一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备γ-氨基丁酸产品中的应用的制作方法

一种高产
γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备
γ-氨基丁酸产品中的应用
技术领域
1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备γ-氨基丁酸产品中的应用。


背景技术：

2.γ-氨基丁酸是国家卫生部批准的新资源食品。γ-氨基丁酸能通过抑制血管紧张素肽转换酶来降低血压；γ-氨基丁酸能够抑制谷氨酸的脱梭反应，促使更多的谷氨酸与氨结合生成尿素排出体外，达到健肝利肾的功能；γ-氨基丁酸可以抑制神经诱导的气道平滑肌收缩、微血管渗漏及过敏反应，从而控制哮喘；γ-氨基丁酸作为一种抑制性神经递质参与激素的分泌调节，促进生长激素、促肾上腺皮质激素、糖皮质激素以及促性腺素的释放；γ-氨基丁酸能够促进大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能，达到镇静安神，增强记忆的功能；γ-氨基丁酸能促进胰腺中胰岛素的分泌，有效地预防糖尿病；γ-氨基丁酸能促进酒精代谢，预防肥胖，防止动脉硬化，调节心律失常以及防止皮肤老化的作用；γ-氨基丁酸还能应用于尿毒症以及co中毒的治疗药物。现今，富含gaba食品的开发已经成为一个研究的热点，应用前景十分广泛。
3.康普茶是一种传统的自然发酵饮料，它是由酵母菌联合醋酸菌等微生物发酵茶糖水而制成。康普茶中含有部分茶叶的浸出物、活性微生物及其代谢产物，是一种具有多种营养保健功能的发酵饮料。主要功能营养成分包括茶多酚、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、咖啡因、糖类、有机酸、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、醋酸、乳酸和柠檬酸等，并含有多种对人体有益的微生物，能调节人体生理机能，提高人体免疫力，调理肠胃，消除疲劳，促进新陈代谢，增强人体生命力，是一种极具开发潜力的天然健康饮料。
4.利用高产γ-氨基丁酸的酵母菌联合醋酸菌发酵茶糖水制备富含γ-氨基丁酸的康普茶饮料，饮料中既含有康普茶中的功能因营养物质，又富含γ-氨基丁酸，增加了营养保健功能，是一种老少皆宜的保健饮料，具有广阔的发展空间和巨大的市场需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种酿酒酵母菌，经分离纯化和诱变育种得到一株高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌菌株，所述酿酒酵母菌的分类命名为酿酒酵母菌saccharomyces cerevisiae clnj1，已于2021年9月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.23423。
6.本发明另一目的在于提供一种酿酒酵母菌菌株clnj制备γ-氨基丁酸的应用，将所述酿酒酵母菌菌株clnj在培养基中发酵，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量为5.6g/l以上。
7.在一优选的实施方式中，所述培养基成分为蛋白胨18-22g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖18-22g/l，所述发酵条件为28-32℃，振荡培养24-48h；
8.更优选的，所述培养基成分为蛋白胨20g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l，所述发
酵条件为30℃，振荡培养36h。
9.在一优选的实施方式中，所述培养基成分中还包括8-12g/l茶叶粉，同等发酵条件下，γ-氨基丁酸产量高达8.7g/l以上，相比于不添加茶叶粉的培养基，γ-氨基丁酸产量增加11-55％；
10.优选的，培养基成分中还包括10g/l茶叶粉，更优选的，培养基成分中10g/l茶叶粉为乌龙茶茶叶粉。
11.本发明另一目的在于提供一种酿酒酵母菌菌株clnj制备高产γ-氨基丁酸产品中的应用。
12.在一优选的实施方式中，将酿酒酵母菌菌株clnj制备发酵饮品。
13.更优选的，利用醋酸菌和所述酿酒酵母菌clnj制备富含γ-氨基丁酸的康普茶。
14.本发明另一目的在于提供一种富含γ-氨基丁酸的康普茶的制备方法，具体包括以下步骤：
15.(1)制备发酵基液：取茶叶沸水冲泡，收集冲泡后的茶水，待茶水降温至60℃放入碳源，充分溶解后即为发酵基液；
16.(2)菌种培养：选取适宜的培养基分别培养得到木葡糖酸醋杆菌菌液和酿酒酵母菌菌株clnj1菌液，备用；
17.(3)制备发酵饮品：将步骤(2)中的菌液以步骤(1)发酵基液的8-12wt％设定接种量，接种到发酵基液中，发酵培养，得到发酵原液；
18.其中，接种菌液中，木葡糖酸醋杆菌菌液和酿酒酵母菌菌株clnj1菌液的质量比为(0.1-10)：1；
19.(4)食品助剂调配：在发酵原液中根据口味需求加入可接受的食品助剂进行调配，即得富含γ-氨基丁酸的康普茶。
20.在一优选的实施方式中，步骤(1)中，所述茶叶包括红茶、黑茶、乌龙茶、白茶、绿茶等任意一种或多种茶叶品种；
