用于诊断、评估预后及治疗僵直性脊椎炎的生物标记及目标的制作方法

用于诊断、评估预后及治疗僵直性脊椎炎的生物标记及目标
1.相关申请
2.本技术主张根据美国专利法第119条(35u.s.c.
§
119)于2018年7月10日提出申请的美国临时申请第62/696,020的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及一种用于诊断、评估预后及治疗僵直性脊椎炎(as)的生物标记及目标。本发明还涉及一种用于生产僵直性脊椎炎(as)动物模式的方法，由其生产的动物模式，以及使用这种动物模式筛选在僵直性脊椎炎(as)治疗中一具有药学活性的药剂的方法。


背景技术：

4.僵直性脊椎炎(as)为一种慢性关节炎，其特征为发炎性脊椎炎，周边关节炎以及接骨点炎。通常，它发生在年轻成年男性中并且与人类白血球抗原(humanleukocyte antigen,hla)-b27强烈相关1。除慢性脊椎炎外，在2年内三分之一的患者中经常观察到新骨的形成，导致相邻椎体的骨化及黏连(骨赘“syndesmophytes”)，可能导致永久性残疾2。尽管有如非类固醇消炎止痛药(non-steroidalanti-inflammatory drugs,nsaids)、抗肿瘤坏死因子(anti-tumor necrosis factor, tnf)-α改善发炎，或介白素-17阻断剂等治疗，但它们不能完全阻止骨赘形成
3-9
。 mri影像还提供证据显示大多数新的骨赘在脊椎单位发展而没有发炎
10
。因此，骨赘形成可以与发炎分开
10-12
。进一步了解原位基质活化的病理机制为预防脊椎关节僵硬最优先要做的事。虽然已有报导僵直性脊椎炎(as)患者来源的间质干细胞 (mesenchymal stem cells,mscs)的成骨作用发生改变
13,14
，但间质干细胞(mscs)在骨赘病灶与潜在遗传途径中的作用大多是未知的。
5.有需要开发用于诊断、评估预后及治疗僵直性脊椎炎(as)的方法以及筛选用于治疗僵直性脊椎炎(as)的有效药剂的平台。


技术实现要素：

6.于本发明中，我们建立了僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)，并发现僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)中增强的tnap(一种alpl基因产物)为僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)所诱导的骨结合的病理机制所必需的，而且tnap的阻断会抑制僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)的异常矿化。我们还使用僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)建立了僵直性脊椎炎(as)动物模式，其可用于筛选有效治疗僵直性脊椎炎(as)的药剂。此外，我们在人类受试者中证明alpl基因产物(血清 tnap/或骨alp含量)与僵直性脊椎炎(as)高度相关，尤其是僵直性脊椎炎(as)的放射照相严重程度，因此可以作为诊断僵直性脊椎炎(as)的生物标记，也可用于监测僵直性脊椎炎(as)患者的进展。
7.在一方面，本发明提供一种用于检测僵直性脊椎炎(as)及/或预测僵直性脊椎炎(as)的放射照相严重程度的发展风险的方法，包括：(i)提供受试者的生物样品；以及(ii)在该样品中检测alpl基因产物作为僵直性脊椎炎(as)的标记。
8.在部分具体实施例中，该基因产物包括蛋白质或rna转录物。
9.在部分具体实施例中，该alpl基因产物为非特异性碱性磷酸酶(non-specificalkaline phosphatase,tnap)。
10.在部分具体实施例中，该alpl基因产物为骨特异性碱性磷酸酶(bone-specifictnap,bap)。
11.在部分具体实施例中，以特异性结合至该alpl基因产物的试剂检测该标记，例如，抗体或引子/探针。
12.在部分具体实施例中，通过免疫分析、质谱仪分析、核酸杂交检测分析及/或反转移酶-聚合酶连锁反应(reverse transferase-polymerase chain reaction,rt-pcr)进行检测。
13.在部分具体实施例中，该生物样品为体液样品，例如，血液或血清，或组织样品，例如，骨髓切片。
14.在部分具体实施例中，该方法还包括将检测结果与参考程度进行比较，且若比较显示该alpl基因产物的含量升高，则将受试者鉴定为具有僵直性脊椎炎(as) 及/或具有僵直性脊椎炎(as)的放射照相严重程度的发展风险。
15.在部分具体实施例中，该方法还包括对该受试者施用额外的僵直性脊椎炎 (as)诊断测定，以确认僵直性脊椎炎(as)发生或僵直性脊椎炎(as)的放射照相严重程度的发展风险。
