基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法与流程

1.本发明涉及生物医学传感器领域，特别涉及一种基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法。


背景技术：

2.随着精准医学概念的提出，精准医学已经逐渐被人们接受，肿瘤便是精准医学首要解决任务之一。近年来，液体活检正迅速成为标准肿瘤活检的重要微创手段。其中循环肿瘤dna(ctdna)已成为肿瘤标志物之一并受到广泛关注。ctdna不仅是诊断的标志物，而且对临床治疗效果和肿瘤转移的评估也至关重要。开发新的ctdna检测方法在临床应用中具有重要意义。
3.crispr-cas系统是细菌抵御外来核酸入侵的适应性免疫系统，因为使用方便、构建简单，crispr被认为是遗传研究领域的革命性技术。crispr-cas12a(cpf1)蛋白质是rna引导的酶，与crispr/cas9蛋白不同，cas12a核酸内切酶只需要crrna(crispr-derived rnas)，而不需要tracrrna(trans-activating crrna)作为它们的向导。cas12a蛋白可通过特定的crrna特异性地切割双链dna(dsdna)或单链dna(ssdna)。此外，cas12a蛋白与crrna互补的dsdna或ssdna结合后也能产生单链dna酶活性。因此，非特异性ssdna可被cas12a/crrna/靶dna三元复合物降解，这种切割的活性被称为反式切割。
4.dai等报道了一种基于crispr-cas12a(cpf1)的电化学生物传感器(e-crispr)，用电化学方法探讨了cas12a对非特异性ssdna的顺式切割引发的反式切割效应。设计了一个带有亚甲基蓝(mb)为电化学标记信号的非特异性ssdna，另一端通过巯基部分栓系在传感器表面以获得电信号。在靶的存在下，cas12a反式切割活性被激活，将mb-ssdna从电极表面分离，从而减少mb信号的传递,降低电化学信号；在没有靶点的情况下，cas12a反式切割活性被沉默，在表面保留mb-ssdna(y.dai,r.a.somoza,l.wang,j.f.welter,y.li,a.i.caplan and c.c.liu,angew chem int ed engl 2019)。该方案通过crispr-cas12a(cpf1)与电化学相结合进行信号转导，但其并未实现信号的放大，故其存在检测灵敏度和精度的不足。
5.所以，现在需要一种更可靠的方案。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法，该方法包括crispr-cas蛋白酶切体系和杂交链式反应(hcr)体系；主要步骤为：先将待检测样品、crispr-cas蛋白、crrna和引发剂混合，孵育，得到酶切溶液a，其中crispr-cas为cas12、cas13、cas9或cas14蛋白；之后采用(1)或者(2)的处理方式：
8.(1)向酶切溶液a中加入磁珠反应，反应后分离取出磁珠，洗涤后再与探针发夹核
酸(dna链或rna链)混合，孵育；最后将反应后的磁珠分离取出；
9.(2)向酶切溶液a中加入探针发夹核酸(dna链或rna链)混合，孵育；之后加入磁珠，最后将反应后的磁珠分离取出；
10.洗涤分离后磁珠溶液通过流式细胞术检测荧光，分析出待检测样品中的待检测的核酸靶标的种类和浓度。其中，在没有核酸靶标的情况下，crispr-cas蛋白反式切割活性被沉默，引发剂被保留，引发剂与磁珠相结合，通过引发剂触发hcr反应，使修饰有标记物的发夹核酸结合到磁珠表面，使得磁珠的荧光增强；
11.在有核酸靶标的情况下，crispr-cas蛋白与crrna形成的cas-crrna二元复合物特异性与核酸靶标结合，激活crispr-cas蛋白的反式切割活性，使引发剂被裂解从而不能触发hcr反应，使修饰有标记物的发夹核酸无法结合到磁珠表面，不会使磁珠的荧光增强；从而通过建立待检测的核酸靶标的浓度与反应后的磁珠的荧光强度之间的关系，利用流式细胞术检测反应后的磁珠的荧光强度结果可计算出核酸靶标的浓度，实现核酸靶标的检测。
12.本发明的方法可在短时间内高效识别靶标，具有高特异性、高灵敏度等优点。
