一种用于道地川芎cpSSR分子鉴定的引物及其试剂盒和应用的制作方法

一种用于道地川芎cpssr分子鉴定的引物及其试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于道地川芎cpssr分子鉴定的引物及其试剂盒和应用。


背景技术：

2.川芎为伞形科藁本属植物川芎ligusticum chuanxiong hort.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，列为上品，性辛、温，具有活血行气，祛风止痛的功效。川芎为川产道地药材，总栽培面积常年稳定在9万亩以上，年产量达到2万吨以上，是重要的组方药材。川芎隶属于藁本属植物，藁本属是伞形科中分类学上最困难的类群之一，经常有同名异种或同种异名现象，导致市场上流通的川芎品种不详，多有引种川芎和近缘种充当道地川芎的现象，且芎农购买苓种的来源不明，川芎种质资源混乱，川芎品质参差不齐，对市场药用安全、食用安全带来隐患。在栽培使用的原植物方面，《中华人民共和国药典》规定川芎为中药材川芎的唯一来源。目前全国各地以“川芎”称呼的植物有多种，药典中提到的应为四川道地产区主栽类型。不同产地的川芎混伪品在当地被作为道地川芎药材混用，同名异种的“川芎”在各地也出现用药不规范的问题。川芎和其一些易混品、近缘物种在形态、生物药性及化学成分等特征上也具有高度相似性，导致道地药材的鉴别不易，因此迫切需要新的方法提高道地川芎的鉴别能力。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于道地川芎cpssr分子鉴定的引物及其试剂盒和应用，能够对不同品种的川芎进行鉴别。
4.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
5.一种用于道地川芎cpssr分子鉴定的引物，引物包括如seq id no.1和2、seq id no.3和4、seq id no.5和6、seq id no.7和8、seq id no.9和10、seq id no.11和12、seq id no.13和14、seq id no.15和16、seq id no.17和18、seq id no.19和20、seq id no.21和22、seq id no.23和24、seq id no.25和26和seq id no.27和28中的至少一组引物。
6.一种用于道地川芎cpssr分子鉴定的引物组合，引物组合包括如seq id no.1～28所示的序列。
7.一种对道地川芎进行分子鉴定的方法，包括以下步骤：
8.(1)提取待测样品dna；
9.(2)以权利要求1或2所述的引物或引物组合进行pcr扩增，然后凝胶电泳成像即可。
10.进一步地，pcr体系包括2
×
estapmastermix(dye)7.5μl、引物
×
100倍1.5μl、dna模板1.5μl，最后用ddh2o补足至15μl。
11.进一步地，pcr程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共34个循环；最后72℃延伸10min。
12.一种试剂盒，试剂盒包括上述引物或引物组合物。
13.上述试剂盒在道地川芎分子鉴定、川芎种质资源改良、辅助育种或品种鉴定中的应用。
14.上述引物或引物组合在川芎种质资源改良、辅助育种或品种鉴定中的应用。
15.本发明的有益效果：
16.本发明设计了川芎cpssr标记的引物，引物的多态性百分率能够达到97％，有效等位基因数的范围为1.2783～3.4879，平均值为2.0357。具有多态性高，重复性好，结果更准确。能够用于川芎的遗传图谱构建、品种鉴定等研究。
附图说明
17.图1为cy13引物的检测结果；
18.图2为cy18引物的检测结果；
19.图3为川芎混伪品聚类图。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
21.实施例1引物的设计筛选
22.1、ctab法提取基因组dna
23.(1)每份材料(见表1)取3片左右幼嫩叶片置于2ml ep管中，同时加入5mm玻璃珠，快速放入液氮中速冻，随后放入液氮预冷的scientz-48型高通量组织研磨机(宁波新芝有限公司)以50hz、60s的程序研磨。
24.(2)研磨完成后每样管加入870l ctab液(含0.4％β-巯基乙醇)，关盖摇晃混匀，放入预热至65℃的水浴锅50min后取出，水浴期间，每10min将样管拿出摇匀。
25.(3)水浴完成后，拿出样板，降至室温。加入氯仿：异戊醇(24:1)混合液870l，置于摇床上混匀15min后，10000rpm、25℃离心10min。
26.(4)用无尖枪头吸取上清液至加有1ml异丙醇的2mlep管中，轻摇4～5次后4800rpm、25℃离心2.5min。
27.(5)将样管中的洗涤液倒出，dna絮状物沉淀转移至1.5mlep管，并用75％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次。静置晾干。
28.(6)晾干后，每样管加入300l ddh2o，待dna溶解后，检测、稀释、备用。
29.表1川芎混伪品材料来源
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2、pcr扩增
