1.本发明涉及一种肠易激综合征小鼠模型及其应用，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：：2.肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)是一种功能性胃肠疾病，其患病率在发达和发展中国家都非常高。欧美报道ibs患者数量为总人口数的10％-20％，我国ibs患者比例也高达5.2％-12.6％，且患者以中青年居多。ibs临床主要表现为腹痛，并伴有排便习惯的改变，但无明显的器质性异常。ibs的病因和发病机制比较复杂，其主要病理症状包括肠运动功能障碍，内脏过敏，低度炎症，肠粘膜屏障异常，肠道菌群失衡，内脏-脑轴功能障碍等。ibs患者人数在全球范围内居高不下，他们不但生活质量和工作效率低下，更给国家医疗系统造成较大负担，但目前尚没有可用的动物模型用于相关科学研究。技术实现要素：3.本发明旨在提供trim27基因在制备肠易激综合征动物模型中的应用，将其用于构建能自发肠易激综合征的小鼠模型，可用于肠易激综合征相关药物筛选等的研究。4.本发明的第一个目的是提供一种肠易激综合征动物模型的构建方法，是通过动物trim27基因特异性敲除，或抑制trim27蛋白表达的方式构建自发性肠易激综合征的动物模型。5.在一种实施方式中，所述方法包括：应用crispr/cas9技术构建trim27基因敲除的动物，将所述trim27特异性基因敲除的动物与同类动物进行交配，从而获得trim27基因敲除的自发性肠易激综合征的动物模型。6.在一种实施方式中，所述方法利用crispr/cas技术、cre-loxp技术、talen技术、zfn技术等进行动物trim27基因特异性敲除。7.在一种实施方式中，所述抑制trim27蛋白表达通过特异性蛋白抑制剂实现。8.在一种实施方式中，所述动物模型是啮齿类动物模型；所述啮齿类动物包括但不限于小鼠。9.在一种实施方式中，所述方法用于构建一种具有自发性肠易激综合征的小鼠。10.在一种实施方式中，所述小鼠不表达seqidno：1所示的全部trim27核苷酸序列。11.在一种实施方式中，所述小鼠的trim27蛋白沉默或受抑制；所述trim27蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。12.在一种实施方式中，所述trim27蛋白的一个或多个氨基酸经过沉默突变。13.在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：14.(1)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种sgrna载体或sgrna载体的体外转录产物；15.(2)将步骤(1)所述细胞在培养液中进行培养；16.(3)将步骤(2)培养后的细胞移植至受体雌性小鼠的输卵管内，使所述细胞在所述雌性小鼠的子宫中发育；17.(4)鉴定步骤(3)所述怀孕雌性的后代基因改造小鼠的种系传递。18.在一种实施方式中，所述方法的具体步骤包括：19.(1)提供靶向trim27基因的sgrna序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；20.(2)将sgrna核苷酸序列(sgrna)及互补链，通过退火聚合的方式连入pcs(puro)载体，获得sgrna载体；21.(3)将表达cas9和sgrna的真核表达质粒crispr/cas9和puca质粒共转染到细胞中后，cas9-sgrna复合物将结合并切割对应于puca质粒上sgrna的靶位点。触发ssa的dna修复机制，当萤光素酶(er)的同源互补序列形成萤光素酶的完整编码序列时，该基因将被表达；萤光素酶活性表示sgrna活性值；荧光素酶信号越高，表明sgrna活性越高。检测14条sgrna活性，选择活性较好的sgrna进行后续实验；22.(4)sgrna载体体外转录，得到进行显微注射的rna。23.(5)将cas9/sgrna显微注射到小鼠受精卵中，注射后f0小鼠出生。24.(6)由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0小鼠为嵌合体。故以f0小鼠鼠尾进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型通过f1小鼠鼠尾检测后确定。25.本发明的第二个目的是提供用于构建所述肠易激综合征小鼠的sgrna载体。26.在一种实施方式中，所述sgrna载体的构建方法为：通过合成的方法直接获得sgrna及互补链，混合后退火方式获得双链的sgrna，并将其连接到precut的pcs(puro)载体中，获得sgrna载体。27.本发明的第三个目的是提供肠易激综合征小鼠模型的应用，包括但不限于：28.(a)用于治疗肠易激综合征药物的筛选和研发；29.(b)用于与肠易激综合征有关的药物药效、副作用等研究；30.(c)用于商业化开发，例如可以商业化批量生产trim27特异性敲除小鼠作为肠易激综合征小鼠模型出售给相关研究机构和单位；31.(d)用于肠易激综合征有关的基础和临床研究。32.在一种实施方式中，所述应用是用于涉及肠易激综合征的产品开发，作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统。33.