13.其中，引发剂为核酸链，即：dna链或rna链；其与磁珠的结合方式包括：共价结合、静电吸附、抗原与抗体结合、适体与配体、酶与底物结合。
14.优选的是，其中，引发剂与磁珠的结合方式为：生物素与链霉亲和素结合，或抗原与抗体结合，或巯基与金结合，或氨基与羧基缩合。
15.优选的是，所述发夹核酸包括发夹h1和发夹h2，发夹h1和/或发夹h2上修饰有标记物。
16.优选的是，所述标记物为量子点或荧光基团。
17.优选的是，其中，将待检测样品、crispr-cas蛋白、crrna和引发剂混合时，向该反应体系中添加rnase抑制剂。
18.优选的是，孵育温度为-10℃～100℃。更为优选的是，孵育温度为32～40℃。
19.优选的是，其孵育时间为0～24小时，更为优选的是，孵育时间为0.5～2.5小时。
20.优选的是，所述crrna的序列可以与核酸靶标的部分序列互补配对。
21.杂交链式反应(hcr)体系中，引发剂，发夹环h1/h2设计原则为：h1包括a，b，c和b*四个部分，其中b和b*有18对碱基互补成双链作为h1的茎部，c为发夹结构的环部，a为在发夹结构茎部延伸出的单链粘性末端；h2包括c*，b，a*和b*四个部分。其设计和h1相似，a，b，c可分别与a*，b*，c*互补。当没有引发链(a*b*)存在时，虽然h1和h2中有部分链可以额互补，但由于h1和h2分别形成茎环，二者在溶液中均能稳定存在，不会相互杂交而彼此打开；当加入引发链a*b*时，a*b*首先与h1茎部的粘性末端ab互补，使h1的茎环结构打开，暴露出c*b*单链，打开h2的发夹结构，接着暴露出于与h1互补的a*b*，可以继续打开h1，依次循环往复。h1和h2在引发链引导杂交反应后，陆续打开发夹h1和h2，形成由h1和h2交替杂交形成的长链带缺口的双链dna聚合物(参照图7)。
22.在一种更为优选的方案中，所述crrna的序列为：
[0023]5’‑
uaauuucuacuaaguguagaugcaugagcugcaugaugagcu g-3’。在crispr/cas12a系统中，形成茎环结构的直接重复序列为“uaauuucuacuaaguguagau”，间隔序列与检测序列互补。crrna的间隔序列与target序列互补；
[0024]
所述核酸靶标的序列为：
[0025]5’‑
ctccaccgtgcagctcatcatgcagctcatgcccttcg-3’；
[0026]
所述引发剂的序列为：
[0027]5’‑
agtctaggattcggcgtgggttaatttttt-3’，所述引发剂的3’端标记有生物素；
[0028]
所述发夹dna h1的序列为：
[0029]5’‑
ttaacccacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtg-3’，所述发夹dna h1的5’端修饰有标记物fam；
[0030]
所述发夹dna h2的序列为：
[0031]5’‑
agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaatcctagactactttg-3’。
[0032]
本发明的有益效果是：本发明结合crispr-cas12a、hcr(杂交链式反应)和流式细胞术构建了一种快速检测dna的方法，可在短时间内高效识别靶标，具有高特异性、高灵敏度等优点，检测限低至2pm，有望成为生物医学研究和临床诊断的有力检测手段。
附图说明
[0033]
图1为本发明的基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法的原理图；
[0034]
图2为实施例2中的crispr-cas反式切割活性验证结果；
[0035]
图3为实施例3中的hcr(杂交链式反应)体系可行性验证结果；
[0036]
图4为实施例4中的反应体系可行性验证结果；
[0037]
图5为实施例5中的反应体系检测灵敏度评估结果；
[0038]
图6为实施例6中的反应体系检测选择性和特异性评估结果；
[0039]
图7为本发明中的hcr体系的序列设计原则。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0041]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0042]