16.在部分具体实施例中，该放射照相严重程度包括僵直性脊椎炎(as)的一个或多个放射照相特征，该放射照相特征选自由下列所组成的群组：侵蚀、硬化、方形、骨赘形成、骨桥、脊椎僵直，及其任何组合。
17.在部分具体实施例中，该方法进一步包括以抗僵直性脊椎炎(as)的治疗方法 (例如，手术及/或物理治疗)及/或药物(例如，皮质类固醇、非类固醇消炎止痛药 (nsaiss)、免疫抑制剂、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)阻断抑制剂、抗介白素-6抑制剂、介白素17a抑制剂，及/或tnap抑制剂(包括bap抑制剂))治疗该受试者。
18.特别地，本发明的方法可用于监测僵直性脊椎炎(as)患者中僵直性脊椎炎(as) 的进展，包括
19.(a)在第一时间点提供来自该患者的第一生物样品；
20.(b)在第二时间点提供来自该患者的第二生物样品，其中该第二时间点晚于该第一时间点；
21.(c)测量该第一及第二生物样品中alpl基因产物的含量，以作为僵直性脊椎炎(as)标记；以及
22.(d)基于该第一及第二生物样品中该alpl基因产物的含量，以确定该患者的僵直性脊椎炎(as)进展，其中相较于该第一生物样品中alpl基因产物的含量，该第二生物样品中该alpl基因产物的含量升高表示僵直性脊椎炎(as)进展中。
23.在另一方面，本发明提供一种用于治疗僵直性脊椎炎(as)的tnap抑制剂。还提供了一种治疗僵直性脊椎炎(as)的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的tnap抑制剂。本文还描述一种tnap抑制剂在制备用于治疗僵直性脊椎炎 (as)的药物的用途。
24.在部分具体实施例中，该方法有效减轻或缓解僵直性脊椎炎(as)的一种或多种病
density,o.d.)测量的ars染色的代表性定量结果，显示在指定天数三个僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及三个正常间质干细胞(nmscs)之间的矿化速率。图1c，成骨诱导下第0天以及第7天僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及正常间质干细胞(n mscs)中runx2 mrna含量的rt-qpcr。图 1d-1f，以针对runx2的shrna(shrunx2)或对照慢病毒载体的shrna(shctrl)转染间质干细胞(mscs)，然后在成骨条件下培养。图1d，rt-qpcr显示两个独立的 shrunx2的基因敲落效率。图1e，ars染色显示runx2基因敲落对僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)矿化的影响。图1f，由光密度(o.d.)测量ars染色(图1e)的定量结果。图1g，在成骨诱导的第14天以dapi(蓝色)以及骨钙黏蛋白特异性抗体(绿色)对僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及正常间质干细胞(n mscs)进行的免疫荧光染色。图1h及图1i，rt-qpcr显示在成骨诱导下第7天僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及正常间质干细胞(n mscs)中骨钙蛋白(图1h)以及胶原1a1(图 1i)的mrna含量。结果来自至少三次独立实验。数据代表平均值
±
平均值的标准误差(standard error of mean,sem)(n＝3)。通过学生氏t-检验，*p《0.05，**p《0.01， ***p《0.001，****p《0.0001。比例尺＝200μm(a,e)；20μm(g)。
43.图2a-2m所示为tnap的增强表现对于成骨诱导下僵直性脊椎炎间质干细胞 (as mscs)中的异常矿化是必需的。图2a-2c，通过alp酶活性测定的成骨诱导后第0天及第7天，僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及正常间质干细胞(n mscs) 中的碱性磷酸酶(alp)活性以及tnap含量(图2a)，通过rt-qpcr测量的tnapmrna含量(图2b)以及免疫墨点分析(图2c)。图2d-2e，通过ars染色(图2d)定量测定tnap抑制剂(100μm左旋咪唑、100μm硫酸铍四水合物，或1μg/ml帕米膦酸盐)对成骨诱导下僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)矿化的影响(图2e)。图2f-2h，在成骨诱导7天后，僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)中的碱性磷酸酶(alp)活性 (图2f)、tnap mrna(图2g)，以及蛋白质含量(图2h)被shtnap抑制。图2i-2j，通过ars染色(图2i)定量测定成骨诱导下两种shtnap对僵直性脊椎炎间质干细胞 (as mscs)的加速矿化的抑制(图2j)。图2k-2m，通过ars染色(图2k)定量测定通过正常间质干细胞(n mscs)中的慢病毒转导(p-tnap)过表现tnap(图2l)。图2m，免疫墨点分析显示tnap蛋白的表现。结果来自至少三次独立实验。数据代表平均值
