长抗体。在某些实施方式中，抗原结合片段在c端包含第一结合基序，而fc片段在n端包含第二结合基序，其中，当第一结合基序和第二结合基序在适当条件下彼此接触时，它们可通过蛋白质连接彼此共价偶联。抗原结合片段和/或fc片段可偶联到可检测标记物，尤其是光学标记物。27.为了产生全长抗体，将在其c端含有第一结合基序的抗原结合片段与在n端含有第二结合基序的fc片段混合。在促进第一结合基序和第二结合基序的蛋白质连接的适当条件下进行此类混合。由此产生的全长抗体可进一步纯化。例如，该反应可产生仅含有一个连接到fc的fab的抗体。例如，可通过使用蛋白质a柱或特异性结合到引入到fc或fab片段上的标签的柱的尺寸排阻层析或亲和层析去除此类副产物。28.还提供了用于产生全长抗体的试剂盒。该试剂盒可包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段。抗原结合片段和/或fc片段可偶联到可检测标记物，尤其是光学标记物。因此在一些实施方式中，试剂盒包括下述组分的两种或多种：29.1.抗原结合片段，在其c端包含第一结合基序，任选地包含可检测标记物(例如，生物素、hrp或荧光团)；和30.2.fc片段，在其n端包含第二结合基序，任选地包含可检测标记物(例如，生物素、hrp或荧光团)；和/或31.3.核酸构建体，其包含编码如1和/或2所定义的肽的多核苷酸序列，32.其中，所述第一结合基序和所述第二结合基序能够通过蛋白质连接相互共价偶联。33.试剂盒使用者可在适当条件下混合抗原结合片段和fc片段，其中抗原结合片段和fc片段将通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。试剂盒用户还可以使用包含编码抗原结合片段和/或fc片段的多核苷酸序列的核酸构建体在合适的宿主中表达任何肽。34.试剂盒的每种组分可在使用前以液体形式(例如，溶液)或以固体形式(例如，粉末)提供，其在使用前用液体(例如，缓冲液)重建。在一些实施方式中，试剂盒还包括用于连接一个或多个结合对的说明。35.术语“标记物”或“可检测标记物”指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料(荧光团)、荧光淬灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如，elisa中常用的酶)、生物素、地高辛、32p和其它放射性同位素、可被检测的半抗原、蛋白质、核酸或其他物质，例如通过将标记物掺入寡核苷酸或肽。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的多种荧光团的组合。36.示例性可检测标记物包括但不限于荧光团、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(gfp)、生物素、酶(例如辣根过氧化物酶(hrp)或其他过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶)和断裂(split)荧光蛋白(例如断裂gfp)或酶(例如，promega的binarytechnology)。示范性荧光团包括但不限于alexa染料(例如alexa350,alexa430,alexa488,等),amca,bodipy630/650,bodipy650/665,bodipy-fl,bodipy-r6g,bodipy-tmr,bodipy-trx,级联蓝,cy2,cy3,cy5,cy5.5,cy7,cy7.5,dylight染料(dylight405,dylight488,dylight549,dylight550,dylight649,dylight680,dylight750,dylight800),6-fam,荧光素,fitc,hex,6-joe,oregongreen488,oregongreen500,oregongreen514,太平洋蓝,reg,罗丹明绿,罗丹明红,rox,r-藻红蛋白(r-pe),星光蓝染料(例如星光蓝520,星光蓝700),tamra,tet,四甲基罗丹明,得克萨斯红和tritc。37.如本文所用，短语“抗原结合片段”指包含抗体(例如fab)的抗原结合部分。其他抗原结合片段包括可变片段(fv)、单链可变片段(scfv)或重链抗体可变结构域(vhh)。抗原结合片段的进一步例子包括包含抗原结合位点的单价形式的抗原结合片段，且包括单链fab片段(scfab)、单域抗体(sdad)、鲨鱼可变新抗原受体(vnar)或可变淋巴细胞受体(vlr)。此外，从非抗体支架衍生的结合试剂，如粘合素、亲和体、darp素(darpin)、抗运载蛋白(anticalin)、单体(monobody)，也被认为是“抗原结合片段”。抗原结合片段的其它例子在本领域中是众所周知的，并且此类抗原结合片段的用途在本发明的范围内。38.短语“每个fc片段属于物种、同种型和亚类的独特组合”表示多个全长抗体集合中的全长抗体的fc片段属于物种、同种型、亚类和同种异型的特定组合，没有其它来自多个全长抗体的fc片段具有该物种、同种型和亚类的相同组合。因此，如果多个全长抗体的集合包含五十个全长抗体，则五十个抗体中的每一个具有属于与剩余四十九个fc片段相比物种、同种型、亚类或同种异型组合不同的fc片段。39.通常，一个特定的物种会产生几种类型的抗体。例如，人或小鼠能够产生五种抗体重链相关的同种型，即iga、igd、ige、igg和igm。每个同种型还可能包含几个亚类。例如，人igg有四个亚类，即igg1、igg2、igg3和igg4。因此，一个物种可以包含许多抗体同种型和每个同种型中的几个亚类。本领域技术人员可以从适当的物种中识别和选择适当的同种型亚类以用于本发明。例如，一组五个全长抗体可包含五种fc片段，例如人igg1、人igg2、人iga、小鼠igg3和小鼠ige。此外，某个亚类(如igg1)可能包含许多同种异型，这些同种异型是该亚类在物种遗传库中的变体。例如，人igg1亚类包含可在氨基酸序列上区分的同种异型g1m(za)、g1m(f)、g1m(fa)、g1m(zax)和g1m(zav)。在igg1中，大多数氨基酸差异位于ch3结构域。本发明中可使用具有不同同种异型的fc片段，例如，如果用于检测抗体的试剂具有同种异型特异性。40.如上所述，该组全长抗体可用于多重分析，即，多个全长抗体可用于检测分析中的多个抗原。因此，在多个全长抗体中，每个抗原结合片段特异性地结合到一个独特的抗原，并且每个fc区域可以用物种-或同种型-或亚类-或同种异型特异性二级试剂检测。41.短语“每个抗原结合片段特异性地结合到一个独特的抗原”指所述多个全长抗体集合中的全长抗体的抗原结合片段特异性结合指定抗原，并且所述多个全长抗体中的其他全长抗体均不结合到相同抗原。因此，如果一组多个全长抗体包含50个全长抗体，则与剩余的49个全长抗体相比，这50个抗体中的每一个都与不同的抗原特异性结合。42.因此，在某些实施方式中，本发明提供多个全长抗体，其中该组中的每一个全长抗体与独特的标记物结合。在该实施方式中，对于多个全长抗体，fc片段可以是相同的，并且抗原(或表位)特异性抗体通过该独特的标记物区分。因此，所述多个全长抗体中的全长抗体与标记物结合，并且所述多个全长抗体中的其他全长抗体对相同抗原(或表位)没有相同的标记物或特异性。因此，如果多个全长抗体的集合包含五十个全长抗体，五十个抗体中的每一个对于不同抗原(或表位)具有不同的标记物和特异性。在每个全长抗体上存在独特标记物有助于对独特fc片段进行定量，从而对与全长抗体结合的独特抗原进行定量。在一个特定实施方式中，标记可以是独特的珠。例如，由多重免疫分析系统提供了独特珠的组合，该系统在单个样品中提供多达100种不同分析的多重化。使用不同颜色的珠可以同时多重检测多种全长抗体，从而在同一样本中检测多种抗原。43.在更进一步的实施方式中，本发明提供了多个全长抗体，多个抗体中的每一个具有fc片段，其允许通过使用对独特fc片段特异性的二抗基于fc片段来区分抗体。因此，在多重反应中，可以使用不同的二抗来区分不同的fc片段，从而区分不同抗体识别的不同抗原。44.多个全长抗体中的独特fc片段可通过针对独特fc片段的二抗检测。因此，本发明的某些实施方式进一步包含针对所述多个独特fc片段的多个二抗，其中每个二抗特异性结合来自特定物种、亚型和亚类(以及可能的同种异型)的独特fc片段。每个二抗可与独特可检测标记物偶联，其中每个二抗上的独特标记物有助于独特fc片段的定量，从而有助于全长抗体结合的独特抗原的定量。45.此外，本发明的某些实施方式进一步包含针对所述多个独特fc片段的多个二抗，其中每个二抗特异性结合来自特定物种、亚型和亚类的独特fc片段，且其中每个二抗与独特珠偶联。46.bio多重免疫分析系统提供了独特珠组合的示例。该技术实现了多重免疫分析，其中针对独特fc片段的一个二抗连接到具有相同颜色的一组珠上，并且可以例如通过使用可检测标记物来可视化连接到独特珠组上的此类二抗。使用不同颜色的珠可以同时多重检测同一样本中的多种抗原。47.在某些实施方式中，本发明提供在其n-端包含结合基序的多个fc片段。这样的多个fc片段可用于产生一组可定制的全长抗体，这些抗体结合到感兴趣的单个抗原或多个抗原。例如，多个感兴趣的抗原结合片段随后可表达成在其c端具有合适的结合基序，并且此类抗原结合片段可与合适的fc片段混合以产生定制的多个全长抗体。因此，本发明的某些实施方式提供多个fc片段，每个fc片段在n端包含结合基序，其中结合基序可通过蛋白质连接共价偶联到具有适当结合基序的抗原结合片段。此外，在多个fc片段内，每个fc片段可以属于相同的物种、同种型和亚类，或者是独特的(例如，来自独特物种、同种型或亚类)。48.本发明的一个特定实施方式提供了多个抗原结合片段，其中每个抗原结合片段在c端(c-terminus)与第一结合基序融合，每个抗原结合片段特异性结合到相同的抗原，但识别抗原上的不同表位和/或具有不同的抗原结合亲和力。来自多个抗原结合基序的每个第一结合基序在与存在于fc片段n端(n-terminus)的第二结合基序彼此接触时可自发或借助酶形成共价键。本实施方式提供“合成多克隆抗体制剂”，即特异性结合到相同抗原的抗体制剂；然而，制剂中的每个抗体识别不同的表位和/或具有不同的结合亲和力。如上所述，每个fc片段可以属于相同的物种、同种型和亚类，或者是独特的(例如，来自独特物种、同种型或亚类)。49.本发明的其他实施方式提供了一种产生多个全长抗体的方法。该方法包括将来自多个抗原结合片段的一个抗原结合片段与来自多个fc片段的一个fc片段接触，其中，所述多个抗体结合片段中的每一个在其c端包含第一结合基序，并且所述多个fc片段中的每一个在其n端包含第二结合基序。接触抗原结合片段和fc片段的条件使得在第一结合基序和第二结合基序之间形成共价键。因此，产生了多个全长抗体，每个抗体包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段。50.如上所述，有几种技术能够通过“蛋白质连接”在特定的预定位点实现多肽的共价结合。本文使用的术语“蛋白质连接”是指通过第一蛋白质上的第一结合基序与第二蛋白质上的第二结合基序的共价键结合，其中，当第一结合基序和第二结合基序彼此接触且共价键在适当条件下自发形成或在酶的帮助下形成时，发生偶联。通常，第一结合基序存在于第一蛋白的c端，第二结合基序存在于第二蛋白的n端。通常，第一蛋白表达为其c端具有第一结合基序的融合蛋白，第二蛋白表达为其n端具有第二结合基序的融合蛋白。51.术语“第一结合基序”是指连接到抗原结合片段的c端并且通过蛋白质连接到存在于fc片段n端的第二结合基序以促进共价键形成的肽序列。类似地，术语“第二结合基序”是指连接到fc片段的n端并且通过蛋白质连接到存在于抗原结合片段c端的第一结合基序以促进共价键形成的肽序列。52.如上所述，“蛋白质连接”是指当第一结合基序和第二结合基序彼此接触时，第一结合基序和第二结合基序之间自发或借助酶形成共价键。此外，如本发明所述，蛋白质连接发生在肽序列的特定组合之间，例如，在spytag和spycatcher、snooptag和snoopcatcher、分选酶识别域和分选酶桥接域、蝶豆粘酶识别基序和另一多肽的氨基端、spytag002(seqidno:34)和spycatcher002(seqidno:28)、spytag(seqidno:29)和k-tag(seqidno:33)、spytag003(seqidno:43)和spycatcher003(seqidno:44)等。53.因此，为了产生本发明的全长抗体，存在于抗原结合片段c端的第一结合基序能够通过蛋白质连接与fc片段n端的第二结合基序形成共价键。例如，如果存在于抗原结合片段c端的第一结合基序是spytag，或改进版本spytag002或spytag003，则存在于fc片段n端的对应第二结合基序是spycatcher，或改进版本spycatcher002或spycatcher003。或者，如果存在于抗原结合片段的c端的第一结合基序是spycatcher，或改进版本spycatcher002或spycatcher003，则存在于fc片段的n端的对应第二结合基序是spytag，或改进版本spytag002(seqidno:34)或spytag003(seqidno:43)。54.类似地，如果存在于抗原结合片段的c端的第一结合基序是snooptag(seqidno:35)或与seqidno:35至少70％相同的序列，则存在于fc片段n端的对应第二结合基序是snooptacher(seqidno:36)或与seqidno:36至少50％相同的序列。或者，如果存在于抗原结合片段的c端的第一结合基序是snoopcatcher(seqidno:36)或与seqidno:36至少70％相同的序列，则存在于fc片段n端的对应第二结合基序是snooptag(seqidno:35)或与seqidno:35至少50％相同的序列。55.此外，在酶促蛋白质连接的情况下，如果存在于抗原结合片段的c端的第一结合基序是spytag，则存在于fc片段的n端的对应第二结合基序是k-tag。或者，如果存在于抗原结合片段的c端的第一结合基序是k-tag，则存在于fc片段的n端的对应第二结合基序是spytag。在这两种情况下，都需要一种spyligase来催化两个标签之间的异肽键的形成。56.因此，选择存在于抗原结合基序的c端的第一结合基序和存在于fc片段的n端的第二结合基序，使得这两个基序通过蛋白质连接自发地或借助于酶相互作用，形成共价键。57.