本实施例的一种基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法，该方法包括crispr-cas蛋白酶切体系和杂交链式反应(hcr)体系；主要步骤为：先将待检测样品、crispr-cas蛋白、crrna和引发剂混合，孵育，得到酶切溶液a，其中crispr-cas为cas12、cas13、cas9或cas14蛋白；之后采用(1)或者(2)的处理方式：
[0043]
(1)向酶切溶液a中加入磁珠反应，反应后分离取出磁珠，洗涤后再与探针发夹dna混合，孵育；最后将反应后的磁珠分离取出；
[0044]
(2)向酶切溶液a中加入探针发夹dna混合，孵育；之后加入磁珠，最后将反应后的磁珠分离取出；
[0045]
洗涤分离后磁珠溶液通过流式细胞术检测荧光，分析出待检测样品中的待检测的核酸靶标的种类和浓度。
[0046]
其中，在没有核酸靶标的情况下，crispr-cas蛋白反式切割活性被沉默，引发剂被保留，引发剂与磁珠相结合，通过引发剂触发hcr反应，使修饰有标记物的发夹dna结合到磁珠表面，使得磁珠的荧光增强；
[0047]
在有核酸靶标的情况下，crispr-cas蛋白与crrna形成的cas-crrna二元复合物特异性与核酸靶标结合，激活crispr-cas蛋白的反式切割活性，使引发剂被裂解从而不能触发hcr反应，使修饰有标记物的发夹dna无法结合到磁珠表面，不会使磁珠的荧光增强；从而通过建立待检测的核酸靶标的浓度与反应后的磁珠的荧光强度之间的关系，利用流式细胞术检测反应后的磁珠的荧光强度结果可计算出核酸靶标的浓度，实现核酸靶标的检测。
[0048]
本发明结合crispr-cas、hcr(杂交链式反应)和流式细胞术构建了快速检测dna的方法，可在短时间内高效识别靶标，具有高特异性、高灵敏度等优点。
[0049]
在优选的实施例中，所述crrna由一个茎环结构的直接重复序列和一个与核酸靶标的部分序列互补的间隔序列组成，crrna中的t被u取代。
[0050]
在优选的实施例中，所述发夹dna包括发夹dna h1和发夹dna h2，发夹dna h1和/或发夹dna h2上修饰有标记物。进一步优选的实施例中，标记物为量子点或荧光基团，荧光基团包括但不限于：fam、cy3、tamra、cy5。
[0051]
在优选的实施例中，发夹dna与磁珠的结合方式包括但不限于以下几种：共价结合、静电吸附、抗原与抗体结合、适体与配体、酶与底物结合；其中，优选生物素与链霉亲和素，或抗原与抗体，或巯基与金，或氨基与羧基缩合等。。进一步优选的实施例中，所述发夹dna与磁珠通过生物素与链霉亲和素结合，所述磁珠上修饰有链霉亲和素，所述引发剂的3'末端标记有生物素。
[0052]
以下提供更为具体的实施例，以对本发明做进一步说明。
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例中，所有的核酸均由上海生工合成和纯化。反应缓冲液(pbs缓冲液)也购自上海生工。cas蛋白酶购自美国纽英伦生物技术neb，rnase抑制剂购自中国大连takara生物技术有限公司，1x neb缓冲液2.1(含10mm镁离子)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，mgso4和链霉亲和素-磁珠获自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他化学品为分析级，无需进一步纯化即可使用。所有试剂均为分析级，无需进一步纯化。所有的核酸序列合成由生工(生工生物工程(上海)股份有限公司)提供，纯化方法为hplc。所有溶液的配置均使用超纯水(电阻率＞18.2mω
·
cm)。所有核酸序列如表1所示。
[0055]
表1
[0056]
[0057][0058]
一、核酸、蛋白预处理：
[0059]
核酸溶液母液配置：
①
将引发剂dna粉末(简称initiator)、核酸靶标dna(简称为靶标或target)粉末4000rpm:30s～60s离心，加入1x neb缓冲液2.1(含10mm镁离子)溶解至10μm备用。
②
将发夹dna h1(简称h1)、dna h2(简称h2)粉末4000rpm:30s～60s离心，加入10mm pbs缓冲液溶解至10μm备用。
[0060]
