一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于外泌体技术领域，特别涉及一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.外泌体是指直径30-150nm、包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡，特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为“exosome”。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
3.目前研究表明特异性分泌的外泌体可以参与细胞间通讯，并具有作为运载物将特定物质输送到特定部位的潜力。目前外泌体主要通过超速离心法、试剂盒法或磁珠法进行提取。然而，超速离心法需要高达100000g的离心力，过程费时，且回收率不稳定，并且超高的转速容易对外泌体囊泡造成损害、从而影响产量；试剂盒种类多样、质量不一，且针对性强，难以满足不同的样品和提取要求；磁珠法往往成本较高、操作复杂，并且提取的外泌体存在特异性不高、完整性较差等问题，对外泌体的应用造成限制。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
5.本发明具体技术方案如下：
6.本发明一方面提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
7.向培养成熟的间充质干细胞中等体积加入0.65m的甘油磷酸钾溶液或0.075m的氯化钾溶液，置于37℃下低渗处理20min，之后用生理盐水洗净，再置于37℃下低渗处理40min，将细胞膜破坏、使外泌体进一步暴露；将经过低渗处理的细胞在4℃下以300～2000g的转速离心20min，将上清转移至新的离心管中，先后使用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上清液，得到含有所述外泌体的溶液
8.该方法操作简单、使用方便，获得的间充质干细胞产量高、纯度好，适合用来进行后续的研究。
9.本发明另一方面提供了应用上述方法制备的间充质干细胞外泌体，所述外泌体含有特异性抗体cd9、cd63、cd81以及plap。
10.该外泌体含有外泌体的特异标记cd9、cd63、cd81以及plap，并且含量较高、总量达到100～2000μg/ml，其中cd9可达到300～1000ng/ml、cd63可达到20～200ng/ml、cd81可达到30～400ng/ml、plap可达到20～200ng/ml，表明应用上述方法获得的外泌体的产量较高。
11.本发明还提供了上述间充质干细胞外泌体在制备促进神经细胞分化、生长和复制的制剂中的应用。
12.该外泌体可以促进诱导神经原类细胞分化成神经祖细胞、神经元细胞以及末梢神经等各个神经结构形成，并可检测出各个神经分化期的细胞标记物。
13.本发明还提供了上述间充质干细胞外泌体在制备药物载体中的应用。
14.外泌体天然的结构形态为小分子化学药物(如紫杉醇、姜黄素等)的摄取和运输提供了基础，由于药物能够在外泌体的包裹下不被血液吸收、而是直接到达用药部位，因此降低了药物的毒副作用、并提高了药物的利用率，相比传统的化学药物递送系统具有突出的优势。
15.进一步地，所述药物载体的制备方法如下：
16.向间充质干细胞培养基中添加10％牛血清进行培养，培养结束前3天停止使用牛血清，培养结束后进行提取和纯化，从而得到所述药物载体。
17.本发明还提供了上述间充质干细胞外泌体在制备促进皮肤组织修复和再生的制剂中的应用。
18.本发明提供的外泌体中含有间充质干细胞的蛋白质和rna等成分，能够调节炎症反应、促进皮肤相关细胞再生。用该外泌体制备的制剂能够修复加速细胞生长、促进血管新生，促进皮肤组织修复和再生，从而对皮肤破损、溃烂等起到良好的治疗作用。
19.进一步地，所述制剂包括体积比1:1的水凝胶和所述外泌体。
20.本发明还提供了上述间充质干细胞外泌体在制备促进毛囊再生的制剂中的应用。