这些蛋白质的表达可以在合适的宿主细胞中进行，包括原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞例如酵母或cho细胞。本领域普通技术人员已知用于表达融合蛋白的合适技术，并且此类实施方式在本发明的范围内。58.因此，一种蛋白质连接系统包括将第一结合基序连接到第一蛋白质和将第二结合基序连接到第二蛋白，并通过第一结合基序和第二结合基序之间的共价结合将第一蛋白和第二蛋白共价连接。这种共价结合可以是自催化的，即通过第一结合基序和第二结合基序之间的相互作用进行催化。共价结合也可以通过催化这种结合反应的酶来实现。59.蛋白质连接的非限制性实例包括：分选酶系统、蝶豆粘酶系统、肽基连接酶系统、半胱氨酸介导的二硫键形成、spytag/spycatcher系统、spytag和较短版本的spycatcher、spytag002/spycatcher002或spytag003/spycatcher003的加速反应系统；spytag/k-tag/spyligase系统和snooptag/snoopcatcher系统。本领域普通技术人员已知蛋白质连接系统的其它例子，并且其在本发明的范围内。60.因此，产生蛋白质连接系统的具有c端融合的第一结合基序的融合蛋白形式的抗原结合片段，和产生蛋白质连接系统的具有n端融合的第二结合基序的融合蛋白形式的fc片段。抗原结合片段融合蛋白和fc片段融合蛋白可相互混合(适当时，在酶蛋白连接的情况下在适当的酶存在下)制备人工全长抗体，该全长抗体含有共价连接的抗原结合片段融合蛋白的c端第一结合基序和所述fc融合蛋白的n端第二结合基序。61.上述或本领域已知的任何蛋白质连接系统可用于产生全长抗体。下面讨论某些此类蛋白质连接系统。62.spytag/spycatcher63.美国专利第9,547,003号(其公开内容通过引用整体并入本文)公开了spytag/spycatcher系统的组成。在这方面，美国专利号9,547,003中公开的肽标签和结合伴侣可以用作本发明中的结合基序。因此，适合用于本发明的结合基序可以从seqidno:1或3或5或6衍生，并且可以具有任何长度，例如，长度约为5-50个氨基酸(例如，长度约为10、20、30、40或50个氨基酸)或更长。表1中提供了spytag/spycatcher系统的示例性第一和第二结合基序。64.结合基序可与fc片段在n端或与抗原结合片段在c端融合。特别地，间隔序列(例如，富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子)可以侧接结合基序，以增强反应的可及性。显而易见，第一和第二结合基序可在抗体片段之一上互换(例如，第一结合基序可以融合到fc片段的n端，第二结合基序可以融合到抗原结合片段c端，或者第二结合基序可以融合到fc片段的n端，第一结合基序可以融合到抗原结合片段c端)。65.因此，在某些实施方式中，第一结合基序可包含seqidno:1或seqidno:25或seqidno:27中所述序列的残基302-308，或与seqidno:1或25或27具有至少50％同一性的序列，其中所述第一结合基序的长度小于50个氨基酸。在某些实施方式中，第一结合基序与seqidno:1具有至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85、约90或约95％的同一性，且长度小于50个氨基酸。更特别地，第一结合基序可包含seqidno：1的残基302-308、301-308、300-308、299-308、298-308、297-308、296-308、295-308、294-308、293-308、292-308、291-308或290-308或与这些序列具有至少约50％至95％同一性的序列。优选地，第一结合基序包含seqidno：1中303位的反应性天冬酰胺，即，该残基优选是不变的。此外，第一结合基序可以是seqidno:1或25的片段，并且在优选实施方式中，第一结合基序少于50个氨基酸，并且包含seqidno:1中所述序列的残基293-308，或者包含与其具有至少50％同一性的序列。第一结合基序优选包含少于50个氨基酸。因此，第一结合基序不包含seqidno:1的序列，而仅包含其特定片段，或与该特定片段具有至少50％同一性(例如，75、80、85、90或95％同一性)的序列。其他实施方式利用seqidno：25或与其具有至少50％序列同一性的序列作为结合基序。66.如果第一结合基序是上段中列出的任何序列，则第二结合基序可以包含以下或由以下组成seqidno:26或seqidno:28或seqidno:1中列出的序列的残基31-291，或与其具有至少50％同一性的序列，例如，与seqidno:26或seqidno:28或seqidno:1的残基32-291具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性的序列。明确排除的是seqidno：1中列出的完整序列，但是，第二结合基序优选包含与seqidno：1的179位相对应的反应性赖氨酸。特别地，第二结合基序包含seqidno：1所示序列的残基31-292、31-293、31-294、31-295、31-296、31-297、31-298、31-299、31-300、31-301或31-302或与其具有至少70％同一性的序列，但seqidno：1的序列除外。67.或者，在某些实施方式中，第二结合基序可包含seqidno:1或seqidno:25或seqidno:27中所述序列的残基302-308，或与seqidno:1或25或27的残基302-308具有至少50％同一性的序列，其中所述第二结合基序的长度小于50个氨基酸。在某些实施方式中，第二结合基序与seqidno:1具有至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85、约90或约95％的同一性，且长度小于50个氨基酸。更特别地，第二结合基序可包含seqidno：1的残基302-308、301-308、300-308、299-308、298-308、297-308、296-308、295-308、294-308、293-308、292-308、291-308或290-308或与这些序列具有至少约50％至95％同一性的序列。优选地，第二结合基序包含seqidno：1中303位的反应性天冬酰胺，即，该残基优选是不变的。此外，第二结合基序可以是seqidno:1或25的片段，并且在优选实施方式中，第二结合基序少于50个氨基酸，并且包含seqidno:1中所述序列的残基293-308，或者包含与其具有至少50％同一性的序列。第二结合基序优选包含少于50个氨基酸。因此，第二结合基序不包含seqidno:1的序列，而仅包含其特定片段，或具有与这些特定片段至少50％同一性(例如，75、80、85、90或95％同一性)的序列。其他实施方式利用seqidno：25或与其具有至少50％序列同一性的序列作为结合基序。68.如果第二结合基序是上段中列出的任何序列，则第一结合基序可以包含以下或由以下组成：seqidno:26或seqidno:28或seqidno:1中列出的序列的残基31-291，或与seqidno:26或seqidno:28或seqidno:1的残基32-291具有至少50％同一性的序列，例如，具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性的序列。明确排除的是seqidno：1中列出的完整序列，但是，第一结合基序优选包含与seqidno：1的179位相对应的反应性赖氨酸。特别地，第一结合基序包含seqidno：1所示序列的残基31-292、31-293、31-294、31-295、31-296、31-297、31-298、31-299、31-300、31-301或31-302或与其具有至少70％同一性的序列，但seqidno：1的序列除外。69.在某些实施方式中，第一结合基序包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:8或与seqidno:8具有至少50％序列同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:8或与seqidno:8具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％序列同一性的序列。70.在另一个实施方式中，第一结合基序包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:9或与seqidno:9具有至少50％序列同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:9或与seqidno:9具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％序列同一性的序列。71.在甚至另一个实施方式中，第一结合基序包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:28或与seqidno:28具有至少50％序列同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:28或与seqidno:28具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％序列同一性的序列。72.spytag002(seqidno:34)与spycatcher002(seqid28),spycatcher(seqidno:8),仅84个氨基酸的spycatcher(spycatcher短,seqidno:9),和spycatcher003(seqidno:44)反应。因此，在一些实施方式中，在一个系统内，即来自酿脓链球菌(s.pyogenes)的cnab2结构域内，结合基序的变体可以互换。例如，第一结合基序可以是seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％同一性的序列，并且第二结合基序包括seqidno:28、8、9或44或与seqidno:28、8、9或44具有至少50％同一性的序列。或者，第一结合基序可以是seqidno:28、8、9或44或与seqidno:28、8、9、或44具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％序列同一性的序列。73.在另一个实施方式中，第一结合基序包含seqidno:43(spytag003)或与seqidno:43具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:44(spycatcher003)或与seqidno:44具有至少50％序列同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:44或与seqidno:44具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:43或与seqidno:43具有至少70％序列同一性的序列。74.此外，可使用n端的替代异肽键从主要菌毛蛋白spy0128设计结合基序。spy0128是主要菌毛蛋白spy0128，其具有如seqidno：1所示的氨基酸序列并且由如seqidno：2所示的核苷酸序列编码。abe等人(2013)在bioconjugatechem.，24(2)：242–250中描述了spy0128在蛋白质连接中的应用。abe等人的文献在此完整引入以供参考。因此，可从异肽蛋白的n端片段设计或获得结合基序，且剩余的、截断的或重叠的蛋白质片段可构成另一结合基序。在seqidno：1的36位发现了与结合于n端的异肽键有关的反应性赖氨酸，并且在seqidno：1的168位发现了与该异肽键有关的反应性天冬酰胺。75.因此，在优选实施方式中，结合基序之一包含反应性赖氨酸残基，而另一个结合基序包含反应性谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺。具体而言，在某些实施方式中，第一结合基序包含seqidno:1中所述序列的残基31-40或与其具有至少70％同一性的序列，且其长度小于50个氨基酸；而第二结合基序包含seqidno:1中所述序列的残基37-304或与其具有至少70％同一性的序列，但不包括seqidno:1的序列。或者在某些实施方式中，第二结合基序包含seqidno:1中所述序列的残基31-40或与其具有至少70％同一性的序列，且其长度小于50个氨基酸；而第一结合基序包含seqidno:1中所述序列的残基37-304或具有与其至少70％同一性的序列，但不包括seqidno:1的序列。优选结合基序中的反应性残基不突变。76.在其它实施方式中，第一结合基序包含seqidno：3所示序列的残基179-184(例如173-185)或与其具有至少50％同一性的序列，并且长度小于50个氨基酸。在这些实施方式中，第二结合基序包含seqidno:3的残基191-317，例如186-318，或与其具有至少50％同一性的序列，不包括seqidno:3。或者在还有其它实施方式中，第二结合基序包含seqidno：3所示序列的残基179-184(例如173-185)或与其具有至少50％同一性的序列并且长度小于50个氨基酸。在这些实施方式中，第一结合基序包含seqidno:3的残基191-317，例如186-318或与其具有至少50％同一性的序列，不包括seqidno:3。作为结合基序特别排除的是seqidno:3的全长序列。77.在更进一步的实施方式中，第一结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包括位于266位的天冬酰胺(或与其具有至少50％同一性的序列)，第二结合基序包含seqidno:5的片段或具有至少50％序列同一性的序列，其包含位置149处的赖氨酸残基，但不包括位置266处的天冬酰胺。或者在更进一步的实施方式中，第二结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包括位于266位的天冬酰胺(或与其具有至少50％同一性的序列)，第一结合基序包含seqidno:5的片段或与其具有至少50％序列同一性的序列，其包含位置149处的赖氨酸残基，但不包括位置266处的天冬酰胺。