本发明的第四个目的是提供特异性靶向trim27基因的sgrna，所述sgrna的序列如seqidno.3～16所示。34.本发明的第五个目的是提供编码所述sgrna的dna分子。35.本发明的第六个目的是提供特异性靶向trim27基因的crispr/cas9系统，其含有能够特异的靶向trim27基因的sgrna的dna序列。36.本发明的第七个目的是提供能够特异性靶向trim27基因的核酸分子试剂盒，所述试剂盒包括所述的sgrna。37.有益效果：本发明建立的trim27敲除小鼠的多项生理指标均与临床ibs患者症状高度吻合，包括肠蠕动加快，肠道低度炎症，肠粘膜屏障异常，肠道菌群失调及5羟色胺水平升高等，提示该小鼠自发肠易激综合征。38.本发明通过对小鼠模型肠通透性、肠细胞因子表达、肠5羟色胺浓度、肠道菌群、结肠长度等指标分析后发现，这些指标的变化趋势与临床报道的肠易激综合征患者的上述指标趋势一致，提示该小鼠模型是一种有效的自发肠易激综合征模型，可以用于肠易激综合症相关药物筛选和研发、基础科学研究等。附图说明39.图1为sgrna活性检测结果；其中，con.为阴性对照；pc为阳性对照；40.图2为trim27基因片段敲除的f1代小鼠基因型鉴定结果；41.图3为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠组织炎性因子水平比较；(a)为小肠组织；(b)为结肠组织；42.图4为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )的肠蠕动速度比较；43.图5为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠组织内5羟色胺水平比较；(a)为小肠组织；(b)为结肠组织；44.图6为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠道菌群差异分析；(a)为菌群多样性分析；(b)为厚壁菌门/拟杆菌门比值；具体实施方式45.实施例1肠易激综合征小鼠模型的构建46.应用crispr-cas9方法获得trim27基因敲除小鼠，具体步骤如下：47.(1)对c57bl/6鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以保证sgrna识别序列与c57bl/6鼠尾dna序列完全一致；48.(2)基于sgrna的设计原则，应用线上设计软件(crisprsgrnadesigntool)在靶位点区域共设计14条sgrna，如表1所示。sgrna1-sgrna7识别靶基因的5’端靶位点，sgrna8-sgrna14识别靶基因的3’端靶位点，5’端靶位点位于trim27基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上；49.表1sgrna的序列设计50.5'端预测得分序列sgrna197caacatctgttgcgcgtgcctggsgrna289tggccgcagtcgagcatcataggsgrna387ggcccagccggcccgcgccatggsgrna487ggccatggcgcgggccggctgggsgrna586ggcacgcgcaacagatgttgtggsgrna686gagcctatgatgctcgactgcggsgrna784cgtgtgccttcagtacttcgtgg3'端预测得分序列sgrna882acgttcacttcctcacggagaggsgrna982gccctatgagtgggattgatgggsgrna1079acccatcaatcccactcatagggsgrna1178tcactgtaggggcacggaaatggsgrna1277ttgatcatctgccctatgagtggsgrna1375tccatggagacctctccgtgaggsgrna1474gtaggggcacggaaatggtaagg51.(3)合成sgrna核苷酸序列及互补链，通过退火聚合的方式连入pcs(puro)载体，连接产物转化后测序验证；获得表达cas9和sgrna的crispr/cas9载体质粒；52.(4)设计并构建针对靶序列的crispr/cas9载体质粒，并进行活性检测：采用ucatm方法，将crispr/cas9真核表达质粒和puca质粒共转染到细胞中后，cas9-sgrna复合物将结合并切割对应于puca质粒上sgrna的靶位点，触发ssa的dna修复机制，当萤光素酶(er)的同源互补序列形成萤光素酶的完整编码序列时，该基因将被表达。萤光素酶活性表示sgrna活性值；荧光素酶信号越高，表明sgrna活性越高)。如图1所示，通过检测sgrna活性最终选择2号(sgrna2)和11号(sgrna11)sgrna进行后续实验；53.2、小鼠受精卵注射sgrna/cas9，获得f0代阳性小鼠，该项实验过程主要包括如下内容：54.1)sgrna/cas9mrna的体外转录；应用sgrna体外转录试剂盒(632638，clontech)体外转录sgrna/casmrna，并进一步应用该试剂盒进行纯化回收，进行切割活性检测；55.2)收集小鼠受精卵；4周龄的雌鼠先注射30单位的pmsg(血清促性腺激素，sigma)，48小时后注射30单位的hcg(sigma)，随即将雌鼠与雄鼠交配。