蛋白溶液母液配置：将crispr-cas12a蛋白(简称cas12a)溶液(100μm)加入1x neb缓冲液2.1(含10mm镁离子)稀释至1μm备用。
[0061]
发夹环形成：将含有发夹dna h1(简称h1)、发夹dna h2(简称h2)序列的溶液分别在95℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温以退火形成发夹环结构。
[0062]
二、一种基于基因编辑和流式分析技术的核酸检测方法，该方法包括以下步骤：
[0063]
1)将target、50nm cas12a蛋白、60nm crrna、200nm引发剂和20u rnase抑制剂混合，使用1x neb缓冲液2.1(含10mm镁离子)补足至40μl，在37℃下孵育0.5h；
[0064]
2)用10mm pbs将反应体系扩大到100μl，再加入1μl磁珠(简称为磁珠或mb)孵育(加入前洗涤三次)，进行磁珠修饰；
[0065]
3)反应后分离取出磁珠，用10mm pbs洗涤3次后再与发夹dna h1、发夹dna h2混合，37℃下共孵育2h；其中，发夹dna h1、发夹dna h2的浓度相同，体积均为50μl；
[0066]
4)将反应后的磁珠分离取出，用10mm pbs洗涤3次，并用10mm pbs稀释至300μl(磁珠最终浓度是恒定的0.1mg/ml)，通过流式细胞术检测磁珠的荧光强度；在488nm激光激励下，通过fl1(fam/fitc)通道计数10000个纳米颗粒，来计算测试的磁珠的平均荧光强度(mfi)，数据分析采用flowjo软件v10进行；最后根据荧光检测结果计算出待检测样品中的待检测的核酸靶标的浓度。
[0067]
参照图1为本发明的方法的原理图，图中biotin-initiator表示引发剂，strep mnp表示磁珠，hairpin 1和hairpin 2分别表示发夹dna h1和发夹dna h2。
[0068]
实施例2 crispr-cas反式切割活性验证
[0069]
crrna由一个直接重复序列和一个间隔序列组成。在crispr/cas12a系统中，形成茎环结构的直接重复序列为“uaauuucuacuaaguguagau”，间隔序列与检测序列互补。crrna的间隔序列与target序列互补，t被u取代。crrna序列见表1。在cripsr-cas12切割系统中，采用使用1x neb缓冲液2.1(含10mm镁离子)作为反应缓冲液。对于反式切割活性验证，将50nm cas12a；60nm crrna；不同浓度的target(0,20,40,80nm)与60nm fq标记的探针混合，用bmg-clariostar微板阅读器(bmg-labtech，uk)在480nm的激发波长和520nm的发射波长
下检测荧光信号。
[0070]
为了验证crispr-cas反式切割活性，本实施例中设计了用fq标记ssdna荧光探针(表1中的probe)，cas蛋白识别靶标，cas蛋白作为dna解旋酶，对靶dna进行顺式切割。裂解靶链后，cas12a/crrna/靶标三元复合物进一步激活crispr-cas反式切割活性，切割探针从而释放标记物，使得被猝灭的荧光恢复，溶液荧光信号增强；参照图2a，为其原理图。参照图2b为实验结果，其中，靶标浓度分别为0nm、20nm、40nm、80nm。结果表明，随着时间和靶标浓度的增加，荧光信号值的变化率显著增加，证明了crrna的成功设计和crispr-cas12a的反式切割活性。
[0071]
实施例3 hcr(杂交链式反应)体系可行性验证
[0072]
本实施例中，通过fcba和20％sds-page凝胶电泳(图3c)，采用高浓度(200nm)fam修饰的h1和h2，来验证hcr的可行性。此外，还证实了引发剂和发夹环各自的功能。将含有h1或h2序列的溶液在95℃下孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温以退火并形成发夹环。不同浓度的引发剂与相同浓度的h1和h2混合，对照组加入相同体积的pbs，37℃条件下反应2小时，反应后磁珠分离。通过流式细胞术进行测量。
[0073]
结果表明hcr反应仅在引发剂(图3中表示为initiator)存在时发生，当h1和h2共存时，磁珠表面荧光强度显著增强(图3a、3b)，这意味着形成了长的dna杂交链，说明荧光信号被有效地扩增。图3c则从分子角度证实了该策略的可行性，只有当引发剂、h1、h2同时存在时，hcr才会发生，形成特异的hcr条带。由此从分子水平上证实hcr的可行性。
