MEK抑制剂及其在医药上的应用的制作方法

mek抑制剂及其在医药上的应用
技术领域
1.本发明涉及一种新型mek抑制剂的化合物及其制备方法、药物组合物。本发明还涉及上述化合物或其药物组合物在治疗mek介导的疾病中的用途。
技术背景
2.有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，mapk)是一组能被不同的细胞外刺激信号，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激或细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。在30％的肿瘤中，mapk/erk信号通路上调。mapk/erk信号通路广泛参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡、转移等过程，也称为ras-raf-mek-erk信号通路。mapk/erk信号通路具有一种保守的三级激酶模式，上游细胞信号转导或ras癌基因激活性突变首先导致ras的激活；ras是一种小gtp酶(small gtpase)，其引起raf磷酸化和激活；raf活化后进而磷酸化并激活mek(mitogen-activated and extracellular signal-regulated kinase)；活化的mek将erk磷酸化而将其活化。活化的erk1/2由细胞质转位到核内，进而介导elk-1、atf、nf-1、ap-1、c-fos和c-jun等多种转录因子和基因的活化与转录，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡和细胞癌变等多种生物学反应。具有ras或mek组成性激活的肿瘤包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、脑癌、卵巢癌、肺癌和皮肤癌等。
3.由于mek处于mapk/erk信号通路的中间位置，具有较为关键的调控作用。mek抑制剂已成为当前肿瘤药物研发热点之一，已有新药上市，如trametinib，商品名mekinist。本发明提供一种新型结构的mek抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性。


技术实现要素：

4.本发明涉及一种通式(i)所示的化合物，或其互变异构体、药用盐、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物：
[0005][0006]
其中，
[0007]
r1选自h、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基或c
1-6
卤代烷基，优选为甲基；
[0008]
r2选自c
6-10
芳基或6-10元杂芳环基，所述c
6-10
芳基或6-10元杂芳环基可任选地被1-3个选自c
1-6
烷基或卤素的取代基所取代，所述6-10元杂芳环基任意地含有1、2或3个分别独立地选自n、o或s的杂原子；
[0009]
r3选自
所述r5选自h、-c(o)n(rb)2、-s(o)2rb、-s(o)2n(rb)2、-c(o)nhc(nh)srb、-p(o)(rb)2、-c(o)nhrb、-c(o)rb、-c(nh)nhrb、氧代基、氨基或rb，rb选自c
1-6
烷基或c
3-6
环烷基；
[0010]
x选自c或n；
[0011]
r4选自不存在、氢、卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基或c
1-6
卤代烷基。
[0012]
一些实施例中，式(i)中的r2为苯基，所述苯基被选自c
1-6
烷基或卤素的取代基所取代。
[0013]
一些实施例中，式(i)中的r3选自选自所述r5选自h、氧代基、氨基、-s(o)2rb或rb，rb选自c
1-6
烷基。
[0014]
一些实施例中，式(i)中的r3选自
[0015][0016]
一些实施例中，式(i)中的x为c。
[0017]
一些实施例中，式(i)中的r4选自不存在或h，优选为h。
[0018]
一些实施例中，式(i)选自如下通式(ia)化合物，
[0019][0020]
r1至r5同式(i)所定义。
[0021]
一些实施例中，式(i)的化合物选自：
[0022][0023]
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效治疗剂量的本发明的至少任意一种结构式(i)所示化合物和至少一种药学上可接受的辅料。
[0024]
本发明进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物中结构式(i)所示化合物与所述辅料的重量比为0.0001-10。
[0025]
本发明提供了结构式(i)所示化合物或药物组合物在制备药物中的应用。
[0026]
本发明进一步提供了所述应用的优选技术方案：
[0027]
作为优选，所述应用为制备用于治疗和/或预防癌症药物中的应用。
[0028]
作为优选，所述应用为制备治疗由mek介导的疾病的药物中的应用。作为优选，所述疾病是癌症。
[0029]
作为优选，所述癌症选自乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、胃癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、多形性肺癌、卵巢癌、食管癌、黑色素瘤、结肠
直肠癌、肝细胞瘤、头颈部肿瘤、肝胆管细胞癌、骨髓增生异常综合征、恶性胶质瘤、前列腺癌、甲状腺癌、徐旺氏细胞瘤、肺鳞状细胞癌、苔藓样角化病、滑膜肉瘤、皮肤癌、胰腺癌、睾丸癌或脂肪肉瘤。
[0030]
作为优选，所述应用为用作mek抑制剂。
[0031]
作为优选，所述应用为用作mek1和/或mek2抑制剂。
[0032]
除非另有说明，所述结构通式中使用的一般化学术语具有通常的含义。
[0033]
例如，除非另有说明，本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0034]
在本发明中，除非另有说明，“烷基”包括直链或支链的一价饱和烃基。例如，烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-(2-甲基)丁基、2-戊基、2-甲基丁基、新戊基、正己基、2-己基、2-甲基戊基等。类似的，“类
1-8
烷基”中的“的
1-8”是指包含有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链或支链形式排列的基团。
[0035]“烷氧基”是指前述的直链或支链烷基的氧醚形式，即-o-烷基。
[0036]
在本发明中，“一”、“一个”、“该”、“至少一个”和“一个或多个”可互换使用。因此，例如，包含“一种”药学上可接受的赋形剂的组合物可以被解释为表示该组合物包括“一种或多种”药学上可接受的赋形剂。
[0037]
术语“芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的包括碳环的原子的单环或稠环芳香基团。优选芳基为6到10元的单环或双环的芳香环基团。优选为苯基、萘基。最优选为苯基。所述芳环基可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环。
[0038]
术语“杂环基”，在本文中，除非另有说明，是指由碳原子和1-3个选自n、o或s的杂原子组成的未取代或取代的3-10元稳定环系统，其为饱和或部分不饱和单环或多环，其中氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，并且氮杂原子可以选择性地被季铵化。该杂环基可以被连接到任何的杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。这些杂环基的实例包括但不限于氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氧代哌嗪基、氧代哌啶基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢咪唑基、四氢噻唑基、四氢恶唑基、四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜基和四氢恶二唑基。
[0039]
术语“杂芳基”，在本文中，除非另有说明，是指未取代或取代的稳定的5元或6元单环芳族环系统或未取代或取代的9元或10元苯并稠合杂芳族环系统或双环杂芳族环系统，其由碳原子和1-4个选自n、o或s的杂原子组成，并且其中所述氮或硫杂原子可以选择性地被氧化，所述氮杂原子可以选择性地被季铵化。杂芳基可以连接在任何杂原子或碳原子上以形成稳定的结构。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、咪唑基、异恶唑基、恶唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、吡啶基、哒嗪基、吲哚基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并异恶唑基、苯并噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基腺嘌呤、喹啉基或异喹啉基。所述杂芳基可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。
[0040]
术语“环烷基”是指具有3-10个碳原子的饱和或部分不饱和的单环或多环环状烷基链，例如，环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
[0041]
术语“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子分别被相同的或者不同的取代基所取代。典型的取代基包括但不限于卤素(f、cl、br或i)、c
1-8
烷基、c
3-12
环烷基、-or1、-sr1、
＝o、＝s、-c(o)r1、-c(s)r1、＝nr1、-c(o)or1、-c(s)or1、-nr1r2、-c(o)nr1r2、氰基、硝基、-s(o)2r1、-o-s(o2)or1、-o-s(o)2r1、-op(o)(or1)(or2)；其中r1和r2独立地选自-h、c
1-6
烷基、c
1-6
卤代烷基。在一些实施例中，取代基独立地选自包含-f、-cl、-br、-i、-oh、三氟甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、-sch3、-sc2h5、甲醛基、-c(och3)、氰基、硝基、-cf3、-ocf3、氨基、二甲基氨基、甲硫基、磺酰基和乙酰基的基团。
[0042]
取代烷基的实例包括但不限于2,3-二羟基丙基、2-氨基乙基、2-羟乙基、五氯乙基、三氟甲基、甲氧基甲基、五氟乙基、苯基甲基、二恶茂基甲基和哌嗪基甲基。
[0043]
取代烷氧基的实例包括但不限于2-羟基乙氧基、2-氟乙氧基、2,2-二氟乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-氨基乙氧基、2,3-二羟基丙氧基、环丙基甲氧基、氨基甲氧基、三氟甲氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-乙氧基羰基乙氧基、3-羟基丙氧基。
[0044]
术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的无毒的碱或酸制备的盐。
[0045]
由于式(i)所示化合物将作为药物应用，较优地，使用一定纯度，例如，至少为60％纯度，比较合适的纯度为至少75％，特别合适地纯度为至少98％(％是重量比)。
[0046]
本发明化合物的药物前体包含在本发明的保护范围内。通常，所述药物前体是指很容易在体内转化成所需化合物的功能性衍生物。例如，本发明化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐或其它衍生物，其在向受体施用后能够直接或间接地提供本技术的化合物或其具有药学活性的代谢物或残基。
[0047]
本发明所述化合物可能含有一个或多个不对称中心，并可能由此产生非对映异构体和光学异构体。本发明包括所有可能的非对映异构体及其外消旋混合物、其基本上纯的拆分对映异构体、所有可能的几何异构体及其药学上可接受的盐。
[0048]
当式(i)所示化合物及其药学上可接受的盐存在溶剂化物或多晶型时，本发明包括任何可能的溶剂化物和多晶型。形成溶剂化物的溶剂类型没有特别的限定，只要该溶剂是药学上可以接受的。例如，水、乙醇、丙醇、丙酮等类似的溶剂都可以采用。
[0049]
术语“组合物”，在本发明中，是指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接地由指定量的各指定成分的组合生产的任何产品。因此，含有本发明的化合物作为活性成分的药物组合物以及制备本发明化合物的方法也是本发明的一部分。此外，化合物的一些结晶形式可以多晶型存在，并且此多晶型包括在本发明中。另外，一些化合物可以与水(即水合物)或常见的有机溶剂形成溶剂化物，并且此类溶剂化物也落入本发明的范围内。
[0050]
本发明提供的药物组合物包括作为活性组分的式(i)所示化合物(或其药学上可接受的盐)、一种药学上可接受的赋形剂及其他可选的治疗组分或辅料。
[0051]
一般情况下，治疗上述所示的状况或不适，药物的剂量水平约为每天0.01mg/kg体重到150mg/kg体重，或者每个病人每天0.5mg到7g。
具体实施方式
[0052]
为使上述内容更清楚、明确，本发明将用以下实施例来进一步阐述本发明的技术方案。以下实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，以使本领域的技术人员能够理解本发明，但不用于限制本发明的保护范围。本发明的具体实施方式中，未作特别说明的技术手段或方法等为本领域的常规技术手段或方法等。
[0053]
除非另有说明，本发明所有的一部分和百分比均按重量计算，所有温度均指摄氏度。实施例中使用了下列缩略语：
[0054]
实施例中使用了下列缩略语：
[0055]
dcm：二氯甲烷；
[0056]
diea：二异丙基乙胺；
[0057]
dmf：n,n-二甲基甲酰胺；
[0058]
dmso：二甲亚砜；
[0059]
ea：乙酸乙酯；
[0060]
meoh：甲醇；
[0061]
pe：石油醚；
[0062]
pd/c：钯碳：
[0063]
thf：四氢呋喃；
[0064]
tfa：三氟乙酸；
[0065]
pre-tlc:制备薄层层析硅胶板；
[0066]
pre-hplc：制备高效液相色谱；
[0067]
实施例1：化合物4-((5-氨甲酰-6-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)氧基)-n，n-二甲基吲哚-1-甲酰胺的合成
[0068][0069]
步骤1：化合物1-1的合成
[0070]
在室温下，将1h-吲哚-4-醇(10g)溶解于acoh(30ml)中，冰浴冷却后，分批加入氰基硼氢化钠(11.80g)，温度控制低于15℃反应0.5h。加冰水淬灭反应，饱和碳酸钠水溶液调节ph至中性，ea(300ml*2)萃取两次，合并有机相，有机相饱和盐水洗，浓缩。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝99:1-30:1)分离纯化得到白绿色产物1-1(6.8g，产率66.99％)。esi-ms m/z:136.2[m h]