优选结合基序都不包括seqidno:5。78.在还有另一个实施方式中，第一结合基序包含在101位包含天冬氨酸残基的seqidno：6的片段(或与之至少70％相同的序列)，并且第二结合基序包含包含15位的反应性赖氨酸的seqidno：6的片段(或与之至少50％相同的序列)。或者，在另一个实施方式中，第二结合基序包含在101位包含天冬氨酸残基的seqidno：6的片段(或与之至少70％相同的序列)，并且第一结合基序包含包含15位的反应性赖氨酸的seqidno：6的片段(或与之至少50％相同的序列)。这些结合基序都不包括seqidno:6。79.另一个实施方式提供了包含seqidno：25或seqidno：27，或与seqidno：25或27具有至少50％同一性的序列的第一结合基序，其中所述结合基序的长度为15至40或50个氨基酸。在某些实施方式中，第一结合基序与seqidno:25或27具有至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85、约90或约95％的同一性，且长度小于50个氨基酸。优选地，第一结合基序包含seqidno：27中8位的反应性天冬氨酸，即，该残基优选是不变的。80.如果第一结合基序是上段中列出的任何序列，则第二结合基序包括如下或由如下组成seqidno:26或与其至少具有50％同一性的序列(例如，与seqidno:26具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的序列)，或seqidno:28或与其至少具有50％同一性的序列(例如与seqidno:28具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性)。变体具有至少50％的序列同一性并保留seqidno：26的57位的赖氨酸。81.另一个实施方式提供了包含seqidno：25或seqidno：27，或与seqidno：25或27具有至少50％同一性的序列的第二结合基序，其中所述结合基序的长度为15至40或50个氨基酸。在某些实施方式中，第二结合基序与seqidno:25或27具有至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85、约90或约95％的同一性，且长度小于50个氨基酸。优选地，第二结合基序包含seqidno：27中8位的反应性天冬氨酸，即，该残基优选是不变的。82.如果第二结合基序是上段中列出的任何序列，则第一结合基序包括以下或由以下组成seqidno:26或与其至少具有50％同一性的序列(例如，与seqidno:26具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的序列)，或seqidno:28或与其至少具有50％同一性的序列(例如与seqidno:28具有75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性)。变体具有至少50％的序列同一性并保留seqidno：26的57位的赖氨酸。83.在特定实施方式中，第一结合基序包含seqidno:39或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:40或与其具有至少50％同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:40或与其具有至少50％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:39或与其具有至少70％同一性的序列。84.spyligase/snoopligase85.或者，可以使用wo2016/193746和veggiani等人，2016(通过引用将其全部并入本文)中所述的系统将fc片段与抗原结合片段偶联。在这些实施方式中，结合基序(可任选地通过诸如富含甘氨酸/丝氨酸间隔子的接头序列)连接到fc片段和抗原结合片段上。然后用连接酶连接这些结合基序。在一些实施方式中，第一和第二结合基序中的每一个可具有6-50个氨基酸之间的长度，例如长度为7-45、8-40、9-35、10-30、11-25个氨基酸，例如，其可包含或由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸组成。在其他实施方式中，第一和第二结合基序中的每一个长度约为20-300个氨基酸(例如，长度约为10、20、30、40、50、60、70等个氨基酸)。在一些实施方式中，肽连接酶的长度可以在50-300个氨基酸之间(例如长度为60-250、70-225、80-200个氨基酸)，例如，它可以包含60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸或由60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸组成，条件是其满足以下针对连接酶提出的定义。86.在某些实施方式中，使用蛋白质连接的spyligase系统。在此类实施方式中，可如上所述产生抗原结合片段-spytag融合蛋白。fc片段未与spycatcher融合，而是在其n端与10个氨基酸的k-tag(athikfskrd，seqidno:33)融合，并且任选地与如上所述的一个或多个接头融合。纯化的抗原结合片段-spytag和纯化的k-tag-fc片段融合蛋白可在spyligase存在下混合以在两个分子之间形成共价键。因此，在某些这样的实施方式中，包含spytag的第一结合基序存在于抗原结合片段的c端，包含k-tag(seqidno:33)的第二结合基序存在于fc片段的n端。或者，包含k-tag(seqidno:33)的第一结合基序存在于抗原结合片段的c端，包含spytag的第二结合基序存在于fc片段的n端。87.这些实施方式的优点是与spycatcher相比，k-tag更短，从而产生类似于天然抗体的抗体。例如，如果使用天然“铰链-接头”，则在人工全长抗体的fab部分和fc部分之间仅存在23个“非天然”氨基酸。88.snooptagjr/dogtag/snoopligase89.此外，如buldun等人(2018)所述，可从肺炎链球菌(s.pneumoniae)的rrga蛋白设计结合基序。buldun等人的文献在此完整引入以供参考。因此在某些实施方式中，第一结合基序包含seqidno:37或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:38或与其具有至少70％同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:38或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:37或与其具有至少70％同一性的序列。可提供有助于在第一和第二结合基序之间形成键的snoopligase。90.在某些实施方式中，一对第一和第二结合基序可衍生自任何合适的异肽蛋白质。例如，各第一和第二结合基序可衍生自主要菌毛蛋白spy0128，其具有如seqidno：1所示的氨基酸序列并且由如seqidno：2所示的核苷酸序列编码。在蛋白质中形成两个异肽键。在seqidno：1的179位的赖氨酸和seqidno：1的303位的天冬酰胺(反应残基)之间形成有一个异肽键。诱导自发异肽键的谷氨酸残基位于seqidno:1中的258位处。因此，由seqidno：1所示的异肽蛋白质形成的一对结合基序将优选地包含：含有在303位包含反应性天冬酰胺的蛋白质的片段的第一结合基序、以及含有在179位包含反应性赖氨酸的蛋白质的片段的第二结合基序。或者，由seqidno：1所示的异肽蛋白质形成的一对结合基序将优选地包含含有在303位包含反应性天冬酰胺的蛋白质的片段的第二结合基序、以及含有在179位包含反应性赖氨酸的蛋白质的片段的第一结合基序。在此类实施方式中，可单独提供包含位置258处谷氨酸残基的蛋白质片段，即作为形成异肽键的肽连接酶。91.主要菌毛蛋白spy0128中的另一个异肽键出现在seqidno:1第36位的赖氨酸残基和seqidno:1第168位的天冬酰胺残基之间。诱导异肽键形成的谷氨酸残基位于seqidno:1中的117位处。因此，由seqidno：1所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包含含有在36位包含反应性赖氨酸的蛋白质的片段的第一结合基序、以及含有在168位包含反应性天冬酰胺的蛋白质的片段的第二结合基序。或者，由seqidno：1所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包含含有在36位包含反应性赖氨酸的蛋白质的片段的第二结合基序、以及含有在168位包含反应性天冬酰胺的蛋白质的片段的第一结合基序。在这样的实施方式中，在117位包含谷氨酸残基的蛋白质的片段可以作为肽连接酶单独提供。92.在seqidno：3的181位的赖氨酸残基(ace19，粪肠球菌(e.faecalis)的粘附素蛋白的结构域)和seqidno：3的294位的天冬酰胺残基之间存在异肽键。该键由seqidno:3中位置213处的天冬氨酸残基诱导。因此，由seqidno：3所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包含含有在294位包含反应性天冬酰胺残基的蛋白质的片段的第一结合基序、以及含有在181位包含反应性赖氨酸残基的蛋白质的片段的第二结合基序。或者，由seqidno：3所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包含含有在294位包含反应性天冬酰胺残基的蛋白质的片段的第二结合基序、以及含有在181位包含反应性赖氨酸残基的蛋白质的片段的第一结合基序。在这样的实施方式中，在213位包含天冬氨酸残基的蛋白质的片段可以作为肽连接酶单独提供。93.也可以使用具有seqidno：10所示氨基酸序列的金黄色葡萄球菌(s.aureus)的胶原结合域。异肽键出现在seqidno：10的176位的赖氨酸和seqidno：10的308位的天冬酰胺之间。诱导异肽键的天冬氨酸残基位于seqidno:10中的位置209处。因此，由seqidno：10所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包含含有在176位包含反应性赖氨酸的蛋白质的片段的第一结合基序、以及含有在308位包含反应性天冬酰胺的蛋白质的片段的第二结合基序。或者，由seqidno：10所示的异肽蛋白形成的一对结合基序将优选地包idno:37或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:38或与其具有至少70％同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:38或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:37或与其具有至少70％同一性的序列。可提供有助于在第一和第二结合基序之间形成键的snoopligase。100.sdytag/sdycatcher(dang短)101.在进一步的实施方式中，可从停乳链球菌(s.dysgalactiae)的纤连蛋白结合蛋白设计结合基序。tan等人(2016)描述了这样的蛋白质连接。tan等人的文献在此完整引入以供参考。因此在某些实施方式中，第一结合基序包含seqidno:41或与其具有至少70％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:42或与其具有至少50％同一性的序列。或者，第一结合基序包含seqidno:42或与其具有至少50％同一性的序列；而第二结合基序包含seqidno:41或与其具有至少70％同一性的序列。102.分选酶103.将fc片段偶联到抗原结合片段的另一种方法包括使用分选酶和分选酶识别和桥接域。schmohl等(2014年)讨论了分选酶介导的针对蛋白质的位点特异性修饰的连接，在此全文引入作为参考。在本发明的该方面中，分选酶识别和桥接域被认为是结合基序。分选酶是由革兰氏阳性细菌产生的转肽酶，以将细胞表面蛋白共价锚定在细胞壁上。金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)分选酶a(srta)切割短的c端识别基序(lpxtg(seqidno：17))(在本文中称为分选酶识别域)。分选酶识别域是分选酶a识别域或分选酶b识别域。在特定的实施方式中，分选酶识别域包含以下氨基酸序列或由其组成：lptgaa(seqidno：18)，lptggg(seqidno：19)，lpktgg(seqidno：20)，lpetg(seqidno：21)，lpxtg(seqidno：22)或lpxtg(x)n(seqidno：23)，其中x是任何氨基酸，n为0、1、2、3、4、5、7、8、9、10，在0-5或0-10的范围内，或不超过100的任何整数。104.分选酶a桥接域在其一端包括一个或多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，一个或多个甘氨酸残基可以任选为：gly，(gly)2，(gly)3，(gly)4，或(gly)x，其中x为1-20的整数。可任选地通过富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子将分选酶a识别域与抗原结合片段在c端融合，且可任选地通过富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子将分选酶a桥接域与fc片段在n端融合。105.因此，在某些实施方式中，在c端融合到抗原结合片段的第一结合域包含包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的分选酶a识别域：lptgaa(seqidno:18),lptggg(seqidno:19),lpktgg(seqidno:20),lpetg(seqidno:21),lpxtg(seqidno:22)或lpxtg(x)n(seqidno:23),其中x是任意氨基酸，n是0,1,2,3,4,5,7,8,9,10,在0-5或0-10的范围内，或是最大为100的任何整数，且与fc片段n端融合的第二结合域包括分选酶a桥接域，所述桥接域包含或由以下组成：gly,(gly)2,(gly)3,(gly)4,或(gly)x,其中x是1-20的整数。