21.本发明提供的外泌体中含有间充质干细胞的蛋白质和rna等成分，能够调节炎症反应、促进毛囊相关细胞再生。用该外泌体制备的制剂能加速毛囊细胞生长、促进血管新生，有效促进毛囊再生，从而具有良好的生发效果。
22.进一步地，所述制剂包括所述外泌体以及生理盐水，其中所述外泌体的含量为0.1～10.4％。
23.本发明的有益效果如下：本发明提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法，取材方便，成本较低，能够快速、高效地制备大量的、高纯度的间充质干细胞来源的外泌体，相比于现有技术可以有效降低成本、提高产量，适合进行规模化应用；该外泌体可以应用于促进神经细胞生长和修复，能够诱导神经祖细胞分化成神经元细胞和末梢神经等各种神经细胞形态；药物能够通过外泌体进入脑脊液、缓解脑神经退化，能够通过血脑屏障，可作为治疗中枢神经系统疾病的药物的天然载体；可以调节表皮细胞的增长，可在微环境中促进炎性细胞因子分泌，刺激皮肤缺损处血管新生以及胶原沉积，调节皮肤成纤维细胞增殖分化，从而加速皮肤组织再生和修复；能有效促进毛囊再生，从而达到生发效果。
附图说明
24.图1为实验例1中不同部位外泌体免疫酶联反应的定量测定结果，其中a为cd19、cd63、cd81，b为plap；
25.图2为实验例1中外泌体抗体的免疫荧光反应的跟踪结果；
26.图3为实验例2中外泌体在电镜下的形态；
27.图4为实验例3中在培养基中添加外泌体后培养第6天的细胞表面变化情况；
28.图5为实验例3中培养第12天的神经细胞分化的免疫荧光形态；
29.图6为实验例4中大鼠的皮肤创面的病理愈合情况；
30.图7为实验例5中裸鼠的皮肤增毛情况；
31.图8为实验例6中外泌体体外标记肺泡检出情况。
具体实施方式
32.实施例1
33.应用胎盘组织制备间充质干细胞外泌体，具体方法如下：
34.s1：在gmp制备车间将胎盘组织用含有1％双抗的生理盐水充分洗净，将清洗过的组织置于无菌培养皿中，横切剪为1cm的小块，使用锯齿镊固定组织，将组织中的血管进行剥离，并剪碎成约1mm3的小块，用生理盐水清洗；
35.s2：将血管碎块加入20ml无血清培养基中进行培养，前4天置于37℃、co2浓度5％的培养箱中培养，从第5天开始换液，之后每3天换液一次，7～15天后可观察到梭形细胞长出，得到间充质干细胞；当获得7～8个克隆时即可传代、冻存；
36.s3：间充质干细胞培养前3天用无添加培养基培养48～72h，去除外源的外泌体；
37.s4：上述间充质干细胞用pbs洗净，等体积加入0.65m的甘油磷酸钾溶液或0.075m的氯化钾溶液，置于37℃下低渗处理20min，之后用生理盐水洗净，再置于37℃下低渗处理40min，将细胞膜破坏，使外泌体暴露在外；
38.s5：将经过低渗处理的细胞液在4℃下以300～2000g的转速离心20min，将上清转移至新的离心管中，先后使用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤上清液，得到含有所述外泌体的溶液。
39.实施例2
40.应用脐带组织制备间充质干细胞外泌体，具体方法同实施例1。
41.实施例3
42.应用羊膜组织制备间充质干细胞外泌体，具体方法同实施例1。
43.实施例4
44.应用脐带血制备间充质干细胞外泌体，具体方法如下：
45.s1：对脐带血进行全血细胞分离，并对血浆进行预处理；用抗cd34抗体和抗cd44抗体包被细胞培养皿，加入预处理后的脐带血全血细胞，分离培养有核细胞；
46.s2：将分离好的有核细胞加入20ml无血清培养基中进行培养，前4天置于37℃、co2浓度5％的培养箱中培养，从第5天开始换液，之后每3天换液一次，7～15天后可观察到梭形细胞长出，得到间充质干细胞；当获得7～8个克隆时即可传代、冻存；
47.s3～s5同实施例1。
48.实验例1
49.外泌体产生情况比较
50.通过酶联免疫反应，分别对实施例1～4以及羊膜细胞裂解液产生的外泌体进行cd9、cd63、cd81、plap标记的检测，结果如图1和图2所示，各组样品中均检测到了上述四种标记，总量达到100～2000μg/ml，其中cd9可达到300～1000ng/ml、cd63可达到20～200ng/ml、cd81可达到30～400ng/ml、plap可达到20～200ng/ml，表明应用上述方法获得的外泌体的产量较高。并且其中以胎盘组织裂解液中的plap含量最高，表明胎盘组织来源的间充质干细胞制备外泌体的产量最高、制备能力最强。