。
[0071]
步骤2：化合物1-2的合成
[0072]
在室温下，将化合物1-1(1.2g)溶于乙腈(15ml)中，加入碳酸氢钠(2.24g)，最后加n、n-二甲基氨甲酰氯(1.05g)，氮气保护，油浴70℃下搅拌2h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱(pe:ea＝5:1-1:2)分离纯化得到白色产物1-2(1.7g，产率92.84％)。esi-ms m/z:207.2[m h]

。
[0073]
步骤3：化合物1-3的合成
[0074]
在室温下，将化合物1-2(1.6g)和2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈
(712.16mg)溶于dma(10ml)中，加入cs2co3(3.79g)，氮气保护下，微波150℃下反应2.5h。向反应液中加入水，产物水溶性较好，未析出，选择ea萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝99:1-95:5)分离纯化得到棕色产物1-3(670mg，产率48.88％)。esi-ms m/z:354.4[m h]

。
[0075]
步骤4：化合物1-4的合成
[0076]
在室温下，将化合物1-3(670mg)溶于乙腈(20ml)中，加入亚硝酸异戊酯(666.33mg)和氯化亚铜(469.26mg)，70℃下搅拌1h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝99:1-96:4)分离纯化得到棕黑色油状产物1-4(410mg，产率58.00％)。esi-ms m/z:373.8[m h]

。
[0077]
步骤5：化合物1-5的合成
[0078]
在室温下，将化合物1-4(651.65mg)溶于thf(15ml)中，干冰乙醇浴-60℃下氮气保护，滴加双三甲基硅基胺基锂(368.04mg)，搅拌10min后，滴加用thf(15ml)溶解的4-[(2-氯-3-氰基-1-甲基-6-氧代-4-吡啶基)氧]-n，n-二甲基-吲哚-1-甲酰胺(410mg)，搅拌30min。向反应液中加入水，用ea萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝99:1-96:4)分离纯化得到灰白色产物1-5(450mg，产率71.37％)。esi-ms m/z:574.4[m h]

。
[0079]
步骤6：化合物1的合成
[0080]
在室温下，将化合物1-5(450mg)溶于乙醇(15ml)中，加入(二甲基膦酸)铂(ii)氢化络合物(20mg)和water(5ml)，油浴70℃下搅拌15h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝25:1)分离纯化得到白色产物1(327mg，产率70.45％)。esi-ms m/z:592.4[m h]

。
[0081]
实施例2：化合物2-((4-氯-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-(甲基磺酰基)吲哚-4-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0082][0083]
步骤1：化合物2-1的合成
[0084]
在室温下，将2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈(530mg)，1-甲基磺酰亚胺-4-醇(1.85g)，cs2co3(2.82g)依次加入dma(5ml)中，150℃微波，2h反应完成。向反应液中加水50ml,有棕色粘稠物产生，抽滤，所得粘稠物用3ml dcm打浆，抽滤，得到棕色固体状目标产物2-1(510mg,产率49.02％)。esi-ms m/z:361.4[m h]

。
[0085]
步骤2：化合物2-2的合成
[0086]
在室温下，将化合物2-1(2.5g)，氯化亚铜(2.40g)，亚硝酸异戊酯(2.03g,2.33ml)依次加入ch3cn(20ml)中，n2保护，65℃反应1h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱分离
纯化得到淡黄色固体状产物2-2(1.0g,37.95％产率)。esi-ms m/z:380.8[m h]

。
[0087]
步骤3：化合物2-3的合成
[0088]
在室温下，将4-氯-2-氟苯胺(153.30mg)加入三口瓶中，n2保护，插温度计，加入thf(5ml)，冷却至-50℃，随后滴加lihmds(0.92ml)，继续反应30min，然后向反应液中滴加化合物2-2(100mg)的thf溶液，反应30min。向反应液中加水淬灭，ea萃取三次，有机相水洗，饱和食盐水洗，浓缩。浓缩物通过硅胶柱分离纯化得到淡黄色固体状产物2-3(75mg,58.26％产率)。esi-ms m/z:489.9[m h]

。
[0089]
步骤4：化合物2的合成
[0090]
在室温下，将化合物2-3(75mg)，parkins试剂(32.67mg)加入乙醇(15ml)，water(5ml)中，80℃反应。待反应完毕，将反应液直接浓缩，浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝13:1)分离纯化得到淡黄色固体状产物2(52.5mg,66.93％产率,99.13％纯度)。esi-ms m/z:507.2[m h]

。
[0091]
实施例3：化合物2-((2-氟-4-甲基苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-(甲基磺酰基)吲哚-4-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0092][0093]
具体反应步骤参考实施例2，目标产物3的esi-ms m/z:487.1[m h]

。
[0094]
实施例4：化合物2-((4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-(甲基磺酰基)吲哚-4-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0095][0096]
具体反应步骤参考实施例2，目标产物4的esi-ms m/z:581.0[m h]