106.分选酶b识别域包含氨基酸序列npx1tx2(seqidno:24)，其中x1是谷氨酰胺或赖氨酸；x2是天冬酰胺或甘氨酸；n是天冬酰胺；p是脯氨酸，t是苏氨酸。分选酶b桥接域在其一端包括一个或多个甘氨酸残基。在某些实施方式中，一个或多个甘氨酸残基可以任选为：gly，(gly)2，(gly)3，(gly)4，或(gly)x，其中x为1-20的整数。可任选地通过富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子将分选酶b识别域与抗原结合片段在c端融合，且可任选地通过富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子将分选酶b桥接域与fc片段在n端融合。107.因此，在某些实施方式中，在c端融合到抗原结合片段的第一结合域包含分选酶识别域，其包含或由以下氨基酸序列组成：npx1tx2(seqidno:24)，其中x1是谷氨酰胺或赖氨酸；x2是天冬酰胺或甘氨酸；n是天冬酰胺；p是脯氨酸，t是苏氨酸，与fc片段在n端融合的第二结合域包含分选酶b桥接域，其包含或由以下组成：gly，(gly)2，(gly)3，(gly)4，或(gly)x，其中x为1-20的整数。108.蝶豆粘酶(butelase)109.将fc片段偶联到抗原结合片段的另一种方法包括使用蝶豆粘酶1在蝶豆粘酶识别基序(其中asx是asn或asp)和另一多肽的氨基末端之间形成肽键。在这种情况下，asx-his-val基序可以在框架中，可选地通过富含甘氨酸/丝氨酸的间隔子融合到抗原结合片段。然后，可使用蝶豆粘酶在asx-his-val基序和fc片段的n端氨基酸之间形成肽键。wo2017/058114公开了用于蝶豆粘酶介导的肽连接的方法和材料，其通过引用整体并入本文。110.因此，在某些实施方式中，在c端融合到抗原结合片段的第一结合域包含包括以下氨基酸序列的或由以下氨基酸序列组成的蝶豆粘酶识别域：asx-his-val(其中asx为asn或asp)，第二结合域包含fc片段的n端氨基酸。111.断裂内含蛋白(splitintein)112.将fc片段与抗原结合片段偶联的另一种方法包括使用断裂内含蛋白。内含蛋白可以作为由两个分别转录和翻译的基因编码的两个片段存在。这些所谓的断裂内含蛋白自缔合并催化蛋白质反式剪接活性。已在多种蓝细菌和古细菌中鉴定了断裂内含蛋白(caspi等，2003；choi等，2006；dassa等，2007；liu和yang，2003；wu等，1998；和zettler等，2009，其公开内容通过引用整体并入本文)。thiel等(2014)和wo2013/045632(其公开内容通过引用整体并入本文)还公开了可用于融合抗原结合片段和fc片段的断裂内含蛋白的应用。113.因此，在某些实施方式中，第一结合域包含第一断裂内含蛋白，第二结合域包含第二断裂内含蛋白，其中第一断裂内含蛋白和第二断裂内含蛋白结合形成具有催化能力的酶。然后它们催化自身的切除和侧翼序列的连接。114.上述或本领域已知的任何蛋白质连接系统可用于设计融合到抗原结合片段和fc片段的结合基序，以产生本发明的全长抗体。115.例如，在某些实施方式中，产生c端融合作为第一结合基序的spytag的融合蛋白形式的抗原结合片段，和产生n端融合作为第二结合基序的spycatcher的融合蛋白形式的fc片段。抗原结合片段-第一结合基序融合蛋白和fc片段-第二结合基序融合蛋白可相互混合以产生含有抗原结合片段的人工全长抗体，其中抗原结合片段c端spytag与fc片段融合蛋白的n端spycatcher偶联。116.抗原结合片段-spytag融合蛋白可通过使用将spytag添加到抗原结合片段的c端的载体(例如在大肠杆菌中)表达编码抗原结合片段的基因来创建。可在spytag之前或之后添加用于通过亲和层析纯化抗原结合片段的第二标签，例如his标签。在某些实施方式中，spytag具有ahivmvdaykptk(seqidno:29)或ahivmvdayk(seqidno:30)的序列。117.spycatcherfc融合蛋白可通过在哺乳动物表达宿主细胞(例如cho细胞系或hek293细胞系)中表达fc片段(例如人igg1fc片段)来单独产生。在用于表达fc的载体中，编码重链fc(ch2-ch3，带或不带天然抗体中连接ch1和ch2的铰链区)的基因片段的前面是spycatcher结构域，或者是116氨基酸结构域(seqidno:8)，参见li等人，2014，或者是缩短的84氨基酸(seqidno:9)版本(li等人，2014年)。spycatcher和ch2-ch3结构域之间的区域可能包含作为spycatcher和fc片段之间的间隔子的肽，以提供额外的柔性。例如，这种间隔肽可以是天然抗体铰链区(例如，人igg1：epkscdkthtcppcp(seqidno:31)或接头肽，例如包含一个或多个已知为柔性和可溶性的5个氨基酸ggggs(seqidno:32)序列基序的肽，或其组合。fc片段融合蛋白构建体前有一个信号序列，该信号序列使产生的fc片段融合蛋白能够运输到细胞外。可通过标准亲和层析，例如使用蛋白a纯化spycatcherfc融合蛋白。将抗原结合片段-spytag融合蛋白与spycatcher-fc融合蛋白以适当的化学计量比混合可用于产生人工全长抗体。例如，一个fab-spytag和spycatcher-fc融合物可以以每个spycatcher-fc分子2个fab-spytag分子的化学计量比混合，以产生全长人工抗体。其他化学计量也可用于提高产品产量，例如过量的fab-spytag。可添加后续纯化步骤以去除任何剩余反应物。118.可以提供适当的条件，如缓冲条件、ph值、温度和洗涤剂的存在，以实现通过spytag/spycatcher系统的最佳偶联。在一个实施方案中，在25℃和ph7.0、每个伴侣10μm的条件下，反应一半时间被确定为74秒(zakeri等人.，2012)。由此产生的人工全长抗体可原样使用或在使用前进一步纯化。这种纯化可以通过尺寸排阻层析或亲和层析，使用特异性结合到完整的fbab结构域，但不结合到spytag或spycatcher的固定化抗体进行。119.在特定实施方式中，在存在过量fab-spytag的情况下执行偶联以促使反应朝全长抗体形成方向进行。然后纯化所产生的全长抗体以去除多余的fab-spytag，例如，使用蛋白a结合基质或另一种结合相互作用，例如his标签或strep-tagtm。此类标签可引入fc，例如在fcc端。120.某些fab框架，例如，含有来自vh3种系类别的含fab的vh也与蛋白质a结合。因此，包含c端纯化标签(例如his标签或strep-tag)的fcspycatcher融合体可用于纯化，以避免与蛋白质a结合的fab片段污染。121.或者，可产生c端融合作为第一结合基序的spycatcher的融合蛋白形式的抗原结合片段，和可产生n端融合作为第二结合基序的spytag的融合蛋白形式的fc片段。抗原结合片段-第一结合基序融合蛋白和fc片段-第二结合基序融合蛋白可相互混合以产生含有抗原结合片段的人工全长抗体，其中抗原结合片段c端spycacther与fc片段融合蛋白的n端spytag偶联。spytag和spycatcher的序列以及衍生自铰链或上文讨论的其他柔性和可溶性序列基序的接头序列也可包括在这些实施方式中。122.在某些实施方式中，使用蛋白质连接的spyligase系统。在此类实施方式中，可如上所述产生抗原结合片段-spytag融合蛋白。fc片段未与spycatcher融合，而是在其n端与10个氨基酸的k-tag(athikfskrd，seqidno:33)融合，并且任选地与如上所述的一个或多个接头融合。纯化的抗原结合片段-spytag和纯化的k-tag-fc片段融合蛋白可在spyligase存在下混合以在两个分子之间形成共价键。因此，在某些这样的实施方式中，包含spytag的第一结合基序存在于抗原结合片段的c端，包含k-tag(seqidno:33)的第二结合基序存在于fc片段的n端。或者，包含k-tag(seqidno:33)的第一结合基序存在于抗原结合片段的c端，包含spytag的第二结合基序存在于fc片段的n端。123.这些实施方式的优点是与spycatcher相比，k-tag更短，从而产生类似于天然抗体的抗体。例如，如果使用天然“铰链-接头”，则在人工全长抗体的fab部分和fc部分之间仅存在23个“非天然”氨基酸。124.在进一步的实施方式中，使用snooptag/snoopcatcher系统(veggiani等人，2016)代替spytag/spycatcher系统。snooptag/snoopcatcher系统遵循与spytag/spycatcher系统相同的原理，除了将肺炎链球菌粘附素rrga的d4ig样结构域用作起点。125.此外，spytag和snooptag系统可以组合产生多特异性抗体。例如，可以产生两个或多个fc片段的聚合物，其中每个fc片段在其n端具有特定的第二结合基序，其中，两个或多个fc片段的聚合物中的一个或多个第二结合基序来自spytag系统，而两个或多个fc片段的聚合物中的一个或多个第二结合基序来自snooptag系统。这种由两个或多个fc片段组成的聚合物可与多个抗原结合片段接触，每个抗原结合片段对不同的抗原或表位具有特异性，并且每个具有特定的第一结合基序，其中，来自多个抗原结合片段的一个或多个抗原结合片段中的一个或多个第一结合基序来自spytag系统，来自多个抗原结合片段的一个或多个抗原结合片段中的一个或多个第一结合基序来自snooptag系统。126.可用本领域已知的技术产生两个或多个fc片段的聚合物。某些这样的技术描述于mekhaiel等人.(2011),scientificreports；1:124和czajkowsky等人(2012),embomol.med.；4(10):1015–1028。本领域已知用于生产具有两个或多个fc片段的聚合物的其它技术，并且此类实施方式在本发明的范围内。127.在更进一步的实施方案中，使用分选酶系统来产生全长人工抗体。在这些实施方式中，抗原结合片段在c端(例如，fab片段重链的c端)包含分选基序lpxtg(seqidno:17)。产生的fc部分在n端有gg序列，以允许通过添加分选酶进行共价偶联。分选酶介导的结合反应可以在含有ca2 的缓冲液中进行。在这些实施方式中，如果将“铰链-接头”用作间隔子，则fab和fc片段之间的“非天然”氨基酸的数量仅为6。或者，抗原结合片段在c端包含gg序列，并且分选基序lpxtg(seqidno：17)存在于fc片段的n端。分选酶催化共价偶联。128.在进一步的实施方案中，使用断裂内含蛋白系统(shah等人，2011年)或蝶豆粘酶介导的连接(nguyen等人，2016年)。在这些系统中，由断裂内含蛋白系统的两个组分形成的酶催化抗原结合片段融合蛋白和fc片段融合蛋白之间的共价键形成。因此，在本发明的各种实施方式中，产生了一系列fc片段-融合蛋白，其在n端均配备有允许位点特异性共价蛋白质偶联的结合基序，该偶联通过自催化(spytag和snooptag系统，断裂内含蛋白)或通过酶介导的催化(分选酶、spyligase、snoopligase、蝶豆粘酶)。例如，从文库技术中获得的抗原结合片段在c端具有相应的结合基序。这些片段有助于分析所需的特异性。任何此类抗体片段可与任何制备的fc片段-融合蛋白组合以产生全长抗体，该全长抗体包含对靶点的特异性和所需的fc部分，以允许在测定患者对给定抗原的抗体滴度的诊断分析中进行多重分析或用作对照或校准品。129.多重分析130.本文提供的多个全长抗体可用于在相同反应中鉴定多个抗原。因此，本发明的某些实施方式提供了一种确定样品中多种抗原水平的方法，包括将样品与本文提供的多个全长抗体接触，以及定量所述多个全长抗体中的每一个与其对应的抗原之间的结合，以确定所述样品中多个抗原中的每一个的水平。131.本领域已知可视化和定量抗体与其对应抗原之间结合的各种方法，并且此类实施方式在本发明的范围内。例如，多重免疫分析系统提供了独特的珠组合，其可用于定量多个全长抗体及其相应抗原之间的结合。或者，可以使用独特标记物的组合来定量多个全长抗体中的每一个与其对应抗原之间的结合。132.核酸构建体133.本发明的进一步实施方式提供核酸构建体，其编码与特定结合基序融合的抗原结合片段以及与相应结合基序融合的fc片段。这种核酸可以存在于适当的宿主细胞中的表达载体中。如下所述，宿主细胞可以是原核或真核的。134.因此，本发明的某些实施方式提供了多对核酸构建体，其中每对核酸构建体包括：135.a)第一核酸构建体，其包含编码在c端融合到第一结合基序的抗原结合片段的多核苷酸序列；和136.b)第二核酸构建体，其包含编码在n端融合到第二结合基序的fc片段的多核苷酸序列，137.其中每个抗原结合片段特异性结合到独特抗原，并且每个fc片段属于物种、同种型和亚类的独特组合，以及138.其中第一结合基序和第二结合基序在彼此接触时自发或借助酶形成共价键。139.通常，编码在c端与第一结合基序融合的fab的多核苷酸序列编码两条肽，即fab的l链和h链。第一结合基序，例如spytag，可以融合到l或h链上。优选第一结合基序融合到h链。fab表达盒可包含产生一个同时编码l和h链的mrna的双顺反子载体。此外，h和l链都有信号肽来引导其输出到周质。140.在某些实施方式中，本发明提供了多个核酸构建体，其中每个核酸构建体包括编码在c端与第一结合基序融合的抗原结合片段的多核苷酸序列，其中每个抗原结合片段特异性结合到独特抗原，其中，当第一结合基序与一第二结合基序彼此接触时，自发地或借助于酶形成共价键。141.本发明的进一步实施方式提供了多个核酸构建体，其中每个核酸构建体包含编码在n端融合到第二结合基序的fc片段的多核苷酸，其中每个fc片段属于物种、同种型和亚类的独特组合，其中，当第二结合基序与第一结合基序彼此接触时，自发地或借助于酶形成共价键。142.上文结合本发明全长抗体讨论的第一结合基序和第二结合基序的各种实施方式也适用于本发明的核酸构建体。143.核酸构建体通常存在于各种载体中。本发明所述载体通常包含表达融合蛋白所需的转录或翻译控制序列，所述融合蛋白包含抗原结合片段和fc片段。合适的转录或翻译控制序列包括但不限于复制起点、启动子、增强子、阻遏物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点和针对转录和翻译的终止位点。