一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用与流程

1.本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用，尤其涉及一种用于检测呼吸道病原体的引物探针组合、利用所述引物探针组合制备的呼吸道病原体分子检测试剂盒以及试剂盒的使用方法和应用。


背景技术：

2.呼吸道感染(respiratory tract infection，rti)是临床最常见的疾病之一，是致病微生物侵入呼吸道并进行繁殖导致的疾病，根据其部位分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染包括鼻炎、咽炎和喉炎，90％左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。下呼吸道感染包括气管炎、支气管炎和肺炎，由病毒、细菌、支原体、衣原体和军团菌等微生物引起。呼吸道感染在任何季节、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播，常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累或淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染。该病预后良好，有自限性，一般5～7天痊愈。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。
3.who数据显示，呼吸道感染是全球第四大致死原因，是引起世界范围内5岁以下儿童死亡的首位原因。2010年，在全球范围内住院患儿当中发生1100万次严重的急性下呼道感染，发生300万次非常严重的下呼吸道感染。2013年，全球发生上呼吸道感染188亿次，发生下呼吸道感染1.5亿次，造成2600万人死亡。
4.5岁以下儿童呼吸道感染中，由病毒引起的较细菌更为常见。据统计，每年儿童发生病毒性呼吸道感染的中位次数是5次，更有10％的儿童每年发生多达10次以上的呼吸道病毒感染。儿童呼吸道病毒感染的发生率远高于成人，且年龄越小发生呼吸道感染的比例越高。在儿童急性下呼吸道感染住院病例和社区获得性肺炎病例中，1岁以内儿童呼吸道病毒的检出率为76.1％～83％，2～5岁儿童呼吸道病毒的检出率为63.1％～73.8％。儿童cap的主要病原为呼吸道合胞病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、鼻病毒、偏肺病毒和肺炎支原体。我国成人cap患者中病毒检出率为15.0％～34.9％，流感病毒占首位，其他病毒包括副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。
5.近年来，呼吸道病原体引起的传染病频繁爆发，其中不少传染病以爆发流行的面貌出现，在短期内致数以万计的人罹患疾病并造成大规模的人群死亡。这些爆发性传染病的病原体主要是病毒，其多由空气飞沫传播，传播不易控制、传染范围较广，易引起大流行，严重影响了公共安全。
6.由于呼吸道感染患者多发病进程快、病原体传染性强、病原体很广、临床表现多样、抗生素治疗效果甚微、产生抗药菌株等特点，使得临床治疗面临越来越多的挑战。不同病原体的治疗原则具有明显的不同。但由于其症状相似，常难以判定其病原体。通过常规方法大约只能明确46％为获得性肺炎病因，对于病毒引起的下呼吸道感染，只有40％能明确病毒病原。呼吸道合胞病毒、副流感病毒、流感病毒是引起儿童下呼吸道感染和毛细支气管
炎的常见病毒，仍然有超过1/3的病例不能明确病原。另有研究发现，各种病原体的检出率与季节变化有一定的关系，且混合感染比单一感染更为常见。
7.因此，呼吸道感染的病原学检测变得越来越重要，只有明确诊断，临床医生才能够进行针对性治疗。尽可能快速准确全面地明确病毒类型，对指导临床治疗，指导用药的及时、合理、有效应用，降低患者死亡率、改善预后、避免滥用抗生素及采取必要的隔离措施具有重要的意义。
8.传统的呼吸道病原体检测方法为微生物分离培养和抗原抗体检测，但这些方法检测繁琐费时，检测往往不够及时，灵敏度不够，假阳性率偏高。近些年随着分子生物学检测手段的发展和完善，使得及时、快速、准确地诊断呼吸道病原体成为可能。其中，实时荧光定量pcr具有高灵敏度、高特异性且操作简便等优点，在此基础上发展起来的多重实时荧光定量pcr，它把多种病原体检测集中到一管中进行反应，既节省了成本，又兼具了荧光定量pcr的准确性和灵敏度。
9.cn112195278a公布了一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法，在同一反应体系a/b两管中检测是否存在呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒ⅰ型、副流感病毒ⅱ型和副流感病毒ⅲ型。该发明中副流感病毒分三个亚型分别检测，能检测病毒种类大大受限。cn109487008a和cn111378789a亦是分别检测副流感病毒ⅰ型、副流感病毒ⅱ型和副流感病毒ⅲ型。cn111074001a公开了一种用3个pcr反应管同时检测9种病原体靶核酸的协同四重实时荧光pcr检测方法，用于检测样品中甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、人鼻病毒和人偏肺病毒，但所设计的副流感病毒引物探针仅能检测副流感病毒ⅰ型，对副流感病毒其他三种亚型会造成漏检。