51.将上述产物置于电镜下观察，清晰可见直径小于等于100nm的杯型小体，确认产生了外泌体。
52.实验例2
53.外泌体表达定位
54.利用cd9、cd63、cd81三种标记的表面抗原，通过荧光免疫反应对外泌体进行鉴定和示踪，结果如图3所示，外泌体cd63-fitc可以被准确定位和追踪。
55.实验例3
56.间充质干细胞外泌体促进神经细胞分化的应用
57.分别向mem培养基中添加10％、20％、30％和50％的实施例1制备的提取物，并用0.22μm的滤膜过滤、出去细胞碎片和颗粒杂质，作为干预组2～5，另外将添加血清的神经细胞培养基作为对照组，添加到六孔板中；将羊膜间充质干细胞以1
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105个/孔的量接种于六孔板中进行培养，观察细胞的生长状况。
58.培养第6天的实验结果如图4所示，将实施例1的提取物添加到培养基中，可以有效支持细胞传代、促进神经元细胞分化生长，并且效果与外泌体的添加量呈正相关关系。可见外泌体能促进诱导神经细胞分化形成神经祖细胞、神经元细胞和末梢神经等各个神经结构，并可检测出各个神经分化期的标记物。
59.培养第12天的实验结果如图5所示，细胞用表面用anti-nestin fitc抗体染色。细胞形态和免疫染色结果表明本发明提供的外泌体具有促进神经细胞分化的能力；干预组神经干细胞的分化数量比对照组高出10％以上，神经元细胞的免疫染色的质量比为1～8％。由此可见，本技术提供的外泌体具有突出的促进神经细胞分化和促进神经生长的作用。
60.实验例4
61.间充质干细胞外泌体促进皮肤组织修复和再生的应用
62.s1：取6～8周龄的健康sd雄性大鼠6只，随机分成2组，麻醉后背部剃毛，以脊柱为中心、在背部两侧制作6个1.5cm
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1.5cm的全层皮肤缺损创面；
63.s2：制备移植材料，其中a组：将富林蜜水凝胶与实施例1制备的外泌体按照体积比1:1的比例混合，在24孔板底部铺平，置于37℃培养箱中放置30min，待混合物凝固后取出备用；b组：将富林蜜水凝胶在24孔板底部铺平，置于37℃培养箱中放置30min，待凝固后取出备用；
64.s3：分别将两组移植材料等量移植于创面，10日后处死大鼠进行解剖，并用he染色观察皮肤愈合情况。
65.实验结果如图6所示，a组大鼠皮肤创面愈合良好，病理可见丰富的新生血管(图a中箭头所示)，而b组皮肤创面并未愈合、也未见新生血管，同时有大量炎症细胞存在(图b)。由此可见，本技术提供的外泌体与水凝胶组合的制剂可有效促进皮肤缺损修复。
66.实验例5
67.间充质干细胞外泌体促进毛囊再生/治疗脱发的应用
68.取6～8周龄的健康裸鼠6只，随机分成2组，其中干预组每日向体表喷洒30％的外泌体喷雾(包括外泌体以及生理盐水，其中外泌体的含量为10％)，每日1次、每次0.5ml，对照组每日等量喷洒生理盐水的喷雾，连续喷雾30天后观察皮肤毛发情况。
69.实验结果如图7所示，干预组裸鼠体表和口鼻出毛发增长明显(图a、b)，对照组裸
鼠无变化(图c)，可见本技术提供的外泌体能有效促进毛发的生长。
70.实验例6
71.间充质干细胞外泌体作为药物载体的应用
72.利用hoechst 3325对实施例1得到的外泌体进行荧光染色，并用pbs将染色后的外泌体稀释1000倍，向健康裸鼠的口鼻处进行喷雾(采用实施例5中的喷雾)，3日后解剖，进行冷冻、固定。
73.实验结果如图8所示，用荧光显微镜观察冷冻切片，显示肺泡检出荧光标记，可见该外泌体能够到达肺部。由此可见，本技术提供的外泌体可以作为载体携带药物到达特定的部位进行释放。
74.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。