21.所述沸水冲泡次数为2-4次，每次冲泡，茶叶与沸水的质量比为1:(100-500)；更优选的，茶叶与沸水的质量比为1:100；
22.所述碳源包括白砂糖或蔗糖；
23.所述碳源与茶水的质量比1:(8-12)，更优选的，碳源与茶水的质量比1:10。
24.在一优选的实施方式中，步骤(2)中，培养所述木葡糖酸醋杆菌的培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖20-30g/l、大豆蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、磷酸氢二钠3-8g/l、柠檬酸铵0.3-0.8g/l、硫酸镁0.1-0.3g/l，ph4.5-5.5，121℃，灭菌20min；
25.优选的，培养所述木葡糖酸醋杆菌的培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖25g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、磷酸氢二钠5g/l、柠檬酸0.5g/l、硫酸镁0.2g/l，ph5.0，121℃，灭菌20min备用；
26.培养所述木葡糖酸醋杆菌的发酵条件包括：于28-32℃振荡培养，控制转速120-180转/min，培养36-60h；优选为，于30℃温度条件下，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
27.在一优选的实施方式中，培养所述酿酒酵母菌菌株clnj1菌的培养基包括以下质量含量的组分：蛋白胨8-12g和酵母浸粉8-12g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min，得到900ml培养基备用；葡萄糖18-22g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后，加入到前述900ml
培养基中，备用；
28.优选的，培养所述酿酒酵母菌菌株clnj1菌的培养基包括以下质量含量的组分：蛋白胨10g和酵母浸粉10g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min，得到900ml培养基备用；葡萄糖20g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后，加入到前述900ml培养基中，备用；
29.培养所述酿酒酵母菌菌株clnj1菌的发酵条件包括：于28-32℃振荡培养，控制转速120-180转/min，培养24-48h；优选为，于30℃温度条件下，振荡培养，转速150转/min，培养36h。
30.在一优选的实施方式中，步骤(3)中，将步骤(2)中的菌液以步骤(1)发酵基液的10wt％设定接种量，接种到发酵基液中，发酵培养，得到发酵原液；
31.接种菌液中，木葡糖酸醋杆菌菌液和酿酒酵母菌菌株clnj1菌液的质量比为1：1；
32.所述发酵培养条件为：于26-30℃条件下，进行静置发酵6-14天。
33.在一优选的实施方式中，步骤(4)中，所述可接受的食品助剂包括果汁、蜂蜜、果胶、蔗糖和/或柠檬酸等可以调节口味的食品助剂，助剂种类和助剂的添加量根据口味需求进行调节。
34.在一优选的实施方式中，得到富含γ-氨基丁酸的康普茶后，还包括利用均质机均质、灭菌灌装等步骤。
35.与现有技术相比，根据本发明的一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备γ-氨基丁酸产品中的应用，具有如下优点：
36.1)本发明提供一种酿酒酵母菌clnj1，具有高产γ-氨基丁酸的特点，经实际验证，γ-氨基丁酸产量稳定在5.6g/l以上，显著高于常见的酿酒酵母菌γ-氨基丁酸产量。且诱变菌株遗传性质稳定，经10次进行传代遗传稳定性比较，对菌株产γ-氨基丁酸的能力进行测定，没有出现回复突变的问题，
37.2)本发明提供一种酿酒酵母菌clnj1，与醋酸菌和酵母菌联合发酵制备富含γ-氨基丁酸的康普茶，节约成本，减少酿酒酵母菌的培养基成分，制备工艺简单，尤其适合大规模工业化生产。制备出来的康普茶营养价值高，含有茶多酚、d-葡萄糖二酸-1、4内酯、葡萄糖醛酸、咖啡因和维生素等多种营养物质，又富含γ-氨基丁酸，增加了饮品的营养保健功能，具有广阔的市场需求和经济效益。
38.3)本发明利用酿酒酵母clnj1和醋酸菌制备的富含γ-氨基丁酸的康普茶，其中γ-氨基丁酸含量为280mg/l，而现有技术中，采用醋酸菌和市售的酿酒酵母菌制备的康普茶中，不含γ-氨基丁酸；采用醋酸菌、酿酒酵母和植物乳杆菌联合发酵的康普茶中的γ-氨基丁酸含量仅为78mg/l。说明本发明在减少原料用量的条件下，还提升了产品的营养价值，具有降本增效的有益效果。
附图说明
39.从下面结合附图对本发明实施例的详细描述中，本发明的这些和/或其它方面和优点将变得更加清楚并更容易理解，其中：
40.图1为本发明实施例酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)菌株clnj1系统发育树；
41.图2为本发明实施例酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)菌株clnj1的诱变
前后菌落形态图，左侧为诱变前菌落形态，右侧为诱变后菌落形态；