144.复制起点(通常称为ori序列)允许载体在合适的宿主细胞中复制。ori的选择取决于所使用的宿主细胞和/或基因包装的类型。当宿主细胞是原核生物时，表达载体通常包含ori序列，该ori序列指导载体在原核生物细胞内的自主复制。优选的原核ori能够指导细菌细胞中的载体复制。此类ori的非限制性示例包括pmb1、puc以及其他大肠杆菌起点。145.在真核系统中，高等真核生物包含多个dna复制起点，但ori序列并没有明确确定。哺乳动物载体的合适复制起点通常来自真核病毒。优选的真核ori包括但不限于sv40ori、ebvori或hsvori。真核载体和真核宿主细胞通常用于表达fc片段-结合基序融合蛋白。146.如本文所用，“启动子”是在特定条件下能够结合rna聚合酶并启动位于启动子下游(3′方向)的编码区转录的dna区域。其可以是组成型或可诱导的。通常，启动子序列在其3'端与转录起始位点结合，并向上游(5'方向)延伸，以包括在高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。启动子序列内具有转录起始位点，以及负责rna聚合酶结合的蛋白质结合结构域。真核启动子通常但并不总是包含“tata”盒和“cat”盒。147.启动子的选择在很大程度上取决于被引入载体的宿主细胞。对于原核细胞，本领域已知多种强大的启动子。优选的启动子是lac启动子、trc启动子、t7启动子和pbad启动子。通常，为了在多个物种中获得外源序列的表达，可以将原核启动子直接置于真核启动子之后，或置于真核启动子下游的内含子序列内。148.真核细胞的合适启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油酯突变酶，丙酮酸激酶，三糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。具有由生长条件控制的转录的额外优势的其他启动子是用于醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶和上述的3-磷酸甘油醛脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。哺乳动物细胞的优选启动子是sv40启动子、cmv启动子、β-肌动蛋白启动子及其杂合子。酵母细胞的优选启动子包括但不限于酿酒酵母(s.cerevisiae)中的gal10、gali、tefi，以及巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)中的gap、aox1。149.在构建本发明载体中，与蛋白质编码序列相关的终止序列也被插入需要转录的序列的3'端，以提供mrna和/或转录终止信号的多腺苷酸化。终止子序列优选包含一个或多个转录终止序列(例如聚腺苷酸化序列)，并且还可以通过包含额外的dna序列来延伸，以便进一步中断转录通读。本发明的优选终止子序列(或终止位点)具有后随有转录终止序列的基因，该终止序列是其自身终止序列或异源终止序列。此类终止序列的实例包括偶联到各种酵母转录终止序列或哺乳动物聚腺苷酸化序列的终止密码子，其是本领域中已知且可广泛获得的。在终止子包含基因的情况下，使用编码可检测或选择性标志物的基因可能是有利的；从而提供了一种手段，通过该手段可以检测和/或选择终止子序列的存在和/或不存在(以及由此转录单元的相应的失活和/或激活)。150.除了上述元件之外，载体可以包含选择性标志物(例如，编码用载体转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质的基因)，尽管这种标志物基因可以携带在共同引入该宿主细胞中的另一个多核苷酸序列上。只有那些导入了可选择基因的宿主细胞才能在选择性条件下存活和/或生长。典型的选择基因编码蛋白质，其将(a)对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、博来霉素、g418，甲氨蝶呤等赋予抗性；(b)弥补营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。合适的标记基因的选择将取决于宿主细胞，并且本领域已知用于不同宿主的合适基因。151.在一个实施方式中，表达载体是穿梭载体，能够在至少两种不相关的宿主系统中复制。为了促进这种复制，载体通常至少包含两个复制起点，每个宿主系统中一个有效。通常，穿梭载体能够在真核宿主系统和原核宿主系统中复制。这可以检测真核宿主中的蛋白质表达(表达细胞类型)和原核宿主中的载体扩增(扩增细胞类型)。优选地，一个复制起点来自sv40或2u，一个来自puc，尽管可以使用本领域已知的任何合适的起点，只要它指导载体的复制。当载体是穿梭载体时，该载体优选包含至少两种选择标志物，一种用于表达细胞类型，一种用于扩增细胞类型。可以使用本领域已知的任何选择标志物或本文所述的那些，只要其在所利用的表达系统中起作用即可。152.本发明的载体可使用重组克隆方法和/或通过化学合成获得。大量重组克隆技术，例如pcr、限制性内切酶消化和连接，在本领域是众所周知的，且在此不需要详细描述。本领域技术人员还可以使用本文提供的序列数据或公共或专有数据库中的序列数据，通过本领域可用的任何合成手段获得所需载体。另外，可以使用众所周知的限制性和连接技术从各种dna来源中切出合适的序列，并与根据本发明待表达的外源序列可操作地整合在一起。153.定义：154.在本说明书和权利要求中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。[0155]“全长抗体”指具有至少一个抗原结合片段和至少一个fc片段的抗体样分子。[0156]抗原结合片段指抗体的抗原结合部分，例如fab片段、可变片段(fv)、单链可变片段(scfv)、单链fab片段(scfab)或任何单域抗体(sdab)，例如骆驼vhh或鲨鱼可变新抗原受体(vnar)结构域。它还指其他并非从抗体免疫球蛋白折叠中衍生的蛋白质亲和试剂或结合支架，例如可变淋巴细胞受体(vlr)、粘合素、亲和体、darp素、抗运载蛋白、单体。[0157]fc片段被定义为抗体的尾部区域，其与fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用，可在免疫分析中通过相应的fc特异性二抗检测。fc片段在n端可包含也可不包含铰链序列。fc片段通常由两个或两个以上形成可溶性同二聚体或此类同二聚体的高阶结构的恒定结构域组成。[0158]术语“结合基序”涉及连接到fc片段和抗原结合片段的蛋白质序列，该蛋白质序列有助于形成偶联fc片段和抗原结合片段的共价键以产生全长抗体。结合基序的非限制性示例包括spytag序列，包括spytag002(seqidno:34)和spytag003(seqidno:43)，spycatcher序列，包括spycatcher002序列和spycatcher003序列，snooptag序列，snoopcatcher序列，分选酶基序，蝶豆粘酶底物和肽基连接酶底物。结合基序可与fc片段在n端融合或与抗原结合片段在c端融合。或者，结合基序可以融合到fc片段c端和融合到抗原结合片段n端，或者融合到fc片段c端和融合到抗原结合片段c端。间隔序列(例如，富含甘氨酸/丝氨酸的间隔序列)可位于结合基序侧翼，以增强反应的可接近性或增强融合到fc的抗原结合片段的柔性。[0159]术语“原核系统“指原核细胞，如细菌细胞或原核病毒、原核噬菌体或细菌孢子。“真核系统”是指真核细胞，包括动物、植物、真菌和原生生物的细胞，以及诸如逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等的真核病毒。原核和真核系统可统称为“表达系统”。[0160]术语“表达盒”在本文中指构建在载体中的功能单元，其用于表达重组抗原结合片段和fc片段。表达盒包括一个或多个启动子、转录终止子序列、一个或多个核糖体结合位点和编码融合蛋白的cdna。取决于表达系统，可以将其他遗传组件添加至表达盒(例如，用于真核表达系统的增强子和聚腺苷酸化信号)。[0161]如本文所用，术语“载体”指核酸分子，优选自我复制，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。通常，载体是包含复制起点、选择标记物和/或病毒包装信号以及其他调控元件的环状dna。在本发明的描述中，载体、载体dna、质粒dna、噬菌体dna是可互换的术语。该术语包括主要起到将dna或rna插入细胞的功能的载体，主要起到复制dna或rna的功能的复制载体，以及起到转录和/或翻译dna或rna的功能的表达载体。还包括提供超过一种上述功能的载体。[0162]如本文所用，术语“表达载体”是多核苷酸，当引入适当的宿主细胞时，其可转录并翻译成一种或多种多肽。术语“表达载体”是指指导与结合基序在框内融合的感兴趣的fc片段或抗原结合片段表达的载体。[0163]如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸”、和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区域、由连锁分析定义的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离dna、任意序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在核苷酸聚合物的组装之前或之后赋予。[0164]本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及d或l光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。[0165]如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。[0166]如本文所用，术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是所公开的表达构建体的接受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代。由于自然、意外或有意突变，子代可能不一定与原始亲本细胞完全相同。[0167][0168][0169][0170]额外公开内容和可要求的主题[0171]项目1.一种全长抗体，其包含：在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接彼此共价偶联，前提是如果抗原结合片段和fc片段来自同一物种，则使用可检测标记物标记fc片段。[0172]项目2.项目1的全长抗体，其中抗原结合片段从第一物种获得，fc片段从不同于第一物种的第二物种获得。[0173]项目3.多个全长抗体，其中每个全长抗体包含在c端包含第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含第二结合基序的fc片段，其中，第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接彼此共价偶联。[0174]项目4.项目3的多个全长抗体，其中每个抗原结合片段特异性结合到独特抗原，并且每个fc片段属于物种、同种型和亚类的独特组合。[0175]项目5.项目3或4的多个全长抗体，其中每个全长抗体与独特标记物偶联。[0176]项目6.项目3或4的多个全长抗体，其中每个全长抗体与独特珠偶联。[0177]项目7.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中第一结合基序和/或第二结合基序中的一个包含seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43，seqidno:1中所列序列的残基302-308，或与seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43具有至少50％同一性的序列；或其片段，且另一结合基序包含seqidno:8或9或26或28或33或36或38或40或42或44或seqidno:1中所述序列的残基31-291，或与seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44具有至少50％同一性的序列；或其片段，其中所述第一结合基序和所述第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0178]项目8.根据第7项所述的多个全长抗体，其中所述seqidno:1或3或5或6的片段包含约5-50个氨基酸。[0179]项目9.项目7或8所述的多个全长抗体，其中第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的残基302-308、301-308、300-308、299-308、298-308、297-308、296-308、295-308、294-308、293-308、292-308、291-308或290-308或与seqidno:1的残基302-308具有至少约50％至95％同一性的序列，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发或借助酶形成共价键。[0180]项目10.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中第一结合基序或第二结合基序包含seqidno:1位置303的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0181]项目11.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0182]项目12.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置149处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置266处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0183]项目13.