。
[0097]
实施例5：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((2-氧杂多林-4-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0098][0099]
具体反应步骤参考实施例2，目标产物5的esi-ms m/z:535.0[m h]

。
[0100]
实施例6：化合物2-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-甲基-2-氧杂多林-6-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0101][0102]
步骤1：化合物6-1的合成
[0103]
在室温下，将化合物6-甲氧基吲哚啉-2-酮(1.5g)加入100ml两口瓶中，加dmf(20ml)，n2保护，冰浴冷却，随后分批加入氢化钠(411.83mg,60％纯度)，加毕，搅拌20min，随后缓慢滴加碘甲烷(1.46g,641.23ul)，滴毕，于室温下反应。待反应完毕，将反应液冰浴冷却后，向反应液中加冰水淬灭，ea萃取，有机相水洗，饱和食盐水洗，浓缩。浓缩物通过硅胶柱分离纯化得到淡粉色固体状产物6-1(0.78g,47.88％产率)。esi-ms m/z:178.2[m h]

。
[0104]
步骤2：化合物6-2的合成
[0105]
在室温下，将化合物6-1(0.75g)加入两口瓶中，加入dcm(10ml)，冰浴冷却，n2保护，随后滴加bbr3(4.23g,1.57ml)，滴毕，冰浴下反应30min。冰浴下，向反应液中加冰水淬灭反应，饱和nahco3调ph值，分出有机相，水相用ea萃取，ea层水洗，饱和食盐水洗，浓缩得到浅棕色固体状产物6-2(0.46g,66.61％产率)。esi-ms m/z:164.2[m h]

。
[0106]
目标产物6的具体反应步骤参考实施例1。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.79(s,1h),7.66(d,j＝15.0hz,2h),7.59(dd,j＝10.7,2.4hz,1h),7.35(d,j＝7.9hz,1h),7.29(d,j＝8.7hz,1h),6.99(d,j＝2.3hz,1h),6.92-6.85(m,1h),6.80(t,j＝8.7hz,1h),5.18(s,1h),3.59(s,2h),3.15(s,3h),3.11(s,3h)。esi-ms m/z:501.1[m h]

。
[0107]
实施例7：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-甲基-2-氧杂多林-6-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0108][0109]
具体反应步骤参考实施例6，目标产物7的esi-ms m/z:549.0[m h]

。
[0110]
实施例8：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-((2-甲基-1-氧代异辛醇-4-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0111][0112]
步骤1：化合物8-1的合成
[0113]
在室温下，将化合物4-羟基异吲哚啉-1-酮(250mg)加入两口瓶中，加dmf(10ml)，保护，冰浴冷却下加入氢化钠(147.51mg,60％纯度)，冰浴下搅拌30min，随后滴加ch3i(523.65mg,229.67ul)，继续反应30min。向反应液中加冰水淬灭，ea萃取，有机相水洗，饱和食盐水洗，浓缩得到淡黄色固体状产物8-1(300mg,101.00％产率)。esi-ms m/z:178.2[m h]

。
[0114]
步骤2：化合物8-2的合成
[0115]
在室温下，将化合物8-1(313mg)加入两口瓶中，加入dcm(10ml)，n2保护，冰浴冷却下，滴加bbr3(1.77g,654.21ul)，滴毕，继续搅拌30min。向反应液中加冰水淬灭，ea萃取，有机相水洗，饱和食盐水洗，浓缩。浓缩物通过硅胶柱分离纯化得到白色固体状产物8-2(125mg,43.37％产率)。esi-ms m/z:164.2[m h]

。
[0116]
后续反应具体反应步骤参考实施例1。目标产物8的esi-ms m/z:549.0[m h]

。
[0117]
实施例9：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((1-氧代异辛醇-4-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0118][0119]
目标产物9的具体反应步骤参考实施例8。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.95(d,j＝2.2hz,1h),8.73(s,1h),7.72-7.55(m,5h),7.46(dd,j＝24.4,7.8hz,2h),6.69(t,j＝8.9hz,1h),5.21(s,1h),4.33(s,2h),3.16(s,3h)。esi-ms m/z:535.0[m h]

。
[0120]
实施例10：化合物2-((4-溴代-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((1-氧代异辛醇-4-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0121][0122]
具体反应步骤参考实施例8，目标产物10的esi-ms m/z:487.0[m h]

。
[0123]
实施例11：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((1-氧代异辛醇-5-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0124][0125]
具体反应步骤参考实施例8，目标产物11的esi-ms m/z:535.0[m h]

。
[0126]
实施例12：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((1-氧代-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0127][0128]
目标产物12的具体反应步骤参考实施例8。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.91(s,1h),8.06(s,1h),7.85(d,j＝6.8hz,1h),7.69-7.60(m,3h),7.48(t,j＝7.8hz,1h),7.45-7.42(m,2h),6.67(t,j＝8.7hz,1h),5.03(s,1h),3.35(td,j＝6.6,2.7hz,2h),3.15(s,3h),2.76(t,j＝6.6hz,2h)。esi-ms m/z:549.0[m h]

。
[0129]
实施例13：化合物2-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-((2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-5-基)氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0130][0131]
具体反应步骤参考实施例8，目标产物13的esi-ms m/z:501.1[m h]

。
[0132]
实施例14：化合物4-((1h-吲哚-4-基)氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0133][0134]
具体反应步骤参考实施例1，目标产物14的esi-ms m/z:519.0[m h]

。
[0135]
实施例15：化合物4-((1-(n，n-二甲基氨磺酰)吲哚-4-基)氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0136][0137]
步骤1：化合物15-1的合成
[0138]
在室温下，将化合物1-1(1.8g)溶于乙腈中，加入碳酸氢钠(3.36g)，最后将n、n-二甲基氨磺酰氯(2.10g)加入其中，氮气保护下，油浴70℃下搅拌12h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱(pe:ea＝8:1-1:1)分离纯化得到白色固体状产物15-1(2.6g,80.58％产率)。esi-ms m/z:243.3[m h]

。
[0139]
具体反应步骤参考实施例1，目标产物15的esi-ms m/z:628.0[m h]

。
[0140]
实施例16：化合物甲基(4-((5-氨甲酰-6-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)吲哚-1-羰基)氨基咪唑盐的合成
[0141][0142]
步骤1：化合物16-1的合成
[0143]
在室温下，将化合物1h-吲哚-4-醇(10g)溶于acoh(50ml)中，冰浴，分批加入氰基硼氢化钠(7.10g,2.68ml)，低温反应30min。向反应液中加水，用2n naoh,调节ph至7～8，析出固体，过滤，并用清水洗涤。浓缩，得到褐色固体状产物16-1(10g,98.51％产率)。esi-ms m/z:136.2[m h]

。
[0144]
步骤2：化合物16-2的合成
[0145]
在室温下，将化合物16-1(10g)溶于acoh(50ml)与ac2o(10ml)中，室温反应3h。向反应液中加水，用4n naoh，调节ph至12，搅拌30min，用2n hcl调节ph至7～8，析出固体，过滤，并用清水洗涤，烘干。得到褐色固体状产物16-2(11g,83.9％产率)。esi-ms m/z:178.2[m h]

。
[0146]
步骤3：化合物16-3的合成
[0147]
在室温下，将化合物2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈(3g)，化合物16-2(5.79g)，cs2co3(15.97g)溶于dma(50ml)中,150℃反应。向反应液中加水，析出固体，过滤，并用清水洗涤，烘干。得到灰色固体状产物16-3(3.7g,69.8％产率)。esi-ms m/z:325.3[m h]

。
[0148]
步骤4：化合物16-4的合成
[0149]
在室温下，将化合物16-3(3.7g)，氯化亚铜(5.65g)溶于acn(40ml)中，将亚硝酸异戊酯(5.35g,6.14ml)加入其中，50℃反应0.5h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱纯化得到灰色固体状产物16-4(2.2g,56.1％产率)。esi-ms m/z:324.7[m h]

。
[0150]
步骤5：化合物16-5的合成
[0151]
在室温下，将化合物2-氟-4-碘苯胺(4.55g)溶于thf(40ml)中，将温度降到-78℃，滴入khmds(1m,16.00ml)，反应30min，再滴入化合物16-4(2.2g)溶于thf中，-78℃～-30℃缓慢自然升温，反应30min。-30℃，用2n hcl淬灭，调节ph至5，旋去thf，加水，析出固体，固体用etoh打浆。得到粉红色固体状产物16-5(3.0g,86.1％产率)。esi-ms m/z:545.3[m h]