42.图3为本发明实施例酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)菌株clnj1的菌体显微镜形态图。
具体实施方式
43.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
44.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
45.实施例1酵母菌株的选育鉴定
46.1)培养基配制
47.ypd培养基：蛋白胨20g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖20g/l；
48.若为ypd固体培养基，则在ypd培养基的基础上，添加20g/l琼脂粉。
49.2)菌株分离纯化
50.将实验室自酿葡萄酒混匀后稀释，得到不同浓度的稀释液，涂到ypd固体培养基中，在30℃的培养箱中培养2-3天。之后挑取在培养基上形成的单独菌落，在ypd固体培养基平板上反复划线纯化，得到纯的菌株菌落，将其分别转移至ypd固体斜面培养基上，做好标记，于30℃静置培养1天后，放在4℃的冰箱中保藏，每2周转接一次，备用。将分离纯化的菌株接入ypd液体培养基中，放入30℃的培养箱中振荡培养36h进行发酵实验，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量为1.65g/l。
51.3)菌株诱变育种
52.将筛选出的酵母菌株(出发菌株)在ypd液体培养基30℃振荡培养24h进行活化，配制添加氯化锂ypd液体培养基，将活化好的酵母菌株转接至不同浓度的氯化锂ypd液体培养基中，30℃振荡培养24h，之后将酵母菌悬液涂在ypd固体平板培养基上，以没有经过氯化锂诱变的菌悬液涂平板作对照。
53.诱变育种后的菌株接入ypd液体培养基中，放入30℃的培养箱中，转速150转/min，振荡培养36h，进行发酵实验，检测发酵液中γ-氨基丁酸含量为5.64g/l。将出发菌株和诱变菌株分别转接10次进行传代遗传稳定性比较，对菌株产γ-氨基丁酸的能力进行测定，结果表明诱变菌株稳定，没有出现回复突变的问题，γ-氨基丁酸产量稳定在5.6g/l，诱变菌株命名为clnj1，已于2021年9月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.23423。菌株保存于60％甘油管中，于零下80℃保存备用。
54.4)菌株鉴定
55.4.1菌落菌株形态
56.该菌株的形态学以及生理生化鉴定参照《真菌鉴定手册》进行。
57.经形态鉴定及生物学特性研究，所述酿酒酵母菌在ypd固体培养基中与30℃培养48h后，菌落为乳白色，大而厚，表面光滑、湿润、粘稠，菌落质地均匀，颜色均一，显微镜下观察菌体为卵圆形。菌落形态和菌体形态如图2和图3所示。
58.4.2分子鉴定
59.经分子鉴定，按26s rdna序列分析法鉴定是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。2021年9月16日中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号cgmcc 23423,保藏地址为北京市。
60.实施例2发酵培养基中添加茶叶粉对酿酒酵母菌株clnj1的γ-氨基丁酸产量的影响
61.培养基和培养条件：蛋白胨10g、酵母浸粉10g和茶叶粉10g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min备用；将葡萄糖20g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后加入上面900ml培养基中，备用。
62.接种酿酒酵母菌株clnj1在培养基中，30℃，振荡培养，转速150转/min，培养36h。
63.其中，茶叶粉选自红茶、黑茶、乌龙茶、白茶、绿茶中的一种。
64.测定发酵液中γ-氨基丁酸含量，结果如表1所示：
65.表1培养基添加不同茶叶粉菌株clnj1产γ-氨基丁酸含量
[0066] 红茶黑茶乌龙茶白茶绿茶γ-氨基丁酸(g/l)7.36.58.78.16.2
[0067]
实施例3利用醋酸菌和酿酒酵母菌株clnj1制备康普茶
[0068]
1、康普茶发酵基液制作
[0069]
将市售的乌龙茶用沸水冲泡三次，每次茶水冲泡比例1：100，冲泡后的茶水放入消毒后的玻璃容器中，待茶水温度降至60℃，放入白砂糖，白砂糖与茶水按质量比1:10添加，溶解后的茶糖水为康普茶饮料发酵基液。
[0070]
2、康普茶菌种培养
[0071]
利用木葡糖醋杆菌和酿酒酵母菌株clnj1发酵。
[0072]
木葡糖醋杆菌培养基和培养条件：葡萄糖25g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、磷酸氢二钠5g/l、柠檬酸0.5g/l、硫酸镁0.2g/l，ph5.0，121℃，灭菌20min备用；30℃，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
[0073]
酿酒酵母菌菌株clnj1培养基和培养条件：蛋白胨10g和酵母浸粉10g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min备用；葡萄糖20g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后加入上面900ml培养基中，备用；30℃，振荡培养，转速150转/min，培养36h。