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置15处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置101处的反应性天冬氨酸，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0184]项目14.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置303处的反应性天冬酰胺残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置179处的反应性赖氨酸，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0185]项目15.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0186]项目16.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置181处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置294处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0187]项目17.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置176处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置308处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0188]项目18.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置15处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置101处的反应性天冬氨酸，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0189]项目19.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置742处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置854处的反应性天冬酰胺，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0190]项目20.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置405处的反应性赖氨酸，另一个结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置496处的反应性天冬氨酸。[0191]项目21.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中，所述第一结合基序和/或所述第二结合基序包含异肽，该异肽包含seqidno:21或23或25或27的氨基酸序列，或与seqidno:21或23或25或27中任何一个所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质。[0192]项目22.项目3至6中任何一项的多个全长抗体，其中第一结合基序包括分选酶识别域，第二结合基序包括分选酶桥接域。[0193]项目23.如项目22所述的多个全长抗体，其中所述分选酶识别域包含氨基酸序列：lptgaa(seqidno:18),lptggg(seqidno:19),lpktgg(seqidno:20),lpetg(seqidno:21),lpxtg(seqidno:22)或lpxtg(x)n(seqidno:23),其中x是任意氨基酸，n是0,1,2,3,4,5,7,8,9,10,在0-5或0-10的范围内，或是最大为100的任何整数,npx1tx2(seqidno:24),其中x1是谷氨酰胺或赖氨酸；x2是天冬酰胺或甘氨酸；n是天冬酰胺；p是脯氨酸且t是苏氨酸，且分选酶桥接域包含:gly,(gly)2,(gly)3,(gly)4,或(gly)x,其中x是1-20的整数。[0194]项目24.项目3至6中任何一项的多个全长抗体，其中第一结合基序包含蝶豆粘酶识别域。[0195]项目25.如项目24所述的多个全长抗体，其中所述蝶豆粘酶识别域包含氨基酸序列：asn-his-val或asp-his-val。[0196]项目26.项目3至6中任一项的多个全长抗体，其中第一结合基序和第二结合基序各自包含断裂内含蛋白，其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0197]项目27.一种确定样品中多种抗原的水平的方法，包括将样品与权利要求3-26中任一所述的多个全长抗体接触，以及定量所述多个全长抗体中的每一个与其对应的抗原之间的结合，以确定所述样品中多种抗原的存在与水平。[0198]项目28.多对核酸构建体，其中每对核酸构建体包括：[0199]a)第一核酸构建体，其包含编码在c端融合第一结合基序的抗原结合片段的多核苷酸序列；和[0200]b)第二核酸构建体，其包含编码在n端融合第二结合基序的fc片段的多核苷酸序列，[0201]其中每个抗原结合片段特异性结合到独特抗原，并且每个fc片段属于物种、同种型和亚类的独特组合，以及[0202]其中第一结合基序和第二结合基序在彼此接触时，自发或借助酶形成共价键。[0203]项目29.项目28的核酸构建体对的组合，其中：[0204]a)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43，seqidno:1中所列序列的残基302-308，或与seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43具有至少50％同一性的序列；或其片段，且另一结合基序包含seqidno:8或9或26或28或33或36或38或40或42或44或seqidno:1中所述序列的残基31-291，或与seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44具有至少50％同一性的序列；或其片段，[0205]b)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的残基302-308、301-308、300-308、299-308、298-308、297-308、296-308、295-308、294-308、293-308、292-308、291-308或290-308，或与seqidno:1的残基302-308具有至少约50％至95％同一性的序列；[0206]c)第一结合基序或第二结合基序包含seqidno:1中位置303的反应性天冬酰胺；[0207]d)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺；[0208]e)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置149处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置266处的反应性天冬酰胺；[0209]f)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置15处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置101处的反应性天冬氨酸；[0210]g)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置303处的反应性天冬酰胺残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置179处的反应性赖氨酸；[0211]h)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:7位置36处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺；[0212]i)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置181处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置294处的反应性天冬酰胺；[0213]j)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置176处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置308处的反应性天冬酰胺；[0214]k)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置15处的反应性赖氨酸，另一个结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置101处的反应性天冬氨酸；[0215]l)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置742处的反应性赖氨酸残基，另一个结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置854处的反应性天冬酰胺；[0216]m)第一结合基序和第二结合基序中的一个包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置405处的反应性赖氨酸，另一个结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置496处的反应性天冬氨酸；[0217]n)所述第一结合基序和/或所述第二结合基序包含异肽，该异肽包含seqidno:21或23或25或27的氨基酸序列，或与seqidno:21或23或25或27中任何一个所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质。[0218]o)第一结合基序包括分选酶识别域，第二结合基序包括分选酶桥接域；[0219]p)第一结合基序包括蝶豆粘酶1识别域；或[0220]q)第一结合基序和第二结合基序各自包含断裂内含蛋白；[0221]和其中第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接相互作用，自发地或借助于酶形成共价键。[0222]项目30.多个原核或真核宿主细胞，其中所述多个原核或真核宿主细胞中的每一个包含来自根据权利要求28或29所述的核酸构建体的一个核酸构建体。[0223]项目31.多个fc片段，其中每个fc片段在n端包含独特第二结合基序，其中每个独特第二结合基序能够通过蛋白质连接自发或借助酶与独特第一结合基序共价结合，其中每个fc片段属于物种、同种型和/或亚类的独特组合。[0224]项目32.项目31的多个fc片段，其中每个fc片段与独特标记物偶联。[0225]项目33.项目31的多个fc片段，其中每个fc片段与独特珠偶联。[0226]项目34.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0227]i)独特第二结合基序包含seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43，seqidno:1中所列序列的残基302-308，或与seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43具有至少50％同一性的序列；或其片段，且能通过蛋白质连接自发或借助酶与独特第一结合基序共价偶联，所述第一结合基序包含seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44中所述序列的残基31-291，或与seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44具有至少50％同一性的序列；或其片段，或[0228]ii)独特第二结合基序包含seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44中所述序列的残基31-291，或与seqidno:1或8或9或26或28或33或36或38或40或42或44具有至少50％同一性的序列；或其片段，且能通过蛋白质连接自发或借助酶与独特第一结合基序共价偶联，所述第一结合基序包含seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43，seqidno:1中所列序列的残基302-308，或与seqidno:1或3或5或6或7或25或27或29或30或34或35或37或39或41或43具有至少50％同一性的序列；或其片段。[0229]项目35.根据第34项所述的多个fc片段，其中所述seqidno:1或3或5或6的片段包含约5-50个氨基酸。[0230]项目36.项目34或35所述的多个fc片段，其中独特第二结合基序包含seqidno:1的残基302-308、301-308、300-308、299-308、298-308、297-308、296-308、295-308、294-308、293-308、292-308、291-308或290-308或与seqidno:1的残基302-308具有至少约50％至95％同一性的序列，其中独特第二结合基序能通过蛋白质连接自发或借助酶与独特第一结合基序共价偶联。[0231]项目37.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中独特第二结合基序包含seqidno:1位置303的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发或借助酶与独特第一结合基序共价偶联。[0232]项目38.