。
[0152]
步骤6：化合物16-6的合成
[0153]
在室温下，将化合物16-5(1g)溶于etoh(200ml)与h2o(40ml)的混合溶剂中，向其中加入parkins(20mg)试剂，80℃反应。将反应液浓缩，产物16-6以理论产率直接进入下一步。esi-ms m/z:563.3[m h]

。
[0154]
步骤7：化合物16-7的合成
[0155]
在室温下，将化合物16-6(1.03g)溶于etoh(200ml)与h2o(40ml)的混合溶剂中，将浓盐酸(50ml)加入其中，80℃反应4h。旋去etoh，冰浴下，用氨水调节ph至8，析出固体，过滤，用清水洗涤滤饼。得到粉红色固体状产物16-7(789mg,80.1％产率)。esi-ms m/z:521.3[m h]

。
[0156]
步骤8：化合物16的合成
[0157]
在室温下，将化合物16-7(100mg)，氨基甲酸叔丁酯(36.57mg)溶于吡啶(2ml)中，110℃反应过夜。将反应液降到室温，加水，析出固体，过滤，并用水洗滤饼。甲醇/dcm＝20:1打浆得到红色固体状产物16(76.3mg,59.5％产率)。esi-ms m/z:637.4[m h]

。
[0158]
实施例17：化合物4-((1-(二甲基磷酰基)吲哚-4-基)氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0159][0160]
在室温下，将化合物16-7(50mg)溶于dcm(2ml)中，将tea(29.17mg,40.21ul)加入其中，冰浴，滴入[氯(甲基)磷酰]甲烷(11.89mg,5.01ul)的dcm溶液，室温反应30min。将反应液直接浓缩，浓缩物通过pre-hplc纯化得到白色固体状产物17(30.7mg,53.0％产率，99.0％纯度)。esi-ms m/z:597.3[m h]

。
[0161]
实施例18：化合物4-((5-氨甲酰-6-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)氧基)-n-甲基吲哚-1-甲酰胺的合成
[0162][0163]
在室温下，将化合物16-7(50mg)，(4-硝基苯基)氯化碳(19.37mg,5.01ul)溶于thf(2ml)中，将tea(29.17mg,40.21ul)加入其中，室温反应5min，检测原料消耗完全，加入甲胺(14.92mg)，室温反应30min。将反应液直接浓缩，浓缩物通过pre-hplc纯化得到白色固体状产物18(26.9mg,98.5％产率)。esi-ms m/z:578.4[m h]

。
[0164]
实施例19：化合物6-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-(甲基磺酰基)吲哚-4-基)氧基)-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-5-甲酰胺的合成
[0165][0166]
步骤1：化合物19-1的合成
[0167]
在室温下，将化合物6-氨基-1-甲基嘧啶-2,4-二酮(10g)溶于dmf(40ml)中，室温下缓慢滴加三氯氧磷(32.59g,19.75ml)，滴毕，室温反应4h。将反应液淬灭于400ml冰水中，40％naoh调节ph至中性，静置，黄色固体析出，抽滤滤饼水洗，干燥。得到淡黄色固体状产物19-1(7.7g,64.3％产率)。esi-ms m/z:170.1[m h]

。
[0168]
步骤2：化合物19-2的合成
[0169]
在室温下，将化合物19-1(1.5g)溶于无水乙醇(10ml)中，加入吡啶(1.26g,1.29ml)，微波120℃反应0.5h。将反应冷却后抽滤，滤饼乙醇润洗，烘干，得到黄色固体状产物19-2(1.2g,73.5％产率)。esi-ms m/z:185.2[m h]

。
[0170]
步骤3：化合物19-3的合成
[0171]
在室温下，将化合物19-2(2.5g)溶于ac2o(25ml)，120℃反应1.5h。将反应混合物抽滤，滤饼乙醇润洗，油泵拉干。得到黄色固体状产物19-3(2.5g,90％纯度)。esi-ms m/z:167.1[m h]

。
[0172]
步骤4：化合物19-4的合成
[0173]
在室温下，将化合物19-3(2.5g)溶于mecn(70ml)，加入三氯氧磷(11.54g,6.99ml)，80℃反应过夜。将反应混合物直接浓缩，得到黄褐色固体状产物19-4。esi-ms m/z:185.6[m h]

。
[0174]
步骤5：化合物19-5的合成
[0175]
在室温下，将化合物19-4与1-甲基磺酰亚胺-4-醇(1.80g)溶于mecn(60ml)中，加入cs2co3(4.58g)，缓慢升至80℃，反应6h。反应冷却后抽滤，滤饼乙腈洗，后旋干拌样，通过硅胶柱(dcm:mecn＝94:6)纯化得到白色固体状产物19-5(220mg)。esi-ms m/z:362.4[m h]

。
[0176]
步骤6：化合物19-6的合成
[0177]
在室温下，将化合物19-5(180mg)溶于乙醇(6ml)和water(2ml)的混合溶剂中，加入parkins试剂(9mg)，80℃反应6h。抽滤，滤饼乙醇润洗，得到白色固体状产物19-6(130mg)。esi-ms m/z:380.4[m h]

。
[0178]
步骤7：化合物19-7的合成
[0179]
在室温下，将化合物19-6(100mg)和1,2-二氟-4-硝基苯(50.32mg,34.94ul)溶于dma(2ml)，加入cs2co3(171.76mg)，氮气保护，升至90℃加热反应1h。将反应液淬灭于20ml冰水中，3n hcl调节ph至中性，抽滤，滤饼水洗。将滤饼通过pre-tlc(dcm:meoh＝20:1)纯化得到黄色固体状产物19-7(21mg)。esi-ms m/z:519.5[m h]

。
[0180]
步骤8：化合物19-8的合成
[0181]
在室温下，将化合物19-7(21mg)和sncl2·
2h2o(36.56mg)溶于乙醇(1ml)，80℃反应6h。将反应物直接浓缩，浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化得到黄色固体状产物19-8(15mg)。esi-ms m/z:489.5[m h]

。
[0182]
步骤9：化合物19的合成
[0183]
在室温下，将化合物19-8(15mg)溶于浓hcl(1ml)中，降至0℃，加入亚硝酸钠(2.33mg)，保温搅拌15min后，滴加ki(15.29mg)的0.5ml水溶液，滴毕，升至室温搅拌6h。抽滤，滤饼水洗，滤饼溶于20mlea中，10ml饱和硫代硫酸钠洗，饱和碳酸氢钠洗，最后饱和盐水洗，有机相无水硫酸钠干燥。浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝25:1)纯化得到白色固体状产物19(7mg，99.82％纯度)。esi-ms m/z:600.1[m h]

。
[0184]
实施例20：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-((4-(甲基磺酰基)-3,4-二氢-2h-苯并[b][1,4]恶嗪-8-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0185][0186]
步骤1：化合物20-1的合成
[0187]
将化合物2-氯-n-(2,3-二甲氧基苯基)乙酰胺(3g)加入dcm(35ml)，在-78℃滴加bbr3(9.82g,3.78ml)，升至0℃搅拌1h。反应液倒入冰水淬灭，再用饱和k2co3调至ph＝8，用dcm反萃。水层再用2m hcl调节至ph＝3-4，再用ea*2萃取，有机层用无水硫酸钠干燥。得到
深褐色固体状产物20-1(2.3g,87.33％产率)。esi-ms m/z:202.6[m h]

。
[0188]
步骤2：化合物20-2的合成
[0189]
在室温下，将化合物20-1(2.3g)加入mecn(60ml)与h2o(5ml)的混合溶剂中，再加入k2co3(3.15g)，30℃搅拌4h。用少量水稀释，再用ea萃取，水层用3n hcl调节至ph＝4.再用ea*2萃取，合并有机相，减压浓缩。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝40:1-20:1)纯化得到淡黄色固体状产物20-2(1.8g,95.54％产率)。esi-ms m/z:166.2[m h]

。
[0190]
步骤3：化合物20-3的合成
[0191]
在室温下，将化合物20-2(1.8g)加入thf(20ml)，在0℃下滴加bh
3-thf(1m,87.20ml)，升至室温搅拌过夜。冰浴下缓慢滴加甲醇，直至没有气泡冒出，补加甲醇，搅拌室温搅拌20min。减压浓缩。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝40:1-20:1)纯化得到类白色固体状产物20-3(1.35g,8.93mmol,81.94％产率)。esi-ms m/z:152.2[m h]