次日，获得小鼠受精卵；56.3)小鼠受精卵注射rna；将含有cas9mrna(60ng/μl)，sgrna(各60ng/μl)的混合液显微注射至小鼠受精卵胞质；57.4)受精卵移植代孕小鼠输卵管；将注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，最终获得敲除trim27的小鼠；58.5)trim27基因大片段敲除的f0代小鼠基因型鉴定。59.根据sgrna靶向的位点设计基因型鉴定引物如下：60.突变(ko)引物-正向：5’-gagcagctgtgcggggacgggtctg-3’；61.突变(ko)引物-反向：5’-tggaaagtgggtctccaaatccaaatc-3’；62.野生型(wt)引物-正向：5’-ctccggagccgagaagcggagcgag-3’；63.野生型(wt)引物-反向：5’-tcctgctcgcagtacagcttcagag-5’；64.对鼠尾dna进行鉴定，如果突变引物扩增出条带(～450bp)说明靶基因被编辑沉默。如果野生型引物扩增出条带(～430bp)说明基因未被编辑。65.6)trim27基因大片段敲除的f1代小鼠基因型鉴定。使用引物同步骤5)，如果野生型引物扩增出条带说明基因未被编辑，如果突变引物扩增出条带说明基因被编辑沉默。如图2所示，f1代如果为野生型小鼠，只有野生型(wt)引物可以扩增出目的条带，而f1代如果为trim27基因敲除杂合小鼠(f即f0代与野生型小鼠交配的后代)，则野生型(wt)和突变(ko)引物分别可以扩增出目的条带，继而说明成功获得trim27基因敲除小鼠。66.实施例2实时荧光定量(qrt)pcr检测小鼠模型的肠组织炎性细胞因子水平67.(a)小鼠肠组织总rna提取68.1、以实施例1构建的小鼠作为对象，每只小鼠分别取相同部位的小肠和结肠各100g，加入1mltrizol，用超声震荡仪充分匀浆1-2min，室温静置3-10min，使蛋白质变性。69.2、将步骤1处理后的样品在12000r/min下离心五分钟，弃沉淀，按每毫升trizol加入200微升的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置十分钟。70.3、将步骤2处理后的样品在4℃，12000g离心十五分钟，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升trizol加入0.6ml异丙醇，混匀放置室温5-10min。71.4、将步骤3处理后的样品在4℃，12000g离心十分钟，弃上清液，按每毫升trizol加入1ml冷的75％乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。72.5、将步骤4处理后的沉淀在室温晾干或真空干燥5-10min，加入适量depc水溶解，测260nm下吸光值定量rna浓度，将totalrna稀释至1ug/ul，备用。73.(b)cdna合成(翊圣生物试剂盒，hifairtmⅱꢀ1ststandcdnasynthesissupermixforqpcr，产品编号11123es50)74.1、残留基因组dna去除：在rnasefree离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。75.表2反应体系[0076][0077]2、逆转录反应体系配制(20μl)：在第一步的反应管中直接加入2xhifairtmⅱꢀsupermixplus，用量为：第1步的反应液10μl，2xhifairtmꢀⅱꢀsupermixplus10μl，用移液枪轻轻吹打混匀。[0078]3、逆转录程序设置：25℃5min；42℃30min；85℃5min。[0079](c)qpcr反应(翊圣生物试剂盒，qpcrsybrgreenmastermix(lowroxplus))[0080]反应体系(冰上配制)：[0081]表3qpcr反应体系[0082][0083]表4qpcr扩增程序(两步法)[0084][0085][0086](d)结果分析[0087]已有文献提示，腹泻型ibs和感染后肠易激综合征患者外周血单个核细胞分泌tnfα、il-1β水平较正常人显著升高。trim27敲除小鼠肠道同样会自发炎症(如图3)，其小肠组织中tnfαmrna水平升高7倍、il-1βmrna水平升高18倍，其他与肠道炎症反应相关的细胞因子，如il-12b和il-17mrna水平各升高1倍(图3a)。trim27敲除小鼠结肠组织中tnfα、il-1β、il-17mrna水平分别升高1.5倍、6倍、0.6倍、1倍(图3b)。以上结果表明，trim27敲除小鼠肠道组织有炎症发生。[0088]实施例3gitt(gastrointestinaltransittime)实验检测小鼠模型肠蠕动情况[0089]临床ibs患者的重要表现就是胃肠功能紊乱，尤其是腹泻型ibs患者肠蠕动加快导致腹泻症状。分别给18周龄实施例1构建的trim27敲除小鼠(trim27-/-)和野生型小鼠(trim27 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)口服0.3ml含有6％胭脂红的0.5％甲基纤维素，统计首次出现红色粪便颗粒所用时间(gastrointestinaltransittime，gitt)，该结果反映了小鼠胃肠功能情况。