一种在宫颈细胞样本中提取DNA的方法与流程

一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法
技术领域
1.本发明涉及医疗化验技术领域，尤其涉及一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法。


背景技术：

2.hpv病毒是导致宫颈癌产生的主要病因，99%以上的宫颈癌是由于同一高危型hpv持续感染导致，从hpv感染到癌变大约十年左右，宫颈癌是目前世界上唯一一种可早发现早预防的癌症。
3.目前临床上比较普遍的初筛方式是tct和hpv分型检测。传统的方式是一个客户先做其中一种，然后再做另外一种检测，客户需要取两次样本，耗时较长。如果同时做两种检测就需要取两次样本，但是这样有时会导致客户子宫受伤，并且发现第二次取的样本有一部分会因客户取样出血导致样本混血，血液中血红素会抑制hpv分型检测中的pcr反应，影响实验效果。
4.此外，hpv分型检测中传统的磁珠法和柱提法提取宫颈细胞样本中dna的方法和步骤比较繁琐并且效率较低成本较高。请参考图3和图4，分别是磁珠法和柱提法的流程图。
5.综上，目前市场上hpv提取方法成本高性价比高，并且tct和hpv检测两种方法的样本不能兼容，需要多次取样。此外，hpv检测的主要步骤就是提取样本中的dna，因此，本发明通过发明一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法，可实现只取tct样本，并且用tct样本做hpv检测中提取dna的步骤；同时，也可以针对hpv保存液做hpv检测中提取dna的步骤，成本低，步骤简单。