。
[0192]
步骤4：化合物20-4的合成
[0193]
在室温下，将化合物20-3(400mg)加入dma(6ml)，再加cs2co3(1.62g)，n2保护下150℃搅拌过夜。冷却，加水稀释，再用2n hcl调节至ph＝5，固体析出，过滤，滤饼用水冲洗，干燥，得到深褐色固体状产物20-4(350mg,粗品)。esi-ms m/z:438.4[m h]

。步骤5：化合物20-5的合成
[0194]
在室温下，将化合物20-4(350mg)，加入吡啶(3.5ml)，0℃下再加甲磺酰氯(183.33mg,123.87ul)，55℃搅拌3h。加水稀释，在用2n hcl调节至ph＝5，加入ea*2萃取，有机层用饱和食盐水洗涤再用无水硫酸钠干燥。浓缩物通过硅胶柱(dcm:meoh＝40:1-20:1)纯化得到褐色固体状产物20-5(280mg)。esi-ms m/z:152.2[m h]

。
[0195]
后续反应具体反应步骤参考实施例19，目标产物20的esi-ms m/z:615.0[m h]

。
[0196]
实施例21：化合物4-((1-乙酰吲哚-4-基)氧基)-2-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0197][0198]
化合物21-1的具体合成步骤参考化合物16。
[0199]
步骤1：化合物21-2的合成
[0200]
在室温下，将化合物21-1(280mg)溶于乙醇(6ml)中，加入parkins试剂(14mg)，80℃反应2h。直接将反应混合物浓缩，得到目标产物21-2的粗品。esi-ms m/z:440.4[m h]

。
[0201]
步骤2：化合物21-3的合成
[0202]
在室温下，将化合物21-2(291.97mg)溶于ac2o(3ml)，室温搅拌30min。将反应液淬灭于水中，naoh溶液中和乙酸酐，100ml*3ea萃取，合并有机相，水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥。直接将反应混合物浓缩，得到目标产物21-3的粗品(300mg)。esi-ms m/z:482.4[m h]

。
[0203]
步骤3：化合物21-4的合成
[0204]
在室温下，将化合物21-3(300mg)溶于乙醇(6ml)，加入sncl2(503.99mg)，回流反
应2h。直接将反应混合物浓缩，得到目标产物21-4的粗品。esi-ms m/z:452.5[m h]

。
[0205]
步骤4：化合物21的合成
[0206]
在室温下，将化合物21-4(20mg)溶于hbr(1ml)，降温至0℃，加入亚硝酸钠(3.06mg)，lcms检测原料转化完全，加入溴化亚铜(19.07mg)，室温反应30min。加水稀释，加入ea(10ml*3)萃取，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥。浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝25:1)纯化得到白色固体状产物21(2.4mg，96.20％纯度)。esi-ms m/z:515.1[m h]

。
[0207]
实施例22：化合物2-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-4-((4-(甲基磺酰基)-3,4-二氢-2h-苯并[b][1,4]恶嗪-8-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0208][0209]
具体反应步骤参考实施例20，目标产物22的esi-ms m/z:567.0[m h]

。
[0210]
实施例23：化合物2-((4-溴-2-氟苯基)氨基)-1-甲基-4-((1-(甲基磺酰基)吲哚-4-基)氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0211][0212]
具体反应步骤参考实施例21，目标产物23的esi-ms m/z:551.0[m h]

。
[0213]
实施例24：化合物4-((1-(乙基磺酰基)-2,3-二氢-1h-茚-4-基)氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0214][0215]
步骤1：化合物24-1的合成
[0216]
在室温下，将化合物4-甲氧基吲哚-1-醇(980mg)乙腈(4ml)中，加入4-甲基苯磺酸(102.78mg)和乙硫醇(1.11g)，氮气吹，80℃下微波反应1h。将反应液直接浓缩，浓缩物通过硅胶柱(pe:ea＝99:1-97:3)纯化得到无色油状产物24-1(850mg，68.37％产率)。esi-ms m/z:209.3[m h]

。
[0217]
步骤2：化合物24-2的合成
[0218]
在室温下，将化合物24-1(850mg)溶解于dcm(10ml)中，冰浴，氮气保护下，滴加bbr3(3.07g)，撤冰浴，室温搅拌2h。后处理加冰，冰浴下加入饱和碳酸钾水溶液，ea萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩物通过硅胶柱(pe:ea＝20:1-10:1)纯化得到淡绿色油状产物24-2(750mg，94.61％产率)。esi-ms m/z:195.3[m h]

。
[0219]
化合物24-3具体合成步骤参考实施例1。
[0220]
步骤3：化合物24的合成
[0221]
在室温下，将化合物24-3(90mg)溶解于dcm(5ml)，冰浴下加入3-氯过氧苯甲酸(26.80mg)，搅拌15min。向反应液中加入冰，加饱和碳酸氢钠水溶液，加饱和亚硫酸氢钠水溶液，dcm萃取，无水硫酸钠干燥。浓缩物通过pre-tlc(dcm:meoh＝25:1)纯化得到白色产物24(26.9mg，28.32％产率)。esi-ms m/z:612.4[m h]

。
[0222]
实施例25：化合物4-((5-(乙基磺酰基)-5,6,7,8-四氢萘-1-基)氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0223][0224]
具体反应步骤参考实施例24，目标产物25的esi-ms m/z:626.1[m h]

。
[0225]
实施例26：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-(3-(s-甲基磺酰亚胺基)苯氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0226][0227]
步骤1：化合物26-1的合成
[0228]
在室温下，将化合物将1-甲氧基-3-甲基磺胺基苯(2g)溶于dcm(10ml)中，降温至-78℃缓慢滴加三溴化硼(9.75g)的dcm(10ml)稀释溶液，加毕，升温至室温搅拌1h。将反应液在-78℃下用饱和碳酸钠的水溶液淬灭，调节ph至7，再用ea萃取三次，无水硫酸钠干燥，蒸干得粗品26-1。esi-ms m/z:141.2[m h]

。
[0229]
步骤2：化合物26-2的合成
[0230]
在室温下，将化合物26-1(1.8g)溶于dma(10ml)中，加入2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈(1.18g)和cs2co3(8.37g)，氮气保护下，升温至160℃反应过夜。将反应液冷却加水稀释，dcm/meoh＝10/1萃取三次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸干得粗品。通过硅胶柱纯化得到黑色油状产物26-2(1.5g)。esi-ms m/z:288.1[m h]

。步骤3：化合物26-3的合成
[0231]
在室温下，将化合物26-2(1.5g)溶于acn(10ml)中，加入氯化亚铜(1.55g)，再加入亚硝酸异戊酯(1.53g)，升温至50℃搅拌2h。将反应液直接浓缩，通过硅胶柱纯化得到红色固体状产物26-3(700mg,产率44％)。esi-ms m/z:307.1[m h]

。
[0232]
步骤4：化合物26-4的合成
[0233]
在室温下，将化合物26-3(700mg)溶于thf(5ml)中，降温至-78℃加入双(三甲基硅
烷基)氨基钾(1m,5.70ml)，加毕，升温至室温继续搅拌30min。反应液加入甲醇淬灭，直接浓缩，通过硅胶柱纯化得到白色固体状产物26-4(650mg,56.15％产率)。esi-ms m/z:508.1[m h]

。
[0234]
步骤5：化合物26-5的合成
[0235]
在室温下，将化合物26-4(650mg)溶于甲醇(5ml)中，加入氨基甲酸氨(299.79mg)，再加入[乙酰氧基(苯基)-碘代]乙酸酯(1.74g)，升温至80℃反应1h。直接浓缩，通过硅胶柱纯化得到棕色固体状产物26-5(400mg,产率58％)。esi-ms m/z:538.9[m h]

。
[0236]
步骤6：化合物26的合成
[0237]
在室温下，将化合物26-5(400mg)加入到混合溶剂乙醇(10ml)和水(2ml)中，加入催化剂parkins试剂(10mg)，升温至80℃搅拌反应18h。直接浓缩，通过pre-hplc纯化得到白色固体状产物26(50.9mg,12.31％产率)。1h nmr(500mhz,dmso)δ9.66(s,1h),7.89(d,j＝7.8hz,2h),7.74(dd,j＝14.6,6.8hz,2h),7.61(dd,j＝24.1,5.3hz,3h),7.43(d,j＝8.3hz,1h),6.66(t,j＝8.7hz,1h),5.19(s,1h),3.21(s,3h),3.17(s,3h)。esi-ms m/z:557.0[m h]