结果发现，trim27敲除小鼠gitt低于野生型小鼠，说明trim27敲除小鼠较野生型小鼠肠蠕动加快(图4)。该结果与临床ibs患者表型一致。[0090]实施例4小鼠肠组织5羟色胺(5-ht)酶联免疫分析(elisa)[0091](a)小鼠肠组织匀浆制备：[0092]每只小鼠分别取相同部位相同重量的小肠和结肠，超声震荡破碎，4℃高速离心5分钟，取上清即为肠组织匀浆。[0093](b)使用elisa试剂盒(vm92127，vivicum)检测步骤：[0094]1、标准品的稀释：5-ht标准品按下表在小试管中进行稀释。[0095]表5不同浓度标准品的制备[0096]终浓度标准品编号稀释操作240pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液120pg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液60pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液30pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液15pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液[0097]2、加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动均匀。[0098]3、温育：用封板膜封板后置于37℃温育30min。[0099]4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。[0100]5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。[0101]6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。[0102]7、温育：操作同3。[0103]8、洗涤：操作同5。[0104]9、显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。[0105]10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。[0106]11、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。[0107](c)实验结果分析[0108]ibs患者存在内脏超敏现象，超过三分之一的ibs患者表现出一定程度的过敏反应，疼痛阈值较低和/或感觉强度较高，一些研究表明，5-ht在内脏超敏反应中发挥重要作用。5-ht由肠道嗜铬细胞释放，并与多种5-ht受体亚型结合，直接刺激兴奋性(乙酰胆碱)或抑制性(一氧化氮)运动神经元，这些神经元调节平滑肌张力，所以5-ht在调节胃肠道功能中发挥多种作用。临床上，5-ht受体拮抗剂alosetron用于减少内脏疼痛治疗腹泻型肠易激综合症。而在出生8-21天醋酸给药的大鼠ibs模型中，平均每个视野中，结肠5-ht阳性的细胞数为76.6±4.7个，高于野生未处理大鼠的55.2±2.5个。[0109]如图5，trim27敲除小鼠(18周龄)小肠和结肠组织中5-ht的量均比同周龄野生型小鼠升高一倍，该现象与临床ibs患者5-ht升高的表型相符。[0110]实施例5小鼠肠道菌群16srrna基因测序和数据分析[0111](a)实验操作[0112]1、摘取小鼠结肠，收集结肠内容物并用无菌pbs冲洗、称重、均质化。[0113]2、立即用粪便基因组dna试剂盒分离结肠内容物中菌群dna。[0114]3、使用针对细菌16s基因设计的引物对粪便基因组样品进行pcr。得到的细菌序列碎片聚集成分类单位，并利用uclust方法对qiime数据库中微生物基因序列相似性97％的序列进行比对，进行细菌分类、微生物多样性或成分差异的稀疏分析。[0115](b)实验结果分析[0116]临床前和临床研究的证据表明，ibs的病理生理学中肠道微生物群的类型在个体中起着重要的作用。多项研究表明，被诊断为肠易激综合征的患者肠道细菌多样性减少，菌群平衡失调，厚壁菌门较拟杆菌门细菌比例增加。本实验发现，trim27-/-小鼠(18周龄)肠道菌群多样性降低(图6a)，厚壁菌门/拟杆菌门比值是trim27-/-小鼠的1.55倍(图6b)，该结果与已报到的ibs患者肠道菌群变化情况一致。[0117]实施例6trim27敲除小鼠在药物筛选方面的应用[0118]已有研究发现，肠道菌群在营养吸收、代谢、免疫调节、内脏感觉调节等方面起着重要作用。肠易激综合征患者使用益生菌治疗可降低肠易激综合征患者的内脏敏感性，并产生良好的菌群分布。益生菌vsl#3是8种革兰氏阳性菌(4种乳酸菌，3种双歧杆菌，1种嗜热链球菌)的混合物，目前被临床用于肠易激综合征治疗。vsl#3对患者的内脏敏感性和与粘膜健康相关的肠道菌群具有调节作用，对肠易激综合征的治疗有很好的疗效，可减少患者腹痛、腹胀等症状，改善患者的生活质量。[0119]用vsl#3饲喂实施例1构建的trim27敲除小鼠后发现，vsl#3其可以有效缓解trim27敲除小鼠的肠易激综合征症状的作用，表示本技术构建的小鼠模型可用于肠易激综合征药物筛选及药效验证。[0120]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12