[0074]
图3a为磁珠表面的荧光强度，其中标号1、2、3、4、5、6分别表示：
[0075]
1：0nminitiator 500nm h1，2：0nminitiator 500nm h1 500nm h2，3：5nminitiator 500nm h1，4：5nminitiator 500nm h1 500nm h2，5：10nminitiator 500nm h1，6：10nminitiator 500nm h1 500nm h2。
[0076]
图3b为不同浓度的引发剂和发夹环与磁珠共孵育后的流式结果；
[0077]
图3c为对反应后的dna进行sds-page电泳的结果，其中各标号具体为，1:initiator；2.:h1；3:h2；4:h1 h2；5:initiator h1 h2。initiator，h1和h2的浓度均为2μm。
[0078]
实施例4反应体系可行性验证
[0079]
crispr-cas反式切割活性验证成功和hcr反应可行性得到验证之后，本实施例中再进行整个体系的策略验证，具体步骤参照实施例1，结果如图4所示。在488nm激光激励下，通过fl1(fam/fitc)通道计数10000个纳米颗粒，来计算测试的磁珠的平均荧光强度(mfi)。在存在靶标序列的情况下，磁珠的表面上的荧光信号与不存在靶标序列下明显不同(图4b中δf表示荧光差值)，由此整个反应体系可行性得到确认。
[0080]
实施例5反应体系检测灵敏度评估
[0081]
本实施例中，选取了10pm、15pm、25pm、40pm、60pm、80pm、100pm、120pm、150pm这9个不同的靶标浓度进行实验(每个浓度重复了三次)，通过荧光分光光度计分别记录fam在520nm和tamra在580nm的相对荧光强度(if(520)/if(580))。结果如图5所示，随着靶标dna浓度的增加，相对荧光强度增加。结果表明磁珠吸光度与靶标浓度在25pm～120pm区间具有良好的线性关系，检测限为2pm；线性方程为y＝0.58692x-3.81533，其中y表示荧光差值百分比，x表示靶标浓度，线性相关系数r2为0.99。
[0082]
图5a为磁珠表面的平均荧光强度，其中的曲线为靶标浓度分别为0pm、10pm、15pm、
25pm、40pm、60pm、80pm、100pm、120pm、150pm的结果。
[0083]
图5b为靶标检测线性校准曲线，其中荧光差值百分比δf％＝(背景荧光-靶标荧光)/背景荧光。
[0084]
实施例6反应体系检测选择性和特异性评估
[0085]
本实施例中，在有/无血清情况下分别选取了25pm、50pm、100pm 3个浓度的靶标进行实验(每个浓度重复了三次)，以评估本发明的检测方法对血清的干扰能力，如图6a所示，加入血清后的实验组与不加血请的对照组相比，两者的磁珠表面的平均荧光强度相近，表明本方案对血清具有一定的抵抗性，可以抵御临床样本中血清的干扰。此外我们将不同的靶标标准溶液掺入10％的血清中来测定加样回收率，结果如表2所示：靶标的回收率在95.6-105.3％范围内。
[0086]
表2
[0087][0088]
进一步的，本实施例中分别测量和比较了单碱基错配靶序列(mt1)、双碱基错配靶序列(mtt2)、三碱基错配靶序列(mtt3)、非互补靶序列(nct)和靶标序列的磁珠表面的平均荧光强度。如图6b所示，相同浓度的mt1、mt2、mt3和nct与靶标dna(t)相比产生明显较低的荧光响应。这些结果表明本发明的方法对发生碱基突变的靶标具有识别能力，且这种能力随着突变碱基数量的增加，识别突变的能力也逐渐增强。
[0089]
本发明提出了一种新的荧光传感器的开发策略，即在流式细胞仪测定的基础上，结合crispr-cas12a、hcr来检测dna，本发明利用crispr-typev系统cas12a(cpf1)作为一种高效的生物传感系统，它通过非特异性切割引发剂来减少hcr反应，减少荧光信号，最终构建了一种具有高度敏感性、特异性和选择性的核酸检测方法，检测限低至2pm。
[0090]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。