。
[0238]
实施例27：化合物3-((5-氨甲酰-6-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)氧基)苯基甲基氨基甲酰胺基硫代甲酸酯的合成
[0239][0240]
步骤1：化合物27-1的合成
[0241]
在室温下，将化合物3-硝基苯酚(3.18g)溶于dma(30ml)中，加入2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈(2.8g)和cs2co3(19.88g)，氮气保护下，升温至140℃反应4h。将反应液冷却加水稀释，dcm/meoh＝10/1萃取三次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸干得粗品27-1(4.37g,98.50产率)。esi-ms m/z:287.1[m h]

。
[0242]
步骤2：化合物27-2的合成
[0243]
在室温下，将化合物27-1(3.2g)溶于acn(100ml)中，加入氯化亚铜(2.21g)，再加入亚硝酸异戊酯(2.62g)，升温至50℃搅拌2h。冷却到室温后，加入ea稀释，然后饱和亚硫酸钠溶液洗几次，然后干燥，得到粗品27-2(3.2g,93.64％产率)。esi-ms m/z:306.2[m h]

。
[0244]
步骤3：化合物27-3的合成
[0245]
在室温下，将化合物2-氟-4-碘-苯胺(4.34g)溶解在thf中，然后冷却到-70℃后，加入双(三甲基硅烷基)氨基钾(3.65g,18ml)，反应10min后，加入化合物27-2(2.8g)，维持该温度下反应30min。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭后，ea稀释，然后水洗，有机相干燥后旋干。通过硅胶柱纯化得到棕色胶状物27-3(3.1g,66.85％产率)。esi-ms m/z:507.1[m h]

。
[0246]
化合物27-4与化合物27-5的合成步骤参考实施例1。
[0247]
步骤6：化合物27的合成
[0248]
在室温下，将化合物27-5溶解在水(3ml)中，然后冷却到0℃后，往体系中加入nano2(6.83mg)，维持在0℃下反应。加入亚硫酸氢钠淬灭反应后，直接旋干，得到粗品中间体。将得到的粗品中间体与甲基硫脲(89.03mg)溶于dmf(3ml)中，60℃搅拌10min。将反应液直接浓缩，通过pre-hplc纯化得到棕色固体状产物27(11.2mg,19.99％产率)。esi-ms m/z:568.0[m h]

。
[0249]
实施例28：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-(3-氨磺酰苯氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0250][0251]
步骤1：化合物28-1的合成
[0252]
在室温下，将化合物27-5(20mg)，加盐酸(40.46umol,1ml)溶解，降温至0℃，加nano2(2.79mg)，0℃继续反应0.5h，取样检测，显示原料转化完全。在另外一个瓶子里加水(1ml)，0℃下加氯化亚砜(96.28mg,58.71ul)，再加氯化亚铜(4.01mg)，然后将前面的反应液用滴管迅速转移到该反应瓶中，然后室温反应0.5h。用dcm萃取，干燥，浓缩，得到粗品28-1(30mg)。esi-ms m/z:578.8[m h]

。
[0253]
步骤2：化合物28的合成
[0254]
在反应瓶中加入氨水(2ml)，降温至0℃，然后缓慢滴加前面的粗品28-1(10mg)，加完0℃继续反应0.5h。加水和ea萃取，干燥，浓缩，通过pre-tlc纯化得到淡黄色固体状产物28(1.4mg,14.49％产率)。esi-ms m/z:559.3[m h]

。
[0255]
实施例29：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-(3-(3-甲基-2,4-二氧代咪唑啉-1-基)苯氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0256][0257]
步骤1：化合物29-1的合成
[0258]
在室温下，将化合物27-5(100mg)溶于dmf(3ml)中，再加2-溴-n-甲基乙酰胺(246.01mg)和n-乙基-n-异丙基-2-胺(209.19mg,281.92ul)，60℃反应20h。向反应液中加水和ea萃取，干燥，浓缩。通过pre-tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化得到黄色固体状产物29-1(46mg,40.22％产率)。esi-ms m/z:566.3[m h]

。
[0259]
步骤2：化合物29-2的合成
[0260]
在室温下，将化合物29-1(40mg)溶于thf(4ml)中，加吡啶(55.97mg,57.00ul)，再分批加4-硝基苯基)氯化碳(142.62mg)，室温反应1h。向反应液中加水和ea萃取，干燥，浓
缩，得到黄色油状产物29-2(60mg)。esi-ms m/z:731.4[m h]

。
[0261]
步骤3：化合物29的合成
[0262]
在室温下，在反应瓶中加入29-2(50mg)，加1m的1-[三丁基(氟)-氮杂基]丁烷(17.90mg,4ml)，室温反应0.5h。向反应液中加水和ea萃取，干燥，浓缩。通过pre-tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化得到黄色固体状产物29(18mg,44.47％产率)。1h nmr(500mhz,dmso)δ9.72(s,1h),7.65(t,j＝8.3hz,4h),7.59-7.46(m,2h),7.43(d,j＝8.5hz,1h),7.03(d,j＝7.5hz,1h),6.65(t,j＝8.7hz,1h),5.16(s,1h),4.48(s,2h),3.16(d,j＝7.2hz,3h),2.93(s,3h)。esi-ms m/z:592.3[m h]

。
[0263]
实施例30：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-(3-(3-甲基脲基)苯氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0264][0265]
在反应瓶中加入化合物27-5(50mg)，加thf(2ml)溶解，0℃下加吡啶(40.01mg,40.75ul)和(4-硝基苯基)氯化碳(50.98mg，室温反应0.5h，再加甲胺thf溶液(150ul)，室温反应0.2h。向反应液中加水和ea萃取，干燥，浓缩。通过pre-tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化得到白色固体状产物30(25mg,45.35umol,44.83％产率)。1h nmr(500mhz,dmso)δ9.77(s,1h),8.76(s,1h),7.67-7.58(m,3h),7.51(t,j＝2.0hz,1h),7.42(d,j＝8.5hz,1h),7.32(t,j＝8.1hz,1h),7.15(d,j＝8.2hz,1h),6.76(dd,j＝8.0,2.1hz,1h),6.64(t,j＝8.7hz,1h),6.09(s,1h),5.18(s,1h),3.15(d,j＝8.6hz,3h),2.63(d,j＝4.6hz,3h)。esi-ms m/z:552.3[m h]

。
[0266]
实施例31：化合物4-(3-(二甲基磷酰基)苯氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0267][0268]
步骤1：化合物31-1的合成
[0269]
在室温下，将化合物1-溴-3-甲氧基苯(2g)，甲基膦酰甲烷(100.15mg)溶于dma(15ml)中，再加k3po4(453.39mg)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(61.91mg)和pd(oac)2(24.01mg)，氮气置换后氮气保护下微波150℃反应1h。加水和ea萃取，发现产物都在水相里面，浓缩水相。通过反向硅胶柱纯化得到无色油状产物31-1(1.1g,55.85％产率)。esi-ms m/z:185.2[m h]

。
[0270]
步骤2：化合物31-2的合成
[0271]
在室温下，在反应瓶中加入化合物31-1(1.05g)，加干燥的dcm(12ml)溶解，降温至-20℃，然后加bbr3(7.27g)，在该温度下继续反应0.5h。低温下加甲醇淬灭反应，然后加碳酸氢钠水溶液和dcm萃取，产物在水相，将水相旋干，加dcm和甲醇溶解，把不溶的盐过滤掉，再浓缩。得到白色固体状产物31-2(960mg,98.97％产率)。esi-ms m/z:171.2[m h]

。
[0272]
步骤3：化合物31-3的合成
[0273]
在室温下，在反应瓶中加入化合物31-2(925.59mg)，2-氨基-4-氯-1-甲基-6-氧代吡啶-3-碳腈(500mg)，cs2co3(3.54g)，加dma(10ml)溶解，160℃反应24h。先将cs2co3过滤掉，然后用油泵高温下把dma旋掉。通过反向硅胶柱纯化得到黄色固体状产物31-3(450mg,52.14％产率)。esi-ms m/z:318.3[m h]

。
[0274]
目标产物31的具体合成步骤参考实施例1。1h nmr(500mhz,meod)δ7.81-7.62(m,3h),7.55(dd,j＝10.3,1.7hz,1h),7.47(dd,j＝10.9,4.5hz,2h),6.69(t,j＝8.6hz,1h),5.35(s,1h),1.83(s,3h),1.80(s,3h)。esi-ms m/z:556.3[m h]