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：：2.肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)是一种功能性胃肠疾病，其患病率在发达和发展中国家都非常高。欧美报道ibs患者数量为总人口数的10％-20％，我国ibs患者比例也高达5.2％-12.6％，且患者以中青年居多。ibs临床主要表现为腹痛，并伴有排便习惯的改变，但无明显的器质性异常。ibs的病因和发病机制比较复杂，其主要病理症状包括肠运动功能障碍，内脏过敏，低度炎症，肠粘膜屏障异常，肠道菌群失衡，内脏-脑轴功能障碍等。ibs患者人数在全球范围内居高不下，他们不但生活质量和工作效率低下，更给国家医疗系统造成较大负担，但目前尚没有可用的动物模型用于相关科学研究。技术实现要素：3.本发明旨在提供trim27基因在制备肠易激综合征动物模型中的应用，将其用于构建能自发肠易激综合征的小鼠模型，可用于肠易激综合征相关药物筛选等的研究。4.本发明的第一个目的是提供一种肠易激综合征动物模型的构建方法，是通过动物trim27基因特异性敲除，或抑制trim27蛋白表达的方式构建自发性肠易激综合征的动物模型。5.在一种实施方式中，所述方法包括：应用crispr/cas9技术构建trim27基因敲除的动物，将所述trim27特异性基因敲除的动物与同类动物进行交配，从而获得trim27基因敲除的自发性肠易激综合征的动物模型。6.在一种实施方式中，所述方法利用crispr/cas技术、cre-loxp技术、talen技术、zfn技术等进行动物trim27基因特异性敲除。7.在一种实施方式中，所述抑制trim27蛋白表达通过特异性蛋白抑制剂实现。8.在一种实施方式中，所述动物模型是啮齿类动物模型；所述啮齿类动物包括但不限于小鼠。9.在一种实施方式中，所述方法用于构建一种具有自发性肠易激综合征的小鼠。10.在一种实施方式中，所述小鼠不表达seqidno：1所示的全部trim27核苷酸序列。11.在一种实施方式中，所述小鼠的trim27蛋白沉默或受抑制；所述trim27蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。12.在一种实施方式中，所述trim27蛋白的一个或多个氨基酸经过沉默突变。13.在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：14.(1)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种sgrna载体或sgrna载体的体外转录产物；15.(2)将步骤(1)所述细胞在培养液中进行培养；16.(3)将步骤(2)培养后的细胞移植至受体雌性小鼠的输卵管内，使所述细胞在所述雌性小鼠的子宫中发育；17.(4)鉴定步骤(3)所述怀孕雌性的后代基因改造小鼠的种系传递。18.在一种实施方式中，所述方法的具体步骤包括：19.(1)提供靶向trim27基因的sgrna序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；20.(2)将sgrna核苷酸序列(sgrna)及互补链，通过退火聚合的方式连入pcs(puro)载体，获得sgrna载体；21.(3)将表达cas9和sgrna的真核表达质粒crispr/cas9和puca质粒共转染到细胞中后，cas9-sgrna复合物将结合并切割对应于puca质粒上sgrna的靶位点。触发ssa的dna修复机制，当萤光素酶(er)的同源互补序列形成萤光素酶的完整编码序列时，该基因将被表达；萤光素酶活性表示sgrna活性值；荧光素酶信号越高，表明sgrna活性越高。检测14条sgrna活性，选择活性较好的sgrna进行后续实验；22.(4)sgrna载体体外转录，得到进行显微注射的rna。23.(5)将cas9/sgrna显微注射到小鼠受精卵中，注射后f0小鼠出生。24.(6)由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0小鼠为嵌合体。故以f0小鼠鼠尾进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型通过f1小鼠鼠尾检测后确定。25.本发明的第二个目的是提供用于构建所述肠易激综合征小鼠的sgrna载体。26.在一种实施方式中，所述sgrna载体的构建方法为：通过合成的方法直接获得sgrna及互补链，混合后退火方式获得双链的sgrna，并将其连接到precut的pcs(puro)载体中，获得sgrna载体。27.本发明的第三个目的是提供肠易激综合征小鼠模型的应用，包括但不限于：28.(a)用于治疗肠易激综合征药物的筛选和研发；29.(b)用于与肠易激综合征有关的药物药效、副作用等研究；30.(c)用于商业化开发，例如可以商业化批量生产trim27特异性敲除小鼠作为肠易激综合征小鼠模型出售给相关研究机构和单位；31.(d)用于肠易激综合征有关的基础和临床研究。32.在一种实施方式中，所述应用是用于涉及肠易激综合征的产品开发，作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统。33.