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0233]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸残基，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，或[0234]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸残基。[0235]项目39.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0236]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置149处的反应性赖氨酸残基，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置266处的反应性天冬酰胺，或[0237]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置266处的反应性天冬酰胺残基，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:5的片段，该片段包含seqidno:5位置149处的反应性赖氨酸残基。[0238]项目40.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0239]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置15处的反应性赖氨酸残基，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置101处的反应性天冬氨酸，或[0240]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置101处的反应性天冬氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:6的片段，该片段包含seqidno:6位置15处的反应性赖氨酸残基。[0241]项目41.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0242]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置303处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置179处的反应性赖氨酸，或[0243]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置179处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置303处的反应性天冬酰胺。[0244]项目42.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0245]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，或[0246]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置168处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:1的片段，该片段包含seqidno:1位置36处的反应性赖氨酸。[0247]项目43.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0248]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置181处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置294处的反应性天冬酰胺，或[0249]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置294处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:3的片段，该片段包含seqidno:3位置181处的反应性赖氨酸。[0250]项目44.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0251]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置176处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置308处的反应性天冬酰胺，或[0252]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置308处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:10的片段，该片段包含seqidno:10位置176处的反应性赖氨酸。[0253]项目45.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0254]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置15处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置101处的反应性天冬氨酸，或[0255]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置101处的反应性天冬氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:11的片段，该片段包含seqidno:11位置15处的反应性赖氨酸。[0256]项目46.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0257]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置742处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置854处的反应性天冬酰胺，或[0258]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置854处的反应性天冬酰胺，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:13的片段，该片段包含seqidno:13位置742处的反应性赖氨酸。[0259]项目47.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中：[0260]i)所述独特第二结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置405处的反应性赖氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，该独特第一结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置496处的反应性天冬氨酸，或[0261]ii)所述独特第二结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置496处的反应性天冬氨酸，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与独特第一结合基序共价偶联，所述独特第一结合基序包含seqidno:15的片段，该片段包含seqidno:15位置405处的反应性赖氨酸。[0262]项目48.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中，所述独特第二结合基序包含异肽，该异肽包含seqidno:21或23或25或27的氨基酸序列，或与seqidno:21或23或25或27中任何一个所述的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质。[0263]项目49.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中所述独特第二结合基序包含分选酶桥接域，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与包含分选酶识别域的独特第一结合基序共价偶联。[0264]项目50.如项目49所述的多个fc片段，其中所述分选酶识别域包含氨基酸序列：lptgaa(seqidno:18),lptggg(seqidno:19),lpktgg(seqidno:20),lpetg(seqidno:21),lpxtg(seqidno:22)或lpxtg(x)n(seqidno:23),其中x是任意氨基酸，n是0,1,2,3,4,5,7,8,9,10，在0-5或0-10的范围内，或是最大为100的任何整数，npx1tx2(seqidno:24),其中x1是谷氨酰胺或赖氨酸；x2是天冬酰胺或甘氨酸；n是天冬酰胺；p是脯氨酸且t是苏氨酸，且分选酶桥接域包含：gly,(gly)2,(gly)3,(gly)4,或(gly)x,其中x是1-20的整数。[0265]项目51.项目31至33中任一项的多个fc片段，其中所述独特第二结合基序包含第一断裂内含蛋白，并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶与包含第二断裂内含蛋白的独特第一结合基序共价偶联。[0266]项目52.一种制备多个全长抗体的方法，其中每个全长抗体包含在c端包含独特第一结合基序的抗原结合片段和在n端包含独特第二结合基序的fc片段，该方法包括将项目31至51中任何一项的多个fc片段与多个抗原结合片段接触，每个抗原结合片段在c端包含独特第一结合基序，接触在允许独特第二结合基序通过蛋白质连接自发或借助酶共价偶联到独特第一结合基序的条件下进行。[0267]项目53.一种试剂盒，其包括：[0268]a)抗原结合片段，在其c端包含第一结合基序，任选地包含第一可检测标记物；和[0269]b)在n端包含第二结合基序的fc片段，任选地包含第二可检测标记物；和/或[0270]c)包含第1项和/或第2项中定义的抗原结合片段和/或fc片段的核酸构建体，[0271]其中，所述第一结合基序和所述第二结合基序能够通过蛋白质连接相互共价偶联。[0272]项目54.项目53的试剂盒，其中第一和第二可检测标记物相互独立为荧光团、荧光蛋白或酶。[0273]项目55.一种产生全长抗体的方法，该方法包括在适当条件下混合：[0274]a)在其c端含有第一结合基序的抗原结合片段，以及[0275]b)在n端包含第二结合基序的fc片段，[0276]其中，所述混合后，第一结合基序和第二结合基序通过蛋白质连接彼此共价偶联。[0277]项目56.根据第55项所述的方法，其中所述抗原结合片段和/或所述fc片段包含可检测标记物。[0278]项目57.根据项目56所述的方法，其中所述可检测标记物是荧光团、荧光蛋白、生物素或酶。[0279]项目58.根据第7项所述的多个全长抗体，其中：[0280]a)第一结合基序包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％同一性的序列，并且第二结合基序包括seqidno:8、9、28、33或44或与seqidno:8、9、28、33或44具有至少50％同一性的序列；[0281]b)第一结合基序包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％同一性的序列，并且第二结合基序包括seqidno:8、9、28或44或与seqidno:8、9、28或44具有至少50％同一性的序列；[0282]c)第一结合基序包含seqidno:35或与seqidno:35具有至少50％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:36或与seqidno:36具有至少70％序列同一性的序列；[0283]d)第一结合基序包含seqidno:37或与seqidno:37具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:38或与seqidno:38具有至少70％序列同一性的序列；e)第一结合基序包含seqidno:39或与seqidno:39具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:40或与seqidno:40具有至少50％序列同一性的序列；[0284]f)第一结合基序包含seqidno:41或与seqidno:41具有至少70％序列同一性的序列，第二结合基序包含seqidno:42或与seqidno:42具有至少50％序列同一性的序列；或[0285]g)第一结合基序包含seqidno:43或与seqidno:43具有至少70％同一性的序列，并且第二结合基序包括seqidno:8、9、28或44或与seqidno:8、9、28或44具有至少50％同一性的序列。[0286]项目59.