±
平均值的标准误差(sem)。通过学生氏t-检验，*p《0.05，***p《0.001，****p 《0.0001。比例尺＝200μm(图2d、图2i、图2k)。
44.图3a-3d所示为tnap阻断抑制由nod-scid小鼠中的僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)诱导的新骨附着。图3a-3d，nod-scid小鼠的腰椎微型计算机断层扫描的代表性影像，在邻近腰椎节l4-5的右侧椎板植入僵直性脊椎炎间质干细胞 (as mscs)或正常间质干细胞(n mscs)(图3a)，其中僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)以shctrl或shtnap转导(图3b)，或僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)加上每日口服h2o、左旋咪唑(10mg/kg)、硫酸铍四水合物(7.5mg/kg)，或帕米膦酸盐(0.3 mg/kg)(图3c)。植入后3周拍摄影像。显示出l4-l6(左图)的纵向视图，l4上的高放大率的纵向视图(中间图)，以及l4上的横截面视图(右图)。新的骨骼接合由红色矩形(中间图)以及白色箭头(右图)突出显示。显示了每组中三只小鼠的代表性影像。图3d，每组中新骨对位的定量体积(mm3)。数据为平均值
±
平均值的标准误差(sem)(在每组僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)或正常间质干细胞(n mscs)中n ＝9，在以shtnap或shctrl转导的每组僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)中n＝9，在每组僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)中n＝9加上每日口服h2o、左旋咪唑、硫酸铍四水合物，或帕米膦酸盐)。通过学生氏t-检验，*p《0.05，**p《0.01，*** p《0.001。
45.图4a-4d所示为相较于来自健康个体的样品，来自僵直性脊椎炎(as)患者的骨髓以及血清中的tnap显著升高，并且与僵直性脊椎炎(as)患者中的放射照相严重程度相关。图4a，来自僵直性脊椎炎(as)患者以及具有tnap特异性抗体的正常对照的骨髓的免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)染色。插图表示方框区域的高放大率。图4b-4d，以tnap抗体(棕色)进行双重免疫组织化学(ihc)染色，并指示第二种初级抗体(蓝色)。tnap/cd68(单核细胞谱系)(图4b)，tnap/髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)(骨髓谱系)(图4c)，tnap/cd44(msc)(图4d)的共定位显现为暗紫色。插图表示来自方框区域的高放大率(400x)；上图为显微镜影像，下图为通过光谱分离技术与光谱库的复合伪彩影像(以棕色的tnap抗体染色并以蓝色的二级抗体染色)。tnap/mpo、tnap/cd68，以及tnap/cd44的共定位呈现为绿松石色。比例尺＝50μm(图4a-4d)。
46.图5所示为在成骨诱导下僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)中的异常矿化需要增强的tnap表现。在添加或不添加β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate,bgp)的情况下，在生长培养基(growth medium,gm)中培养间质干细胞(mscs)，并通过ars 染色确定矿化。(左图)僵直性脊椎炎(as)与正常间质干细胞(n mscs)中矿化的ars 染色(比例尺＝200μm)。(右图)(t)中ars染色的定量结果。数据为平均值
±
平均值的标准误差(sem)。结果来自进行两次独立实验，每次各三重复。通过学生氏t-检验，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