本发明的第四个目的是提供特异性靶向trim27基因的sgrna，所述sgrna的序列如seqidno.3～16所示。34.本发明的第五个目的是提供编码所述sgrna的dna分子。35.本发明的第六个目的是提供特异性靶向trim27基因的crispr/cas9系统，其含有能够特异的靶向trim27基因的sgrna的dna序列。36.本发明的第七个目的是提供能够特异性靶向trim27基因的核酸分子试剂盒，所述试剂盒包括所述的sgrna。37.有益效果：本发明建立的trim27敲除小鼠的多项生理指标均与临床ibs患者症状高度吻合，包括肠蠕动加快，肠道低度炎症，肠粘膜屏障异常，肠道菌群失调及5羟色胺水平升高等，提示该小鼠自发肠易激综合征。38.本发明通过对小鼠模型肠通透性、肠细胞因子表达、肠5羟色胺浓度、肠道菌群、结肠长度等指标分析后发现，这些指标的变化趋势与临床报道的肠易激综合征患者的上述指标趋势一致，提示该小鼠模型是一种有效的自发肠易激综合征模型，可以用于肠易激综合症相关药物筛选和研发、基础科学研究等。附图说明39.图1为sgrna活性检测结果；其中，con.为阴性对照；pc为阳性对照；40.图2为trim27基因片段敲除的f1代小鼠基因型鉴定结果；41.图3为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠组织炎性因子水平比较；(a)为小肠组织；(b)为结肠组织；42.图4为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )的肠蠕动速度比较；43.图5为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠组织内5羟色胺水平比较；(a)为小肠组织；(b)为结肠组织；44.图6为肠易激综合征小鼠模型(trim27-/-)与野生型小鼠(trim27 / )肠道菌群差异分析；(a)为菌群多样性分析；(b)为厚壁菌门/拟杆菌门比值；具体实施方式45.实施例1肠易激综合征小鼠模型的构建46.应用crispr-cas9方法获得trim27基因敲除小鼠，具体步骤如下：47.(1)对c57bl/6鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以保证sgrna识别序列与c57bl/6鼠尾dna序列完全一致；48.(2)基于sgrna的设计原则，应用线上设计软件(crisprsgrnadesigntool)在靶位点区域共设计14条sgrna，如表1所示。sgrna1-sgrna7识别靶基因的5’端靶位点，sgrna8-sgrna14识别靶基因的3’端靶位点，5’端靶位点位于trim27基因的第1外显子上游或1号外显子上，3’端靶位点位于第8外显子上；49.表1sgrna的序列设计50.5'端预测得分序列sgrna197caacatctgttgcgcgtgcctggsgrna289tggccgcagtcgagcatcataggsgrna387ggcccagccggcccgcgccatggsgrna487ggccatggcgcgggccggctgggsgrna586ggcacgcgcaacagatgttgtggsgrna686gagcctatgatgctcgactgcggsgrna784cgtgtgccttcagtacttcgtgg3'端预测得分序列sgrna882acgttcacttcctcacggagaggsgrna982gccctatgagtgggattgatgggsgrna1079acccatcaatcccactcatagggsgrna1178tcactgtaggggcacggaaatggsgrna1277ttgatcatctgccctatgagtggsgrna1375tccatggagacctctccgtgaggsgrna1474gtaggggcacggaaatggtaagg51.(3)合成sgrna核苷酸序列及互补链，通过退火聚合的方式连入pcs(puro)载体，连接产物转化后测序验证；获得表达cas9和sgrna的crispr/cas9载体质粒；52.(4)设计并构建针对靶序列的crispr/cas9载体质粒，并进行活性检测：采用ucatm方法，将crispr/cas9真核表达质粒和puca质粒共转染到细胞中后，cas9-sgrna复合物将结合并切割对应于puca质粒上sgrna的靶位点，触发ssa的dna修复机制，当萤光素酶(er)的同源互补序列形成萤光素酶的完整编码序列时，该基因将被表达。萤光素酶活性表示sgrna活性值；荧光素酶信号越高，表明sgrna活性越高)。如图1所示，通过检测sgrna活性最终选择2号(sgrna2)和11号(sgrna11)sgrna进行后续实验；53.2、小鼠受精卵注射sgrna/cas9，获得f0代阳性小鼠，该项实验过程主要包括如下内容：54.1)sgrna/cas9mrna的体外转录；应用sgrna体外转录试剂盒(632638，clontech)体外转录sgrna/casmrna，并进一步应用该试剂盒进行纯化回收，进行切割活性检测；55.2)收集小鼠受精卵；4周龄的雌鼠先注射30单位的pmsg(血清促性腺激素，sigma)，48小时后注射30单位的hcg(sigma)，随即将雌鼠与雄鼠交配。