技术实现要素：

6.本发明提供一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法，能解决现有技术中的一系列问题。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法，包括：（1）配置细胞核裂解液，所述细胞核裂解液成分：氯化钠、乙基苯基聚乙二醇、盐酸胍、1mol/l的tris-hcl溶液、0.1mol/l的乙二胺四乙酸溶液；（2）用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节所述细胞核裂解液的ph至9.5，得到缓冲液；（3）准备好待提取的第一样本300ul，放入ep管中并用离心机，在1400r/min的转速下离心5分钟，去上清，得到第二样本；（4）在所述第二样本中加入300ul所述缓冲液，放入离心机，在1400r/min的转速下离心5分钟，去上清，得到第三样本；（5）在所述第三样本中再次加入所述缓冲液50ul，得到第四样本；（6）在所述第四样本中加入10ul蛋白酶k溶液和2ul二硫苏糖醇溶液，所述蛋白酶k溶液浓度为13mg/ml,所述二硫苏糖醇溶液浓度为0.375g/ml，得到第五样本；（7）将所述第五样本放入聚合酶的链式反应设备，进行反应。
8.进一步地，在将所述第五样本放入聚合酶的链式反应设备，进行反应之后，将得到的反应物进行电泳检测。
9.进一步地，所述配置细胞核裂解液具体包括：取1l蒸馏水，加入氯化钠0.785g、乙
基苯基聚乙二醇0.4ml、盐酸胍0.785g、1mol/l的tris-hcl溶液12ml、0.1mol/l的乙二胺四乙酸溶液14ml,搅拌均匀。
10.本发明的有益效果如下：本发明通过发明一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法，可实现只取tct样本，并且用tct样本做hpv检测中提取dna的步骤；同时，也可以针对hpv保存液做hpv检测中提取dna的步骤，相对于市场上医院和体检中心tct细胞学一个样本，hpv分型检测一个样本，本发明可以减少取样次数增加客户体验度，简化流程，用一个tct样本即可，并且成本低，步骤简单。
附图说明
11.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
12.图1是一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法的流程图。
13.图2是ngs技术流程图。
14.图3是磁珠法简易流程图。
15.图4是柱提法简易流程图。
16.图5是电泳胶图1。
17.图6是电泳胶图2。
18.具体实施方式
19.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.请参考图1，本发明提供了一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法，包括：（1）配置细胞核裂解液，所述细胞核裂解液成分：氯化钠、乙基苯基聚乙二醇、盐酸胍、1mol/l的tris-hcl溶液、0.1mol/l的乙二胺四乙酸溶液；所述配置细胞核裂解液具体包括：取1l蒸馏水，加入氯化钠0.785g、乙基苯基聚乙二醇0.4ml、盐酸胍0.785g、1mol/l的tris-hcl溶液12ml、0.1mol/l的乙二胺四乙酸溶液14ml,搅拌均匀。此处，加入所述氯化钠可以使得所述裂解液中盐离子增加，从而可以增加细胞外渗透压。所述乙基苯基聚乙二醇主要起到清洗剂的作用。所述盐酸胍可以快速的破坏细胞膜，还能够变性蛋白质，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。所述tris-hcl溶液和所述乙二胺四乙酸溶液能够与mg2 、ca2 、mn2 、fe2 等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。
21.（2）用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节所述细胞核裂解液的ph至9.5，得到缓冲液；此处，根据配置好后的所述细胞核裂解液进行酸碱滴定调节ph值。需要说明的是，一般宫颈环境为酸性，而在碱性环境下，特别是在ph=9.5时更有利于dna提取。
22.（3）准备好待提取的第一样本300ul，放入ep管中并用离心机，在1400r/min的转速下离心5分钟，去上清，得到第二样本；去上清后得到的所述所述第二样本约25ul。所述第一
样本可以是取好的tct样本，也可以是hpv检测样本，即为最初从人体子宫内采取的脱落细胞样本；需要说明的是，所述tct样本可以是尚未进行tct检测的样本，也可以是已经做完tct检测后的样本再次使用，如此更加方便，便捷。
23.（4）在所述第二样本中加入300ul所述缓冲液，放入离心机，在1400r/min的转速下离心5分钟，去上清，得到第三样本；本发明对离心机的具体型号不做限定，这步中加入所述缓冲液主要对所述第二样本进行洗涤，之后进行离心。
24.（5）在所述第三样本中再次加入所述缓冲液50ul，得到第四样本；经过所述步骤（4），所述第三样本中几乎不含所述缓冲液，因此再次加入所述缓冲液，创造ph=9.5的环境，以便满足之后的步骤。
25.（6）在所述第四样本中加入10ul蛋白酶k溶液和2ul二硫苏糖醇溶液，所述蛋白酶k溶液浓度为13mg/ml,所述二硫苏糖醇溶液浓度为0.375g/ml，得到第五样本。所述蛋白酶k用于消化蛋白质，所述二硫苏糖醇溶液是一种强还原剂，防止dna降解。
26.（7）将所述第五样本放入聚合酶的链式反应设备，进行反应。需要说明的是，所述第五样本在放入pcr（聚合酶的链式反）设备之前，需要先加入pcr试剂并按照设定好的程序上prc仪，进行反应。
27.在将所述第五样本放入聚合酶的链式反应设备，进行反应之后，将得到的反应物进行电泳检测。
28.采用上述方法，我们先选取经过传统的磁珠法和柱提法提取dna失败的样本89份进行实验，需要说明的是，所述电泳胶检测可以得到电泳胶图用以初步判断所述方法是否可行。请参考图5和图6，图5中目的片段1为260bp的hbb（人基因组上较为保守的基因）条带，目的片段2位170bp的hpv条带；此处选择的marker为50bpmarker分别为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp其中300bp处最亮；其中s1-s45为样本编号，其中p表示阳性对照，n表示阴性对照。电泳胶图可作为提取是否成功的初步判断标准，其中目的片段hbb或者hpv出现一个条带表示提取成功，由电泳胶图1可看出有38个有条带。图6中目的片段1为260bp的hbb条带，目的片段2位170bp的hpv条带；此处选择的marker为50bpmarker分别为50bp，100bp，150bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp其中300bp处最亮；其中s46-s89为样本编号，其中q为提取质控，n表示阴性对照。电泳胶图可作为提取是否成功的初步判断标准，其中目的片段hbb或者hpv出现一个条带表示提取成功由胶图2可看出有37个有条带。因此，通过电泳胶图，一共89个样本75个有条带，成功率高达84.4%，这个是针对磁珠法和柱提法失败的样本采用本方法再次提取，成功率大大提升，可见该方法灵敏性较高。需要说明的是所述电泳检测的结果只是做一个初步判断，后续还可以通过测序灵敏度较高的ngs(高通量二代测序仪器)进行测序，因为ngs测序成本较高，因此，我们先进行所述电泳检测。
29.通过上述步骤，我们用tct保存液即可完成提取dna，因此在做tct检测的同时也可以同步完成hpv分型检测。如此，不需要客户取两次样本，降低了成本，减少了对客户身体的伤害和客户的成本，也节约了时间。
30.所述方法不仅可以用于tct保存液完成提取dna，对于hpv保存液也同样适用，也可以完成提取dna。
31.对于hpv保存液，经过前期1次试验，我们取磁珠法和柱提法失败需要重新取样的样本43份，用所述方法进行dna提取，成功提取dna的有39份，失败4份，成功率达90%。经过后
期4次试验，结果分别如下：首先，取第一批9741份样本分别采用传统磁珠法和本发明所述方法提取dna，传统磁珠法提取dna成功率为71.29%，发明所述方法提取dna成功率为97.1%，提升比率为25.8%；其次，取第二批9565份样本分别采用传统磁珠法和本发明所述方法提取dna，传统磁珠法提取dna成功率为74.38%，发明所述方法提取dna成功率为97.4%，提升比率为23.1%；再次，取第三批7031份样本分别采用传统柱提法和本发明所述方法提取dna，传统柱提法提取dna成功率为81.12%，发明所述方法提取dna成功率为98.1%，提升比率为17.0%；最后，取第四批9283份样本分别采用传统柱提法和本发明所述方法提取dna，传统柱提法提取dna成功率为69.54%，发明所述方法提取dna成功率为97.0%，提升比率为27.4%。中期4次试验样本容量大，结果可信度高，足以证明本发明所述方法提取dna的成功率和传统的方法相比有很大的提升，此外，在成本上本发明所述方法也有所降低。
32.对于tct保存液，我们选取了1613份样本，分别用本发明所述方法以及传统的磁珠法提取dna，之后再完成后面ngs(高通量二代测序仪器)路线所有实验，请参考图2，图2是ngs技术流程图，包括提取dna，pcr，建库，上机，数据分析等步骤，发现两者检出样本阳性的概率分别为11.51%和11.35%。需要说明的是，采用传统的磁珠法在tct保存液中提取dna之后再完成后面ngs路线所有实验，是现有的比较成熟的技术，得到的数据是可以用做样本参照的，但这种方法耗时非常长，且需要耗费大量人力和财力。而该方案得到的数据与传统的磁珠法几乎一致，但方法简单，成本低廉，效率高。具体地，通过200个样本实验，我们发现，采用传统的磁珠法提取dna人工作业时间约6小时，总成本为1000元；而采用本发明所述方法提取dna人工作业时间约2.5小时，总成本为300元。
33.显然，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。