47.图6所示为口服tnap抑制剂后12周的骨质密度。采用僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)植入并每日口服h2o(n＝4)、左旋咪唑(10mg/kg)(n＝3)、硫酸铍四水合物(7.5mg/kg)(n＝3)，或帕米膦酸盐(0.3mg/kg)(n＝3)后，通过微型计算机断层扫描观察nod-scid小鼠中股骨的骨质密度。
48.图7所示为非僵直性脊椎炎(as)患者对照的骨髓中的tnap表现。来自具有 tnap特异性抗体的非僵直性脊椎炎(as)患者的骨髓的免疫组织化学(ihc)染色。比例尺＝50μm。插图表示方框区域的高放大率。
49.图8所示为在第0-3、3-7，以及7-10天，在成骨诱导下由僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)与正常间质干细胞(n mscs)分泌的细胞激素的表现。数据为平均值
±
平均值的标准误差(sem)。结果来自进行两次独立实验，每次各三重复。
具体实施方式
50.除非另有定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
51.如本文所用，单数形式“一”、“一个”，以及“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种组成分”包括多种这样的组成分及其本领域技术人员已知的其等同物。
52.术语“包含(动词)”或“包含(动名词)”通常以包含/包括的含义使用，其表示允许存在一种或多种特征、成分或组成分。术语“包含(动词)”或“包含(动名词)”包括术语“由......组成(动词)”或“由......组成(动名词)”。
53.如本文所用，术语“约”或“近似”是指本领域普通技术人员将理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上根据其使用的上下文而变化。通常，“约”或“近似”可表示在引用值附
近具有
±
10％范围的数值。
54.如本文所用，术语“核酸片段”、“核酸”以及“多核苷酸”在本文中可互换使用，是指由核苷酸单元组成的聚合物，包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“dna”)以及核糖核酸(“rna”)以及核酸类似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸类似物。因此，这些术语包括，但不限于，单链、双链，或多链dna 或rna、基因组dna、cdna、mrna、dna-rna杂合体，或包含嘌呤与嘧啶碱基或其他天然的聚合物，化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。应当理解的是，当核酸片段由dna序列(即a、t、g、c)表示时，其还包括rna序列(即a、u、g、c)，其中“u”取代“t”。
55.如本文所用，本文所用的术语“引子”是指特定的寡核苷酸序列，其与目标核苷酸序列互补并用于与目标核苷酸序列杂交。引子作为由dna聚合酶、rna聚合酶，或反转录酶催化的核苷酸聚合的起始点。例如，分别如本文所用的alpl基因的引子为那些能够与各个目标基因的核苷酸序列杂交以启动核苷酸聚合并基于引子序列的设计产生如预期的核苷酸产物。alpl基因的引子的实例为 agactgcgcctggtagttgt(seq id no:1)以及 cctcctcggaagacactctg(seq id no:2)。
56.如本文所用，本文所用的术语“探针”是指确定的核酸区段(或核苷酸类似物区段，例如，如本文所定义的多核苷酸)，其可用于鉴定杂交期间样品中存在的特定多核苷酸序列，该核酸区段包含与待鉴定的特定多核苷酸序列互补的核苷酸序列。通常，探针可产生可检测的信号，因为它以某种方式被标记，例如，通过掺入报告分子，例如荧光团或放射性核素或酶。例如，分别如本文所用的alpl基因探针，为能够与各个目标基因的相应核苷酸序列特异性杂交并产生由这种杂交引起的可检测信号的探针。