[0074]
3、康普茶发酵饮料制作
[0075]
将木葡糖醋杆菌和clnj1菌株的发酵菌液按照1；1比例添加到康普茶发酵基液，均匀后倒入玻璃容器中，获得康普茶发酵液。在30℃下，静止培养10天，获得康普茶发酵原液。发酵原液中加入果汁、蜂蜜、蔗糖和柠檬酸等调配口味，调配后的发酵液利用均质机均质后灭菌灌装，获得性状稳定，口味适宜的康普茶发酵饮料。
[0076]
检测康普茶中γ-氨基丁酸及含量，结果表明：实施例3中的康普茶γ-氨基丁酸含量为280mg/l。
[0077]
对比例1利用醋酸菌和酿酒酵母(市售)制备康普茶
[0078]
1、康普茶发酵基液制作
[0079]
将市售的乌龙茶用沸水冲泡三次，每次茶水冲泡比例1：100，冲泡后的茶水放入消毒后的玻璃容器中，待茶水温度降至60℃，放入白砂糖，白砂糖与茶水按质量比1:10添加，溶解后的茶糖水为康普茶饮料发酵基液。
[0080]
2、康普茶菌种培养
[0081]
利用木葡糖醋杆菌和酿酒酵母(市售)发酵。
[0082]
木葡糖醋杆菌培养基和培养条件：葡萄糖25g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、磷酸氢二钠5g/l、柠檬酸0.5g/l、硫酸镁0.2g/l，ph5.0，121℃，灭菌20min备用；30℃，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
[0083]
酿酒酵母培养基和培养条件：蛋白胨10g和酵母浸粉10g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min备用；葡萄糖20g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后加入上面900ml培养基中，备用。30℃，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
[0084]
3、康普茶发酵饮料制作
[0085]
将木葡糖醋杆菌和酵母菌(市售)比例添加到康普茶发酵基液，均匀后倒入玻璃容器中，获得康普茶发酵液。在30℃下，静止培养10天，获得康普茶发酵原液。发酵原液中加入果汁、蜂蜜、蔗糖和柠檬酸等调配口味，调配后的发酵液利用均质机均质后灭菌灌装，获得性状稳定，口味适宜的康普茶发酵饮料。
[0086]
检测康普茶中γ-氨基丁酸及含量，结果表明：对比例1中的康普茶中不含γ-氨基丁酸。
[0087]
对比例2利用醋酸菌、酿酒酵母(市售)和植物乳杆菌制备康普茶
[0088]
1康普茶发酵基液制作
[0089]
将市售的乌龙茶用沸水冲泡三次，每次茶水冲泡比例1：100，冲泡后的茶水放入消毒后的玻璃容器中，待茶水温度降至60℃，放入白砂糖，白砂糖与茶水按质量比1:10添加，溶解后的茶糖水为康普茶饮料发酵基液。
[0090]
2康普茶菌种培养
[0091]
利用木葡糖醋杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌发酵。
[0092]
木葡糖醋杆菌培养基和培养条件：葡萄糖25g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、磷酸氢二钠5g/l、柠檬酸0.5g/l、硫酸镁0.2g/l，ph5.0，121℃，灭菌20min备用；30℃，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
[0093]
酿酒酵母培养基和培养条件：蛋白胨10g和酵母浸粉10g溶解于900ml水中，121℃灭菌20min备用；葡萄糖20g溶解于100ml水中，115℃灭菌15min后加入上面900ml培养基中，备用；30℃，振荡培养，转速150转/min，培养48h。
[0094]
植物乳杆菌培养基和培养条件：葡萄糖10g/l、酪蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母浸粉5g/l、乙酸钠5g/l、吐温-80 10ml、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.05g/l，ph6.8，121℃，灭菌20min备用，37℃，静止培养48h。
[0095]
3、康普茶发酵饮料制作
[0096]
将木葡糖醋杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌发酵菌液按照1：1：1比例添加到康普茶发酵基液，均匀后倒入玻璃容器中，获得康普茶发酵液。在30℃下，静止培养10天，获得康普茶发酵原液。发酵原液中加入果汁、蜂蜜、蔗糖和柠檬酸等调配口味，调配后的发酵液利用均质机均质后灭菌灌装，获得性状稳定，口味适宜的康普茶发酵饮料。
[0097]
检测康普茶中γ-氨基丁酸及含量，结果表明：对比例2中的康普茶中γ-氨基丁酸含量为78mg/l。
[0098]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述
并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。