10.因此，提供一种能够全面、快速且准确地检测多种呼吸道感染病原体，尤其是多种亚型副流感病毒的呼吸道病毒核酸检测试剂盒，对于本领域而言具有重要的意义。


技术实现要素：

11.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用。所述分子检测试剂盒能够仅用3个pcr反应管，快速、准确地检测出样品中是否含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和人博卡病毒。
12.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
13.第一方面，本发明提供一种用于检测呼吸道病原体的引物探针组合，所述引物探针组合包括：扩增副流感病毒的引物对和检测副流感病毒的探针；
14.其中，所述检测副流感病毒的探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，用于检测副流感病毒i型、副流感病毒ii型、副流感病毒iii型和副流感病毒iv型；所述检测副流感病毒的探针的5'端采用荧光基团i修饰，3'端采用mgb(minor groove binder，小沟结合物)基团修饰。
15.由于副流感病毒分为ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ四个亚型，通过序列比对发现，这四种亚型的保守序列仅存在22个碱基，tm＝55.55℃。而在pcr扩增过程中，为了保证探针或引物与模板的结合效率，探针和引物都有一定的长度的限制，一般所设计的引物长度在18～25个碱基，而
taqman探针的长度一般为20～40个碱基，tm范围在65～67℃；因此，若要同时检测副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ四个亚型，目前的保守序列无法满足探针设计的要求。因此，目前常设计分别检测副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ三种亚型的引物探针，占用了宝贵的检测通道，使得试剂盒检测的其他类型的病原体种类减少；或者，仅检测副流感病毒ⅰ一种亚型，进而造成其他副流感病毒亚型的遗漏。
16.为了同时检测多种病原体的种类和多种亚型的副流感病毒，在设计副流感病毒检测引物对和探针时，采用mgb基团修饰，能够将寡核苷酸的退火温度提高10℃左右，缩短引物或探针的长度；本发明中，采用mgb基团修饰检测探针，将检测探针的退火温度提高至65℃，在同一体系中用单一通道同时实现四个亚型的检测。
17.作为本发明优选的技术方案，所述扩增副流感病毒的引物对的核苷酸序列如seq id no.2～9所示，用于扩增副流感病毒i型、副流感病毒ii型、副流感病毒iii型和副流感病毒iv型。
18.本发明中，所述扩增和检测副流感病毒的引物对和探针如下表1所示：
19.表1
[0020][0021]
优选地，所述引物探针组合还包括扩增和检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和人博卡病毒的引物对和探针。
[0022]
优选地，所述引物探针组合中检测人博卡病毒、副流感病毒和偏肺病毒的探针包含荧光基团i，检测呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒和甲型流感病毒的探针包含荧光基团ii，检测肺炎支原体、腺病毒和人鼻病毒的探针包含荧光基团iii，且所述荧光基团i、荧光基团ii和荧光基团iii为三种不同的荧光基团。
[0023]
优选地，所述荧光基团i、荧光基团ii和荧光基团iii为荧光基团fam、hex、vic、cy5、tamra或rox中的任意三种。
[0024]
作为本发明优选的技术方案，扩增和检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和人博卡病毒的引物对和探针的核苷酸序列如seq id no.10～33所示(如表2所示)：
[0025]
表2
[0026]
[0027][0028]
利用如seq id no.1～33所示的核苷酸序列构建的引物探针组合，能够检测如下表3所示的呼吸道病原体及其亚型：
[0029]
表3
[0030][0031][0032]
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的引物探针组合制备的呼吸道病
原体分子检测试剂盒。
[0033]
优选地，所述呼吸道病原体分子检测试剂盒包括：扩增和检测副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和人博卡病毒的引物对和探针。