次日，获得小鼠受精卵；56.3)小鼠受精卵注射rna；将含有cas9mrna(60ng/μl)，sgrna(各60ng/μl)的混合液显微注射至小鼠受精卵胞质；57.4)受精卵移植代孕小鼠输卵管；将注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，最终获得敲除trim27的小鼠；58.5)trim27基因大片段敲除的f0代小鼠基因型鉴定。59.根据sgrna靶向的位点设计基因型鉴定引物如下：60.突变(ko)引物-正向：5’-gagcagctgtgcggggacgggtctg-3’；61.突变(ko)引物-反向：5’-tggaaagtgggtctccaaatccaaatc-3’；62.野生型(wt)引物-正向：5’-ctccggagccgagaagcggagcgag-3’；63.野生型(wt)引物-反向：5’-tcctgctcgcagtacagcttcagag-5’；64.对鼠尾dna进行鉴定，如果突变引物扩增出条带(～450bp)说明靶基因被编辑沉默。如果野生型引物扩增出条带(～430bp)说明基因未被编辑。65.6)trim27基因大片段敲除的f1代小鼠基因型鉴定。使用引物同步骤5)，如果野生型引物扩增出条带说明基因未被编辑，如果突变引物扩增出条带说明基因被编辑沉默。如图2所示，f1代如果为野生型小鼠，只有野生型(wt)引物可以扩增出目的条带，而f1代如果为trim27基因敲除杂合小鼠(f即f0代与野生型小鼠交配的后代)，则野生型(wt)和突变(ko)引物分别可以扩增出目的条带，继而说明成功获得trim27基因敲除小鼠。66.实施例2实时荧光定量(qrt)pcr检测小鼠模型的肠组织炎性细胞因子水平67.(a)小鼠肠组织总rna提取68.1、以实施例1构建的小鼠作为对象，每只小鼠分别取相同部位的小肠和结肠各100g，加入1mltrizol，用超声震荡仪充分匀浆1-2min，室温静置3-10min，使蛋白质变性。69.2、将步骤1处理后的样品在12000r/min下离心五分钟，弃沉淀，按每毫升trizol加入200微升的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置十分钟。70.3、将步骤2处理后的样品在4℃，12000g离心十五分钟，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升trizol加入0.6ml异丙醇，混匀放置室温5-10min。71.4、将步骤3处理后的样品在4℃，12000g离心十分钟，弃上清液，按每毫升trizol加入1ml冷的75％乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。72.5、将步骤4处理后的沉淀在室温晾干或真空干燥5-10min，加入适量depc水溶解，测260nm下吸光值定量rna浓度，将totalrna稀释至1ug/ul，备用。73.(b)cdna合成(翊圣生物试剂盒，hifairtmⅱꢀ1ststandcdnasynthesissupermixforqpcr，产品编号11123es50)74.1、残留基因组dna去除：在rnasefree离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。75.表2反应体系[0076][0077]2、逆转录反应体系配制(20μl)：在第一步的反应管中直接加入2xhifairtmⅱꢀsupermixplus，用量为：第1步的反应液10μl，2xhifairtmꢀⅱꢀsupermixplus10μl，用移液枪轻轻吹打混匀。[0078]3、逆转录程序设置：25℃5min；42℃30min；85℃5min。[0079](c)qpcr反应(翊圣生物试剂盒，qpcrsybrgreenmastermix(lowroxplus))[0080]反应体系(冰上配制)：[0081]表3qpcr反应体系[0082][0083]表4qpcr扩增程序(两步法)[0084][0085][0086](d)结果分析[0087]已有文献提示，腹泻型ibs和感染后肠易激综合征患者外周血单个核细胞分泌tnfα、il-1β水平较正常人显著升高。trim27敲除小鼠肠道同样会自发炎症(如图3)，其小肠组织中tnfαmrna水平升高7倍、il-1βmrna水平升高18倍，其他与肠道炎症反应相关的细胞因子，如il-12b和il-17mrna水平各升高1倍(图3a)。trim27敲除小鼠结肠组织中tnfα、il-1β、il-17mrna水平分别升高1.5倍、6倍、0.6倍、1倍(图3b)。以上结果表明，trim27敲除小鼠肠道组织有炎症发生。[0088]实施例3gitt(gastrointestinaltransittime)实验检测小鼠模型肠蠕动情况[0089]临床ibs患者的重要表现就是胃肠功能紊乱，尤其是腹泻型ibs患者肠蠕动加快导致腹泻症状。分别给18周龄实施例1构建的trim27敲除小鼠(trim27-/-)和野生型小鼠(trim27 / )口服0.3ml含有6％胭脂红的0.5％甲基纤维素，统计首次出现红色粪便颗粒所用时间(gastrointestinaltransittime，gitt)，该结果反映了小鼠胃肠功能情况。结果发现，trim27敲除小鼠gitt低于野生型小鼠，说明trim27敲除小鼠较野生型小鼠肠蠕动加快(图4)。该结果与临床ibs患者表型一致。