57.如本文所用，本文所用的术语“杂交”应包括核酸的一股通过碱基配对与互补股连接的任何过程。相关技术在本领域中为已知的且描述在例如，sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual，第2版，冷泉港实验室出版社(1989年)，以及frederick m.a.等人，current protocols in molecular biology，john wiley&sons 公司(2001年)。通常，严格条件选择为在特定离子强度以及ph值下比特定序列的热熔点(tm)低约5至30℃。更典型地，严格条件选择为在确定的离子强度以及ph值下比特定序列的tm低约5至15℃。例如，严格的杂交条件为盐浓度小于约1.0m钠(或其它盐类)离子，通常在约ph 7.0至约ph 8.3下约0.01至约1m的钠离子浓度且温度为对于短探针(例如，10至50个核苷酸)至少约25℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约55℃。用于长探针(例如，大于50个核苷酸)的示例性非严格或低严格条件将包含20mm tris,ph 8.5、50mm kcl，以及2mm mgcl2的缓冲液，且反应温度为25℃。
58.如本文所用，本文所用的术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如，基因、cdna，或mrna)的固有特性，以作为合成具有确定的核苷酸序列(即，rrna、 trna，以及mrna)或确定的胺基酸序列以及由此产生的生物学特性的基因产物的模板。
59.如本文所用，本文所用的术语“表现”是指实现在基因中编码的遗传信息以产生基因产物，例如未剪接的rna、mrna、剪接变体mrna、多胜肽或蛋白质、转译后修饰多胜肽、剪接变体多胜肽等。
60.如本文所用，术语“表现量”是指细胞中特定基因表现的基因产物的量，其可通过本领域已知的任何合适方法测定。
61.如本文所用，术语“多胜肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式的胺基酸，其可包括编码以及非编码胺基酸、化学或生物化学修饰或衍生的胺基酸，以及具有修饰的胜肽骨架的多胜肽。
62.如本文所用，术语“抗体”是指能够结合抗原的免疫球蛋白。本文使用的抗体目的在于包括完整抗体以及能够结合抗原决定位、抗原，或目标抗原片段的任何抗体片段(例如，f(ab')2、fab'、fab、fv)。本发明的抗体为免疫反应性的或免疫特异性的，因此特异性地且选择性地结合目标蛋白质，例如alpl基因产物，例如非特异性碱性磷酸酶(tnap)。用于目标蛋白质的抗体较佳为免疫特异性的，亦即，与相关材料基本上不交叉反应，尽管它们可以识别它们跨物种的同源物。术语“抗体”包括所有类型的抗体(例如，单株以及多株抗体)。
63.根据本发明，alpl基因产物可作为僵直性脊椎炎(as)标记，用于检测僵直性脊椎炎(as)的发生及/或预测僵直性脊椎炎(as)的放射照相严重程度的发展风险。
64.如本文所用，生物学标记(或称为生物标记或标记)为客观测量及评价的特征，作为正常或异常生物过程/病症、疾病、致病过程或对治疗或治疗干预的反应的指示。标记可包括存在或不存在指示特定生物过程/条件的特征或模式或特征集合。标记通常用于诊断及评估预后的目的。然而，其可用于本文所述的治疗、监测、药物筛选及其他目的，包括评估僵直性脊椎炎(as)治疗剂的有效性。
65.如本文所用的“诊断(diagnosis)”通常包括确定受试者是否可能受给定疾病、病症或功能障碍的影响。技术人员通常基于一种或多种诊断指标进行诊断，该诊断指针即标记，其存在、不存在或含量表示该疾病、病症或功能障碍的存在或不存在。
66.如本文所用的“预后(prognosis)”通常是指对临床病症或疾病的可能过程及结果的预测。患者的预后通常通过评估代表疾病的有利或不利过程或结果的疾病的因素或症状来进行的。应当理解的是，术语“预后”不一定是指以100％准确度预测病症的过程或结果的能力。相反地，技术人员将理解术语“预后”是指某一过程或结果将发生的概率增加；换言之，相较于没有表现出病症的个体，在表现出给定病症的患者中更可能发生过程或结果。可以理解的是，积极预后(positiveprognosis)通常是指有益的临床结果或前景，例如僵直性脊椎炎(as)的症状较少，而不良预后(negative prognosis)通常是指负面的临床结果或前景，例如僵直性脊椎炎(as)的更多症状。于某些具体实施例中，僵直性脊椎炎(as)的症状为放射照相严重程度，包括选自由下列所组的群组的一个或多个放射照相特征：侵蚀、硬化、方形、骨赘形成、骨桥、脊椎僵直，及其任何组合。
67.如本文所用，术语“受试者”、“个体”以及“患者”可以指需要诊断、评估预后、处理，或治疗的哺乳动物受试者，特别是人类。其他受试者可包括牛、狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
68.如本文所用，“异常含量”可以指与参考含量相比增加的含量。例如，异常含量可以比参考含量高10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。于一些具体实施例中，将待测受试者中本文所述的生物标记的表现量与基于历史值的标准含量进行比较。例如，可以基于从一群受试者获得的相应生物样品中的这种生物标记的平均或中值表现量来设定标准含量。例如，受试者群组可为参加临床试验的一组僵直性脊椎炎(as)患者。于一些具体实施例中，参考含量可指在正常个体或样品(例如，未患病的组织或细胞)中测量的含量。