[0034]
本发明提供了一种用3个pcr反应管同时检测9种病原体靶核酸的多重实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法，用于检测样品中甲型流感病毒(flua)、乙型流感病毒(flub)、副流感病毒(piv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、肺炎支原体(mp)、腺病毒(adv)、人鼻病毒(hrv)、偏肺病毒(mpv)和人博卡病毒(hbov)。
[0035]
作为本发明优选的技术方案，所述呼吸道病原体分子检测试剂盒还包括：酶混合液、核酸扩增反应液、阴性质控和阳性质控。
[0036]
为克服试剂盒在存储和运输过程中温度变化对试剂盒中酶活性的影响，本发明中还优化了酶混合液的组成，提高试剂盒稳定性。
[0037]
优选地，所述酶混合液为包含dna聚合酶、udg酶、逆转录酶、海藻糖和dtt的tris
‑
hcl缓冲液。
[0038]
优选地，所述酶混合液中海藻糖的摩尔浓度为100～300mm，例如100mm、120mm、140mm、150mm、180mm、200mm、220mm、250mm、260mm、280mm或300mm等。
[0039]
优选地，所述酶混合液中dtt的摩尔浓度为10～60mm，例如10mm、20mm、30mm、40mm、50mm或60mm等。
[0040]
优选地，所述酶混合液中tris
‑
hcl的摩尔浓度为200～300mm，例如200mm、220mm、250mm、260mm、280mm或300mm等。
[0041]
优选地，所述核酸扩增反应液包含：rt
‑
pcr缓冲液、rna酶抑制剂、dutps和oligo(dt)20。
[0042]
优选地，所述rt
‑
pcr缓冲液为包含kcl和mgcl2的tris
‑
hcl缓冲液。
[0043]
优选地，所述rt
‑
pcr缓冲液中kcl的摩尔浓度为300～400mm，例如300mm、310mm、320mm、330mm、340mm、350mm、360mm、370mm、380mm、390mm或400mm等。
[0044]
优选地，所述rt
‑
pcr缓冲液中mgcl2的摩尔浓度为10～20mm，例如10mm、12mm、14mm、15mm、16mm、18mm或20mm等。
[0045]
优选地，所述rt
‑
pcr缓冲液中tris
‑
hcl的摩尔浓度为200～300mm，例如200mm、210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm或300mm等。
[0046]
优选地，所述rt
‑
pcr缓冲液的ph为8.0～8.5，例如可以是8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5等。
[0047]
作为本发明优选的技术方案，所述呼吸道病原体分子检测试剂盒中引物对和探针的混合情况如下：
[0048]
检测呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、人博卡病毒和内参基因的引物对和探针混合制得第一引物探针溶液；
[0049]
检测乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒和内参基因的引物对和探针混合制得第二引物探针溶液；
[0050]
检测甲型流感病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和内参基因的引物对和探针混合制得第三引物探针溶液。
[0051]
本发明中，将引物对和探针按照上述方法进行分管，可以避免扩增反应时引物之间相互干扰，若不按照此方式进行分管，很可能会导致某些基因扩增失败，进而导致检测准确度的下降。
[0052]
优选地，所述呼吸道病原体分子检测试剂盒中还包括检测内参基因的引物对和探针。
[0053]
第三方面，本发明还提供一种如第二方面所述的呼吸道病原体分子检测试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
[0054]
提取待测样本，制备扩增反应体系，所述扩增反应体系包括反应体系i、反应体系ii和反应体系iii；
[0055]
而后，进行扩增反应，实时检测所述扩增反应体系的荧光强度并根据荧光检测结果计算ct值，判断所述待测样本中呼吸道病原体的存在情况。
[0056]
优选地，所述反应体系i中包括包括第一引物探针溶液，所述反应体系ii中包括第二引物探针溶液，反应体系iii中包括第三引物探针溶液。
[0057]
作为本发明优选的技术方案，本发明中所述反应体系以25μl计，包括3～5μl模板、3～5μl引物探针溶液、1～4μl酶混合液，5～15μl核酸扩增反应液，不足25μl以depc水补足即可。
[0058]