项目29的核酸构建体对的组合，其中：[0287]a)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:7或与seqidno:7具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:8、9、28、33或44或与seqidno:8、9、28、33或44具有至少50％同一性的序列；[0288]b)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:8、9、28、33或44或与seqidno:8、9、28、33或44具有至少50％同一性的序列；[0289]c)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:35或与seqidno:35具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:36或与seqidno:36具有至少70％同一性的序列；[0290]d)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:37或与seqidno:37具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:38或与seqidno:38具有至少70％同一性的序列；[0291]e)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:39或与seqidno:39具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:40或与seqidno:40具有至少50％同一性的序列；[0292]f)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:41或与seqidno:41具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:42或与seqidno:42具有至少50％同一性的序列；或[0293]g)第一结合基序和第二结合基序之一包含seqidno:43或与seqidno:43具有至少70％同一性的序列，而另一结合基序包含seqidno:8、9、28或44或与seqidno:8、9、28或44具有至少50％同一性的序列。[0294]项目60.项目34的多个fc片段，其中第二结合基序包含seqidno:44或与seqidno:44具有至少50％同一性的序列；并且能够通过蛋白质连接自发地或借助于酶共价偶联到第一结合基序，所述第一结合基序包含seqidno:34或与seqidno:34具有至少50％同一性的序列。实施例[0295]提供以下实施例仅为说明而非限定。本领域技术人员不难发现有多项非关键参数可变或可修饰并得出基本相同或相似的结果。[0296]实施例1–fccatcher构建、表达和纯化[0297]fccatcher由spycatcher002(seqidno:34)或spycatcher003(seqidno:44)和人类igg1(higg1)fc结构域构建，通过gssgs-接头和higg1铰链区的最后5个氨基酸epkss进行基因融合。铰链区最后的半胱氨酸被丝氨酸替换。得到的产物也称为hfccatcher2(使用spycatcher002)和hfccatcher3(使用spycatcher003)。在spycatcher-fc序列前克隆了编码分泌到培养基中的信号肽的序列。这些构建体被克隆到pmax载体中。将所得质粒转染到真核细胞系hkb11(cho等人，2002年)。在标准条件下培养3至4小时后，通过以1:1的比例添加bio-rad的标准饲养培养基来饲养转染的培养物。在转染后第6天，通过离心去除细胞碎片，随后进行无菌过滤，收集含有fccatcher的约200ml培养体积。使用fplc装置将澄清的培养上清液加至一步亲和层析。中和洗脱级分，收集，在ph7.4用1xpbs再缓冲，并进行无菌过滤。使用nanodrop2000装置通过uv280nm测量确定浓度，并根据构建体序列计算摩尔消光系数。[0298]类似地，通过将spycatcher(seqidno:8)或spycatcher003(seqidno:44)融合到相应的fc结构域，克隆了小鼠igg2a-fccatcher(mfccatcher)和小鼠igg2a-fccatcher3(基于spycatcher003，mfccatcher3)以及兔igg-fccatcher(rbfccatcher)和兔igg-fccatcher3。如上所述转染、表达和纯化这些构建体。[0299]然后用sds-page分析融合蛋白(图1泳道2和图3泳道2、4和6)。将4-20％聚丙烯酰胺凝胶(bio-radmini-proteantgx)和bio-radprecisionplus蛋白质标准分子量标志物和bio-radcriteriontm垂直电泳池一起使用。凝胶用染色，蛋白质纯度通过密度测定法测定。下文表2提供了fccatcher的浓度和纯度。[0300]表2[0301]融合蛋白产量mg/l％纯度higg1-fcspycatcher3130》90migg2a-fcspycatcher323》90rbigg-fcspycatcher351》90[0302]实施例2–fab-spytag构建、表达和纯化[0303]通过在ch1的c端和flag-标签之间使用短接头(序列ef)，然后接上接头(序列ggs)和spytag或spytag002以及接头(序列gap)和his标签，构建具有标签、spytag或spytag002和his标签的人fab片段。将轻链和重链克隆到带有lac启动子的双顺反子细菌表达载体中。轻链和重链基因都含有用于运输到周质中的分泌信号。将包含fab-flag-spytag-h或fab-flag-spytag2-h构建体的载体转化入蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株，如共同提交的美国申请62/819,748(周质融合蛋白；2019年3月18日提交；卷宗号brl.130p)中所述。在含有0.1％葡萄糖和氯霉素的250ml2xyt肉汤中培养大肠杆菌细胞，表达fab片段。在37℃生长1小时后，用0.8mmiptg诱导培养物。在30℃允许表达进行约16小时。离心培养物，在-80℃冷冻细胞。用bugbuster裂解缓冲液(millipore-sigma)裂解细胞。融合蛋白用ni-nta亲和基质纯化，缓冲液交换成pbs。[0304]实施例3-fab-spytag和fccatcher的连接[0305]来自实施例1的fccatcher融合蛋白和来自实施例2的fab-flag-spytag2-his融合蛋白通过在1xpbs中使10μmfab-flag-spytag2-his与4μm每种fccatcher3反应而相互连接。用超过fccatcher3位点(即每个fccatcher有2个位点)25％的摩尔量的spytag2实现所有spycatcher3位点的完全反应。在不同时间点(30秒至60分钟)后，通过添加sds上样缓冲液停止反应。在95℃下加热5分钟后，将样品加载到4-20％的聚丙烯酰胺凝胶(bio-radmini-proteantgx)上。考马斯染色凝胶图像(图1)显示，fccatcher3在fab重链处与spytag2发生反应。60分钟后，fccatcher3条带完全消失，表明连接反应完成。在反应开始时，可以看到两种产物：偶联到一个fab和偶联到两个fab的fccatcher3。单一偶联产物的条带随着反应时间的延长而减小，直到60分钟后在凝胶上几乎仅能看到双连接产物。[0306]实施例4–fab-spytag2-fccatcher3和igg的分析性能比较[0307]滴定elisa显示fab-fccatcher连接产物和igg具有相似的性能。以1μg/ml的gfp的pbs溶液涂覆maxisorpelisa板过夜。在用pbst洗涤并用5％bsa的pbst溶液封闭后，将连接到pbst中higg1-fcspycatcher3的抗gfpfab-spytag2滴定到板中。为了进行比较，在等摩尔浓度下滴定以全长人igg1形式产生的相同抗体(相同的fab序列)。使用hrp-偶联的抗人proteincross-linkingandimmobilization).bioconjugatechem.,24(2),242–250.[0319]alam等人,2017,用spytag/spycatcher蛋白质连接系统的合成性模式抗体构建(syntheticmodularantibodyconstructionusingthespytag/spycatcherproteinligasesystem).chembiochem.18(22),2217-2221.[0320]albrecht，h.，burke，p.a.，natarajan，a.，xiong，c.y.，kalicinsky，m.，denardo，g.l.，等人，2004年，按需生产含c端游离巯基的可溶性单链抗体用于位点特异性偶联或稳定的二聚scfv(productionofsolublescfvswithc-terminal-freethiolforsite-specificconjugationorstabledimericscfvsondemand.)。bioconjugchem。[0321]15(1):16-26.[0322]batonick,m.,kiss,m.m.,fuller,e.p.,magadan,c.m.,holland,e.g.,zhao,q.,wang,d.,kay,b.k.,weiner,m.p.,2016，pminerva：scfv体内重组为igg分子的供体-受体系统(pminerva:adonor-acceptorsystemfortheinvivorecombineeringofscfvintoiggmolecules).jimmunolmethods.431:22-30.[0323]buldun,c.m.,jean,j.,bedford,m.r.,howarth,m.,2018,snoopligase催化肽-肽锁定并实现固相偶联分离(snoopligasecatalyzespeptide-peptidelockingandenablessolid-phaseconjugateisolation).jamchemsoc.140(8),3008-3018.[0324]caspi,j.等人2003,蓝藻中断裂dnae内含蛋白的分布。(distributionofsplitdnaeinteinsincyanobacteria).molmicrobiol.50:1569-1577.[0325]chen,w.和georgiou,g.,2002,异源蛋白质的细胞表面展示：从高通量筛选到环境应用(cell-surfacedisplayofheterologousproteins:fromhigh-throughputscreeningtoenvironmentalapplications).biotechnolbioeng.79:496-503.[0326]cho,m.s.,yee,h.&chan,s.用于重组蛋白生产的人体细胞杂交细胞系的建立(establishmentofahumansomatichybridcelllineforrecombinantproteinproduction).jbiomedsci9,631-638(2002).[0327]choi,j.等人，2006,超嗜热古寄生菌马纳古菌断裂家族b型dna聚合酶的蛋白质反式剪接和表征(proteintrans-splicingandcharacterizationofasplitfamilyb-typednapolymerasefromthehyperthermophilicarchaealparasitenanoarchaeumequitans).jmolbiol.356:1093-1106.[0328]dassa,b.等人,2007,内源性和外源性组合中蓝藻断裂内含蛋白的反式蛋白质剪接。(transproteinsplicingofcyanobacterialsplitinteinsinendogenousandexogenouscombinations).biochemistry.46:322-330.[0329]fierer,j.o.,veggiani,g.,howarth,m.,2014,spyligase肽-肽连接聚合亲合体以增强磁性癌细胞捕获(spyligasepeptide-peptideligationpolymerizesaffibodiestoenhancemagneticcancercellcapture).procnatlacadsciusa.111:e1176-1181.[0330]gingrich,j.c.,davis,d.r.,nguyen,q.,2000,使用荧光探针在western印迹上对蛋白质进行多重检测和定量(multiplexdetectionandquantitationofproteinsonwesternblotsusingfluorescentprobes).biotechniques.29(3),636-642.[0331]keeble,a.h.,banerjee,a.,ferla,m.p.,reddington,s.c.,khairilanuar,i.n.a.,howarth,m.,2017,利用spytag/spycatcher进化加速酰胺化反应以分析膜动力学(evolvingacceleratedamidationbyspytag/spycatchertoanalyzemembranedynamics)ange,chem.国际版56:16521-16525[0332]keeble,a.h.,turkki,p.,stokes,s.,khairilanuar,i.n.a.,rahikainen,r.,v.p.,howarth,m.,2019,通过肽-蛋白质相互作用的工程改造实现无限亲和力(approachinginfiniteaffinitythroughengineeringofpeptide–proteininteraction).procnatlacadsciusa.116:26526-26533[0333]knappik,a.,capuano,f.,frisch,c.,ylera,f.,bonelli,f.,2009.抗心磷脂抗体检测标准化用重组人iga的开发(developmentofrecombinanthumanigaforanticardiolipinantibodiesassaystandardization.)annalsofthenewyorkacademyofsciences.1173,190-198[0334]li等人,2014,spycatcher与肽标签之间共价结合的结构分析与优化(structuralanalysisandoptimizationofthecovalentassociationbetweenspycatcherandapeptidetag),jmolbiol.426(2),309-17.[0335]liu,x.和yangj.,2003,红毛癣菌中编码多个新内含蛋白的断裂dnae基因(splitdnaegenesencodingmultiplenovelinteinsintrichodesmiumerythraeum).jbiolchem.278:26315-26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