。
[0275]
实施例32：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-(3-(甲基磺酰基)苯氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0276][0277]
目标产物32的具体合成步骤参考实施例1与实施例24。1h nmr(500mhz,dmso)δ9.71(s,1h),7.88(d,j＝7.0hz,2h),7.78(t,j＝8.0hz,1h),7.72(s,1h),7.68-7.60(m,3h),7.43(d,j＝8.5hz,1h),6.67(t,j＝8.7hz,1h),5.21(s,1h),3.29(s,3h),3.17(s,3h).esi-ms m/z:558.0[m h]

。
[0278]
实施例33：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-4-(3-((甲基磺酰基)甲基)苯氧基)-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0279][0280]
具体合成步骤参考实施例32，目标产物33的esi-ms m/z:572.0[m h]

。
[0281]
实施例34：化合物4-(3-((二甲基磷酰基)甲基)苯氧基)-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0282][0283]
步骤1：化合物34-1的合成
[0284]
在室温下，向甲基膦酰甲烷(2.25g)的thf(137.5ml)(0.2m溶液)澄清液中，加入双(三甲基硅烷基)酰胺钠(27.36ml)，反应液搅拌30min，出现浑浊，然后滴加含有1-(溴甲基)-3-甲氧基苯(5g,24.87mmol)的thf(125ml)溶液(0.2m溶液)，然后25℃下反应16h。反应液加入250ml清水中，dcm(3*250ml)萃取，水相无产品，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。得到无色液体状产物34-1(4.9g,99.42％产率)。esi-ms m/z:199.2[m h]

。
[0285]
步骤2：化合物34-2的合成
[0286]
在室温下，向化合物34-1(4.5g)的acoh(13.5ml)溶液中，加入hbr(57.41g,38.53ml,48％纯度)(48％水溶液)，氮气保护，然后120℃下反应18h。反应液减压浓缩，除去溴化氢和水，然后用甲苯(5*10ml)带5次。得到棕色液体状产物34-2(4.0g,95.66％产率)。esi-ms m/z:199.2[m h]

。
[0287]
后续反应具体合成步骤参考实施例1，目标产物34的esi-ms m/z:570.3[m h]

。
[0288]
实施例35：化合物2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-1-甲基-6-氧代-4-(3-((2-氧代咪唑啉-1-基)甲基)苯氧基)-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺的合成
[0289][0290]
步骤1：化合物35-1的合成
[0291]
在室温下，1000ml三口瓶，加入(3-甲氧基苯基)甲酰胺(5.35g,5ml)，thf(50ml)，冰浴，滴加1-氯-2-异氰酸酯-乙烷(4.12g,3.32ml)，滴毕，反应10min，加入t-buok(5.25g)，室温反应1h。加水淬灭，ea萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。通过硅胶柱(pe:ea＝1:2)纯化得到白色固体状产物35-1(3.0g,37.30％产率)。esi-ms m/z:207.2[m h]

。
[0292]
步骤2：化合物35-2的合成
[0293]
在室温下，100ml三口瓶，加入化合物35-1(3g)，dcm(30ml)，降温至-60℃，滴加bbr3(36.44g,13.75ml)，滴毕，自然升温至室温反应1h。降温到-20℃，用2n naoh淬灭，调节ph至8，ea萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。得到黄色固体状产物35-2(3.0g,crude)esi-ms m/z:207.2[m h]

。
[0294]
后续反应具体合成步骤参考实施例19，目标产物35的esi-ms m/z:578.1[m h] 。
[0295]
下述的实施例采用上述方法合成，或使用相应中间体的类似方法合成。
[0296][0297][0298]
对比化合物1：2-(2氟-4-碘苯氨基)-1-甲基-4-(6-甲基吡啶-3-基氧基)-6-羰基-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺
[0299]
如wo2015058589中实施例31所述方法制备以下对比化合物1。
[0300][0301]
对比化合物2(d2)：2((2-氟4-碘苯基)氨基)-(4-咪唑并[1,2-a]吡啶-8-氧基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺
[0302][0303]
步骤1：化合物m1-1的合成
[0304]
将丙二酸二甲酯(39.60g)和丙二腈(19.80g)溶于无水四氢呋喃(200ml)，降温至-25℃，氮气保护下缓慢滴加dbu(91.34g)，滴毕，升至室温搅拌18h。滴加30％甲胺水溶液(200ml),室温搅拌24h。滴加10n氢氧化钠水溶液(45ml)，室温搅拌6h。反应毕，冰浴下加丙酮(300ml)搅拌30min，抽滤，滤饼丙酮润洗，减压干燥后得50.00g白色固体，即化合物m1-1。
[0305]
步骤2：化合物m1-2的合成
[0306]
将化合物m1-1(50.00g)溶于乙腈(500ml)，冷却至0℃后缓慢滴加三氯氧磷(120ml)，滴毕，搅拌30min后升至70℃反应12h。反应毕，将反应液淬灭于饱和碳酸钾溶液中(1l)，黄色固体析出，抽滤，滤饼水洗，减压干燥后得26.00g黄色固体，即化合物m1-2。
[0307]
步骤3：化合物m1的合成
[0308]
将化合物m1-2(26.00g)和3,4-二氟硝基苯(22.60g)溶于dma(300ml)中，加入碳酸铯(69.30g)，100℃反应2h。反应毕，冷却至室温后将反应液淬灭余冰水中(1.5l)，3n hcl调节ph＝5-6，黄色固体析出，抽滤，滤饼水洗后乙酸乙酯打浆，得25.00g黄色固体，即化合物m1。
[0309]
lcms：[m h]

＝322.88
[0310][0311]
步骤4：化合物d2-1的合成
[0312]
20ml微波管中加入化合物m1(1.50g)和咪唑并[1,2-a]吡啶-8-醇(0.69g)，溶于dma(15ml)，n2保护下加入碳酸铯(4.54g)，150℃反应1h。直接旋干，硅胶柱分离产物(dcm:
meoh＝20:1～10:1)，得170mg黄色固体，即化合物d2-1。
[0313]
步骤5：化合物d2-2的合成
[0314]
25ml单口瓶中加入化合物d2-1(170mg)，浓硫酸(2ml)，100℃反应0.5h。冷却至室温，滴到冰水(10ml)中，氨水调节ph至7～8，析出固体，抽滤并用清水洗滤饼，烘干得240mg黄色固体粗品，即化合物d2-2。
[0315]
步骤6：化合物d2-3的合成
[0316]
50ml单口瓶中加入化合物d2-2(240mg)，etoh(6ml)，h2o(6ml)，加入fe粉(122mg)，nh4cl(87mg)，80℃反应4h。趁热过滤，滤饼用热乙醇洗，旋去乙醇析出固体，过滤并用水洗滤饼，过滤得360mg棕色固体粗品，即化合物d2-3。
[0317]
步骤7：化合物d2的合成
[0318]
8ml样品瓶中加入化合物d2-3(180mg)，溶于浓盐酸(1.3ml)，冰浴，将nano2(36mg)溶于0.5ml水中，缓慢滴入上述反应液中，滴毕，保温反应30min。将碘化钾(146mg)溶于0.8ml水中，滴入上述反应液中，滴毕，搅拌15min，撤去冰浴，室温反应过夜，抽滤，滤饼用饱和硫代硫酸钠溶液打浆30min，过滤，水洗，hplc分离产物(h2o:meoh＝1:1)，得黄色固体59.1mg，即化合物d2，纯度(95.64％)。
[0319]
lcms：[m h]