作为本发明优选的技术方案，所述扩增反应的条件为：第一阶段：50℃，10～15min(例如10min、11min、12min、13min、14min或15min等)；第二阶段：95℃，8～12min(例如8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等)；第三阶段：95℃，8～10s(例如8s、9s或10s)，55℃，35～40s(例如35s、36s、37s、38s、39s或40s)，40～45个循环(例如40个、41个、42个、43个、44个或45个等)。
[0059]
优选地，所述扩增反应的条件为：
[0060]
第一阶段：50℃，15min；
[0061]
第二阶段：95℃，10min；
[0062]
第三阶段：95℃，10s，55℃，40s，45个循环。
[0063]
第四方面，本发明还提供一种如第一方面所述的引物探针组合或如第二方面所述的呼吸道病原体分子检测试剂盒在检测样本中呼吸道病原体分子存在情况中的应用，所述应用可以作为一种呼吸道疾病的辅助诊断方式。
[0064]
本发明中，所述引物探针不仅能够检测生物样本中是否存在呼吸道病原体分子，存在何种病原体，实现精准治疗；还能够检测非生物样本，例如环境样本，判断环境中是否存在病原体，进而判断提供样本的环境是否符合卫生标准，是否需要进行进一步的消杀处理等。
[0065]
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
[0066]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0067]
(1)本发明提供了一种用于检测九项呼吸道病原体分子的引物探针组合，所述引物探针组合中使用同一条mgb基团修饰的探针，同时检测四种不同亚型的副流感病毒，即副流感病毒i型、副流感病毒ii型、副流感病毒iii型和副流感病毒iv型，节省了荧光检测时的
检测通道，为提高分子检测试剂盒的检测种类和亚型奠定了基础；
[0068]
(2)本发明还提供了一种同时检测九种病原体的分子检测试剂盒，所述试剂盒用3个pcr反应管(或3个反应体系)，实现病原体靶核酸的多重实时荧光pcr检测，能够快速、准确地检测出样品中是否含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、腺病毒、人鼻病毒、偏肺病毒和人博卡病毒；该检测试剂盒覆盖的靶标病毒种类较多，亚型较多，且操作简单，检测准确，灵敏度高。
附图说明
[0069]
图1为实施例3中第二管反应体系在fam通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0070]
图2为实施例3中第二管反应体系在hex通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0071]
图3为实施例3中第二管反应体系在rox通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0072]
图4为实施例3中第二管反应体系在cy5通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0073]
图5为实施例3中第三管反应体系在fam通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0074]
图6为实施例3中第三管反应体系在hex通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0075]
图7为实施例3中第三管反应体系在rox通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0076]
图8为实施例3中第三管反应体系在cy5通道下的实时荧光量变化曲线图。
[0077]
图9为对比例1中第二管反应体系在fam通道下的实时荧光量变化曲线图。
具体实施方式
[0078]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0079]
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
[0080]
实施例1
[0081]
本实施例提供一种用于检测九项呼吸道病原体分子的引物探针组合，所述引物探针组合的核苷酸序列为seq id no.1～33所示的核苷酸序列。
[0082]
其中，检测副流感病毒i型、副流感病毒ii型、副流感病毒iii型和副流感病毒iv型的探针(seq id no.1)5'端采用荧光基团rox修饰，3'端采用mgb基团修饰；
[0083]
同时，检测人博卡病毒的探针(seq id no.33)和偏肺病毒的探针(seq id no.30)的5'端也采用荧光基团rox修饰，但其3'端采用bhq2团修饰；
[0084]
检测呼吸道合胞病毒(seq id no.18)、乙型流感病毒(seq id no.15)和甲型流感病毒(seq id no.12)的探针5'端采用荧光基团fam修饰，3'端采用bhq1基团修饰；
[0085]
检测肺炎支原体(seq id no.21)、腺病毒(seq id no.24)和人鼻病毒(seq id no.27)的探针5'端采用荧光基团hex修饰，3'端采用bhq1基团修饰；
[0086]
具体如表4所示：
[0087]