[0032]
根据前期川芎叶绿体基因组测序结果，用软件misa搜索cpssr位点，使用perl语言编程批量设计cpssr引物，经有效性验证，共筛选出21对有效cpssr引物。用筛选出的这21对cpssr(chloroplastsimplesequencerepeat，cpssr)引物进行pcr扩增。pcr反应体系为15μl：2
×
estapmastermix(dye)7.5μl，引物(
×
100倍)1.5μl，ddh2o4.5μl，dna模板1.5μl。反应程序设置：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃(以每对引物的退火温度决定)退火45s，72℃延伸45s，34个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物用3.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0033]
3、琼脂糖凝胶电泳
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称取琼脂糖1.4g于50ml锥形瓶中，加入tbe缓冲液40 10ml(熬煮损耗)，于微波炉中熬煮1min，取出稍加冷却，加eb替代物(goldviewtm)2ml摇匀，插入18孔梳子后倒板，冷却凝胶(冷却过程中勿动)30min，拔梳子点样5ml，marker 3ml，电泳仪电压设为120v，电流200ma，根据pcr产物片段设置时间为3h左右。取出用凝胶成像系统(bio-rad chemidocxrs，美国)成像。
[0035]
21对cpssr引物对川芎及其混伪品经pcr扩增和3.5％琼脂糖凝胶电泳检测后。共有14对cpssr引物(表2)能在川芎及其混伪品中扩增出多态性条带。
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表2 14对川芎cpssr引物信息
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实施例2引物特异性和多态性检测
[0039]
1、特异性验证
[0040]
对14对具有多态性的川芎cpssr引物进行再验证，结果发现其中2对引物可完全区分川芎和5份混伪品材料，可以作为川芎与混伪品鉴定的特异性引物，cy13可区分川芎、甘肃川芎、辽藁本和藁本4种材料(图1)，cy18可区分抚芎和云南川芎2种材料(图2)。图中，cx：川芎(l.chuanxiong)，gs：甘肃川芎(l.chuanxiong cv.gansu)，lgb：辽藁本(l.jeholense)，gb：藁本(l.sinense)，fx：抚芎(l.sinense cv.fuxiong)，yn：云南川芎(l.chuanxiong cv.yunnan)。
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2、多态性检测
[0042]
利用这14对引物对川芎及其混伪品进行pcr扩增并检测，结果显示14对引物在供试材料中共扩增出33条清晰可辨的条带，其中32条多态性条带，多态性百分率为97.0％。由群体遗传多样性分析可得(表3)，平均每对引物检测到观测等位基因数为2.3571，有效等位基因数的范围为1.2783～3.4879，平均值为2.0357，引物cy13最多为4，其次为cy11、cy17和
cy18，为3。shannon's指数(i)为0.3817～1.3315，平均值为0.7280，引物cy13最高，cy10最低。标记的多态信息含量(pic)介于0.2296～0.6891，平均值为0.3954，其中pic＞0.5的标记有3个，分别是cy11、cy13和cy18，0.250《pic《0.500的标记有9个，分别是cy2、cy4、cy5、cy6、cy8、cy14、cy15、cy17和cy19。
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表3 14对cpssr标记在材料中的遗传参数
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实施例3川芎及其混伪品聚类分析
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利用14个cpssr引物产生的标记信息，通过ntsys2.10e建立了供试样本的相似系数矩阵。川芎及混伪品的遗传相似系数在0.364～0.970之间，平均遗传相似系数为0.664。川芎及混伪品的cpssr聚类分析结果见图3。在遗传相似系数为0.820处，6份材料聚为3类，川芎、甘肃川芎和辽藁本聚为一类，藁本单独为一类，抚芎和云南川芎聚为一类。
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本技术以7个藁本属的叶绿体基因组数据设计的21对cpssr引物对川芎及其混伪品进行检测，共有14对cpssr引物能在供试材料中扩增出多态性条带，基因多样性为0.4716，多态信息含量0.3954，其中两对引物组合即能直接区分出6个供试材料。聚类分析显示川芎、甘肃川芎和辽藁本聚为一类，藁本、抚芎和云南川芎聚为一类，此研究显示川芎和辽藁本有更近的亲缘关系，而抚芎则和藁本有更近的亲缘关系。