＝519.99。
[0320]
药理实验
[0321]
实施例a：激酶试验
[0322]
步骤1：化合物配制
[0323]
化合物溶解在100％dmso溶液中。
[0324]
步骤2：激酶反应过程
[0325]
(1)配制1
×
激酶缓冲溶液。
[0326]
(2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为300nm，在384source板中稀释成100倍终浓度的100％dmso溶液，用presision 3倍稀释化合物，10个浓度。使用分液器echo550向目的板optiplate-384f转移250nl 100倍终浓度的化合物。
[0327]
(3)用1
×
激酶缓冲溶液配制2.5倍浓度的激酶溶液。
[0328]
(4)在化合物孔和阳性对照孔分别加10μl的2.5倍终浓度的激酶溶液，在阴性对照孔中加10μl的1
×
激酶缓冲溶液。
[0329]
(5)1000rpm离心30秒，反应板振荡混匀后室温孵育10min。
[0330]
(6)用1
×
激酶缓冲溶液配制5/3倍终浓度的atp和激酶底物的混合溶液。
[0331]
(7)加入15μl的5/3倍终浓度的atp和底物的混合溶液，起始反应。
[0332]
(8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温分别孵育相应的时间。
[0333]
(9)加入30μl终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。
[0334]
(10)用caliper ez reader读取转化率。
[0335]
步骤3：数据处理
[0336]
抑制百分数％＝(conversion％_max-conversion％_sample)/(conversion％_max-conversion％_min)
×
100。
[0337]
其中：“conversion％_sample”表示样品的转化率读数；“conversion％_min”表示阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；“conversion％_max”表示阳性对照孔比
值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
[0338]
拟合量效曲线：以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpad prism 5的log(inhibitor)vs.response-variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的ic
50
值。计算公式如下：
[0339]
y＝底 (高-底)/(1 10^((logic
50-x)*斜率))
[0340]
所有实施例化合物都对mek1具有良好的抑制，实施例部分化合物的mek1抑制的ic
50
数据参见表1。
[0341]
表1
[0342]
化合物序号化合物抑制mek1的ic
50
(nm)9161211
[0343]
实施例b：colo205细胞增殖试验
[0344]
将colo205细胞按2000细胞、135μl/孔铺96孔板。孵育隔夜后，配制梯度浓度的化合物溶液，分别向各孔细胞中加入15。孵各浓度的待测化合物dmso溶液，化合物终浓度为30000、10000、3333.3、1111.1、370.4、123.5、41.2、13.7、4.6、0nm(dmso终浓度均为0.5％)。37℃，5％co2孵育72h。向各孔中加入50μl cell-titer glo工作液，震荡混匀后室温孵育10min，多功能酶标仪读取luminescence发光值，将发光值读数转换为抑制百分数：
[0345]
抑制百分数＝(最大值-读数)/(最大值-最小值)*100。
[0346]“最大值”为dmso对照；“最小值”表示无细胞对照组。
[0347]
用graphpad prism软件进行曲线拟合并得到ic
50
值。
[0348]
所有实施例化合物都对colo205细胞具有良好的抑制，数据参见表2。
[0349]
实施例c：hct116细胞增殖试验
[0350]
将hct116细胞按2000细胞、135μl/孔铺96孔板。孵育隔夜后，配制梯度浓度的化合物溶液，分别向各孔细胞中加入15。孵各浓度的待测化合物dmso溶液，化合物终浓度为30000、10000、3333.3、1111.1、370.4、123.5、41.2、13.7、4.6、0nm(dmso终浓度均为0.5％)。37℃，5％co2孵育72h。向各孔中加入50μl cell-titer glo工作液，震荡混匀后室温孵育10min，多功能酶标仪读取luminescence发光值，将发光值读数转换为抑制百分数：
[0351]
抑制百分数＝(最大值-读数)/(最大值-最小值)*100。
[0352]“最大值”为dmso对照；“最小值”表示无细胞对照组。
[0353]
用graphpad prism软件进行曲线拟合并得到ic
50
值。
[0354]
所有实施例化合物都对hct116细胞具有良好的抑制，实施例化合物和对比化合物对hct116细胞抑制的ic
50
数据参见表2。
[0355]
表2
[0356]
[0357][0358]
实施例d：人结直肠癌hct116 cdx肿瘤模型上的体内药效学研究
[0359]
用经典的小鼠肿瘤模型试验，观察灌胃给药后，目标化合物抑瘤率tgi(％)，以评价其抗肿瘤活性。
[0360]
实验方法：人结直肠癌hct166细胞体外单层培养，培养条件为mccoy’s 5a培养基中加10％胎牛血清，1％双抗，37℃ 5％co2孵箱培养。一周两次进行常规处理传代。当细胞饱和度为80％-90％，数量到达要求时，收取细胞，计数，接种。将0.1ml(1
×
107个)hct116细胞皮下接种于每只balb/c nude小鼠的右后背，肿瘤平均体积达到约157mm3时开始分组给药。
[0361]
实验结果：化合物12和阳性化合物trametinib(市售)均可有效降低肿瘤tgi(表3)；且同等剂量下目标化合物12和trametinib对小鼠的体重影响相当。
[0362]
表3
[0363]
表化合物剂量(mg/kg)给药方式tgi(％)123qd*21105trametinib3qd*21103
[0364]
实施例e：herg测试
[0365]
1稳转细胞准备
[0366]
细胞株来源于过表达herg钾离子通道hek293细胞，细胞在37℃、5％co2培养箱中培养。当细胞密度达培养皿80％时，先用磷酸盐缓冲液(pbs)预清洗，然后用胰蛋白酶/edta消化细胞2-3分钟，加入细胞培养基停止消化，轻轻用移液管吹打并转移到离心管中，1000转/分钟离心3分钟，上清液倒掉，加入细胞培养基，轻轻吹打将细胞混匀，随后转移到培养
皿中进行传代培养，或将细胞滴于圆形玻片上在细胞培养液中培养待细胞贴壁用于实验。
[0367]
细胞培养基组成：dmem、15％胎牛血清和1％100x青霉素-链霉素。
[0368]
2溶液配制
[0369]
细胞内液和外液的组成成分见表4。
[0370]
表4
[0371][0372]
3电生理手动膜片钳系统实验方案
[0373]
将稳转的细胞滴于圆形玻片上并置于培养皿中，细胞密度低于50％，培养过夜。将实验用细胞转移到一个嵌于倒置显微镜平台的细胞浴槽中，灌流细胞外液，灌流速度为2.7ml/分钟。稳定5分钟后即可开始实验。采用heka epc-10膜片钳放大器和patchmaster采集系统记录膜电流(heka instruments inc.,d-67466lambrecht，pfalz，germany)。所有实验均在室温(22-24℃)下完成。实验中使用p-97微电极拉制仪(sutter instrument company，one digital drive，novato，ca 94949)拉直电极(bf150-110-10)。电极内径为1-1.5mm，充满内液后的入水电阻为2-4mω。
[0374]
herg钾通道的电生理刺激方案，是首先将膜电压钳制在-80mv，给予细胞持续2s, 20mv电压刺激，激活herg钾通道，再复极化至-50mv,持续5s，产生外向尾电流，刺激频率每15s一次。电流值为尾电流的峰值。
[0375]
实验中采用全细胞记录模式记录通道电流。首先灌流细胞外液(大约每分钟2毫升)并持续记录，并等待电流稳定(5分钟内电流衰减(run-down)小于5％)，此时尾电流峰值即为对照电流值。接着灌流含待测药物的细胞外液并持续记录直到药物对herg电流的抑制作用到达稳定状态，此时尾电流峰值即为加药后电流值。稳定状态的标准以最近的连续3个电流记录线是否重合来判断。达到稳定态势以后如果以细胞外液灌流冲洗后herg电流回复或接近加药物之前的大小，则可以继续灌流测试其它浓度或药物。30μm quinidine(奎尼丁)被用于实验中作为阳性对照以保证所使用的细胞反应正常。
[0376]
4化合物准备
[0377]
用dmso稀释母液至下列浓度(次级母液)，分别为：3.3、1.1、0.37、0.12mm，取母液和次级母液各30μl稀释至10ml细胞外液中，用于电生理检测；
[0378]
化合物的终浓度为30,10,3.3,1.1,0.37μm；
[0379]
dmso的终浓度为3:1000。
[0380]
5数据分析
[0381]
实验数据使用patchmaster v2x60(heka instruments inc.,d-67466lambrecht，pfalz，germany)采集，并采用origin 8.5(originlab corporation，northampton，ma)软件以及microsoft excel进行分析和统计。
[0382]
6质量控制
[0383]
本研究按照科瑞斯实验室标准操作规程(近似glp规范)执行，同时所有实验方法均参考同行评议期刊发表的文献，并按照科瑞斯生物的标准实验操作规程执行。
[0384]
报告中的试验数据需要满足以下标准：
[0385]
电生理记录参数
[0386]
封接电阻》500mω
[0387]
直联电阻(rs)《10mω
[0388]
初始尾电流幅度》300pa
[0389]
电流rundown(自发性减小)《2％/每分钟
[0390]
漏电流《200pa或者herg电流峰值的10％(在90％的记录时间之内)
[0391]
7实验结果：
[0392]
表5
[0393]
化合物herg ic50(um)12》30trametinib6
[0394]
8实验结论：
[0395]
药物对于心脏herg钾离子通道的抑制是药物导致qt延长综合症的主要原因。实验结果表明，本发明实施例化合物对于心脏herg钾离子通道没有明显抑制作用，可以避免高剂量时的心脏毒副作用。
[0396]
虽然本发明已通过其实施方式进行了全面的描述，但是值得注意的是，各种变化和修改对于本领域技术人员都是显而易见的。这样的变化和修改都应该包括在本发明所附权利要求的范围内。