表4
[0088][0089]
实施例2
[0090]
本实施例提供一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒，所述检测试剂盒包含实施例1中提供的引物探针组合。
[0091]
所述检测试剂盒还包括：检测内参基因actin的引物对和探针；
[0092]
actb
‑
f(seq id no.34)：tgcgttacaccctttcttg；
[0093]
actb
‑
r(seq id no.35)：ccttcaccgttccagtttt；
[0094]
actb
‑
p(seq id no.36)：
[0095]
5'
‑
cy5
‑
atgccaatctcatcttgttttctgcgc
‑
bhq2
‑
3'。
[0096]
其中，检测呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和人博卡病毒的引物对和探针混合制得第一引物探针溶液；检测乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒的引物对和探针混合制得第二引物探针溶液；检测甲型流感病毒、人鼻病毒和偏肺病毒的引物对和探针混合制得第三引物探针溶液；
[0097]
并且，所述引物探针溶液中均包含检测内参基因actin的引物对和探针；
[0098]
各探针溶液中各条引物探针的摩尔浓度为400nmol/l；
[0099]
具体如表5所示：
[0100]
表5
[0101][0102]
所述检测试剂盒还包括酶混合液、核酸扩增反应液、阴性质控和阳性质控。所述酶混合液包括dna聚合酶、udg酶、逆转录酶、200mm海藻糖、10mm dtt和250mm tris
‑
hcl(ph 8.3)；
[0103]
所述核酸扩增反应液包含：rt
‑
pcr缓冲液、rna酶抑制剂、dutps和oligo(dt)20；其中，rt
‑
pcr反应缓冲液包含250mm tris
‑
hcl(ph 8.3)，375mm kcl，15mm mgcl2。
[0104]
实施例3
[0105]
本实施例提供一种利用九项呼吸道病原体分子检测试剂盒检测咽拭子或肺泡灌洗液样本中病原体分子存在情况的方法。
[0106]
具体步骤如下：
[0107]
1)分别取出酶混合液、核酸扩增反应液、引物探针溶液、阴性质控、阳性质控，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
[0108]
2)配制反应液并放在pcr反应管中，每个pcr反应管中20μl；
[0109]
3)提取核酸；
[0110]
4)加样，在步骤2配制的反应液中分别加入待测样本、阳性质控和阴性质控核酸各5μl，盖紧管盖，瞬间离心。
[0111]
反应体系如表6所示：
[0112]
表6
[0113]
名称体积(μl)核酸扩增反应液12.5酶混合液2.7引物探针溶液4.8模板5总体积25
[0114]
pcr反应程序如表7所示：
[0115]
表7
[0116][0117]
将3管反应溶液置于实时荧光pcr仪中，在不同波长下检测反应体系的荧光强度，不同通道与病毒种类的对应关系如下表8所示：
[0118]
表8
[0119][0120][0121]
结果判断：在阴性质控和阳性质控在控的条件下，按照表9所示的方式进行结果判断：
[0122]
表9
[0123][0124]
在检测一具体样本的过程中，第一管、第二管和第三管反应体系均检测得到正常的荧光量变化曲线；
[0125]
其中，所得第二管反应体系在fam、hex、rox和cy5通道下的扩增曲线如图1～图4所
示；
[0126]
所得第三管反应体系在fam、hex、rox和cy5通道下的扩增曲线如图5～图8所示；
[0127]
由图1～图8可知，在上述反应体系中均实现了正常扩增。
[0128]
对比例1
[0129]
本对比例中，将引物探针的分管打乱，将甲型流感病毒与乙型流感病毒的检测引物和探针对调；
[0130]
其中，检测后，第二管fam通道下的扩增曲线如图9所示，扩增曲线出现异常；
[0131]
说明本发明中，所述分管方式可以避免扩增反应时引物之间相互干扰，若不按照此方式进行分管，会导致某些基因扩增失败，进而导致检测准确度的下降。
[0132]
对比例2
[0133]
本对比例采用未优化的酶混合液进行反应。
[0134]
使用正常人群的咽拭子提取到的rna作为待测样本，一份用未添加海藻糖和dtt的pcr反应体系作为对照，另一份用添加海藻糖和dtt的pcr反应体系(即实施例2中提供的酶混合液)检测作为实验组。
[0135]
所得结果如下表10所示：
[0136]
表10
[0137][0138]
由上表可知，本发明提供的含有海藻糖和dtt的酶混合液显著提高酶的稳定性，能够适应长期海外运输的要求。
[0139]
综上所述，本发明提供的一种同时检测九种病原体的分子检测试剂盒，能够实现多种病原体靶核酸的多重实时荧光pcr检测，靶标病毒种类较多，亚型较多，且操作简单，检测准确，灵敏度高。
[0140]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。