[0090]实施例4小鼠肠组织5羟色胺(5-ht)酶联免疫分析(elisa)[0091](a)小鼠肠组织匀浆制备：[0092]每只小鼠分别取相同部位相同重量的小肠和结肠，超声震荡破碎，4℃高速离心5分钟，取上清即为肠组织匀浆。[0093](b)使用elisa试剂盒(vm92127，vivicum)检测步骤：[0094]1、标准品的稀释：5-ht标准品按下表在小试管中进行稀释。[0095]表5不同浓度标准品的制备[0096]终浓度标准品编号稀释操作240pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液120pg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液60pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液30pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液15pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液[0097]2、加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动均匀。[0098]3、温育：用封板膜封板后置于37℃温育30min。[0099]4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。[0100]5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。[0101]6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。[0102]7、温育：操作同3。[0103]8、洗涤：操作同5。[0104]9、显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。[0105]10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。[0106]11、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。[0107](c)实验结果分析[0108]ibs患者存在内脏超敏现象，超过三分之一的ibs患者表现出一定程度的过敏反应，疼痛阈值较低和/或感觉强度较高，一些研究表明，5-ht在内脏超敏反应中发挥重要作用。5-ht由肠道嗜铬细胞释放，并与多种5-ht受体亚型结合，直接刺激兴奋性(乙酰胆碱)或抑制性(一氧化氮)运动神经元，这些神经元调节平滑肌张力，所以5-ht在调节胃肠道功能中发挥多种作用。临床上，5-ht受体拮抗剂alosetron用于减少内脏疼痛治疗腹泻型肠易激综合症。而在出生8-21天醋酸给药的大鼠ibs模型中，平均每个视野中，结肠5-ht阳性的细胞数为76.6±4.7个，高于野生未处理大鼠的55.2±2.5个。[0109]如图5，trim27敲除小鼠(18周龄)小肠和结肠组织中5-ht的量均比同周龄野生型小鼠升高一倍，该现象与临床ibs患者5-ht升高的表型相符。[0110]实施例5小鼠肠道菌群16srrna基因测序和数据分析[0111](a)实验操作[0112]1、摘取小鼠结肠，收集结肠内容物并用无菌pbs冲洗、称重、均质化。[0113]2、立即用粪便基因组dna试剂盒分离结肠内容物中菌群dna。[0114]3、使用针对细菌16s基因设计的引物对粪便基因组样品进行pcr。得到的细菌序列碎片聚集成分类单位，并利用uclust方法对qiime数据库中微生物基因序列相似性97％的序列进行比对，进行细菌分类、微生物多样性或成分差异的稀疏分析。[0115](b)实验结果分析[0116]临床前和临床研究的证据表明，ibs的病理生理学中肠道微生物群的类型在个体中起着重要的作用。多项研究表明，被诊断为肠易激综合征的患者肠道细菌多样性减少，菌群平衡失调，厚壁菌门较拟杆菌门细菌比例增加。本实验发现，trim27-/-小鼠(18周龄)肠道菌群多样性降低(图6a)，厚壁菌门/拟杆菌门比值是trim27-/-小鼠的1.55倍(图6b)，该结果与已报到的ibs患者肠道菌群变化情况一致。[0117]实施例6trim27敲除小鼠在药物筛选方面的应用[0118]已有研究发现，肠道菌群在营养吸收、代谢、免疫调节、内脏感觉调节等方面起着重要作用。肠易激综合征患者使用益生菌治疗可降低肠易激综合征患者的内脏敏感性，并产生良好的菌群分布。益生菌vsl#3是8种革兰氏阳性菌(4种乳酸菌，3种双歧杆菌，1种嗜热链球菌)的混合物，目前被临床用于肠易激综合征治疗。vsl#3对患者的内脏敏感性和与粘膜健康相关的肠道菌群具有调节作用，对肠易激综合征的治疗有很好的疗效，可减少患者腹痛、腹胀等症状，改善患者的生活质量。[0119]用vsl#3饲喂实施例1构建的trim27敲除小鼠后发现，vsl#3其可以有效缓解trim27敲除小鼠的肠易激综合征症状的作用，表示本技术构建的小鼠模型可用于肠易激综合征药物筛选及药效验证。[0120]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12
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