chromatography-mass spectrometry,lc-ms)、液相色层分析串联质谱仪分析 (liquid chromatography tandem mass spectrometry,lc-ms-ms)、电喷雾电离质谱仪分析(electrospray ionization mass spectrometry,esi-ms)、基质辅助激光解吸电离/飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight,maldi-tof)，以及表面增强激光解吸电离/飞行时间(surface-enhanced laser desorption ionisation/timeof flight,seldi-tof)。该方法的一个特定实施例为串联质谱仪分析(ms/ms)，其涉及质量选择或分析的多个步骤，通常通过某种形式的碎裂分开。
74.于一些具体实施例中，生物标记的存在及/或含量可通过免疫分析来确定。免疫分析的实例包括，但不限于，西方墨点分析法、酵素联结免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)、放射免疫分析(radioimmunoassay, ria)、放射免疫沉淀分析(radioimmunoprecipitation assay,ripa)、免疫荧光分析 (immunofluorescence assay,ifa)、酵素联结荧光免疫分析(enzyme-linked fluorescentimmunoassay,elfa)、电化学发光(electrochemiluminescence,ecl)，以及毛细管凝胶电泳分析(capillary gel electrophoresis,cge)。于一些实例中，一生物标记的存在及/或含量可使用特异性识别该生物标记的试剂来确定，例如，特异性结合该生物标记的抗体。
75.于其他具体实施例中，可通过测量一种或多种基因的mrna含量来确定生物标记的存在及/或含量。基于使用特异性识别该基因的核苷酸序列的引子或探针的测定可用于测量，其包括，但不限于，反转录酶-聚合酶连锁反应(rt-pcr)以及原位杂交(in situ hybridization,ish)，其程序在本领域中为已知的。基于目标核酸区域，本领域技术人员可以容易地设计并合成引子或探针。应当理解的是，目标基因的核苷酸序列可使用任何合适的方法设计用于本发明的合适的引子或探针，如本领域所公开者。
76.如本文所用的抗体可为多株抗体或单株抗体。通过以有效量的胜肽或抗原组成分注射合适的实验动物，从该动物收集血清，并通过任何已知的免疫吸附技术分离特定血清以制备针对特定蛋白质的多株抗体。可以容易地用于产生本发明中使用的多株抗体的动物包括鸡、小鼠、兔、大鼠、山羊、马等。
77.于特定具体实施例中，作为僵直性脊椎炎(as)生物标记的alpl基因产物为 tnap蛋白，包括骨特异性tnap(bap)，肝特异性tnap及/或肾特异性tnap。于一些具体实施例中，作为僵直性脊椎炎(as)生物标记的tnap蛋白包括骨特异性 tnap(bap)及/或肝特异性tnap。于一特定实例中，作为僵直性脊椎炎(as)生物标记的tnap蛋白为骨特异性tnap(bap)。
78.于一些具体实施例中，可将源自候选个体的样品中的生物标记的含量与标准值进行比较，以确定该候选个体是否具有僵直性脊椎炎(as)的不良预后。标准值可以代表僵直性脊椎炎(as)群体中如本文所述的生物标记的平均值或中值量。通常，选择这样的僵直性脊椎炎(as)患者群体以在例如年龄及/或种族背景下与候选个体匹配。较佳地，这种僵直性脊椎炎(as)患者群与候选个体属于同一物种。
79.当一个体(例如，人类患者)被诊断为具有不良预后时，该个体可进行进一步测试(例如，常规物理测试，包括手术活体组织切片或影像方法，例如，x射线影像、核磁共振影像(magnetic resonance imaging,mri)，或超音波)以确认疾病的发生及/ 或确定疾病的阶段及进展。
80.于一些具体实施例中，本文所述的方法可进一步包括治疗僵直性脊椎炎(as) 患者以至少缓解与疾病相关的症状。治疗可为任何常规的抗僵直性脊椎炎(as)治疗(例如，手术及/或物理治疗)及/或药物(例如，皮质类固醇、非类固醇消炎止痛药 (nsaiss)、免疫抑制剂、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)阻断抑制剂、抗介白素-6抑制剂、介白素17a抑制剂，及/或如本文所述的tnap抑制剂)。
81.还提供了一种用于实施本发明方法的试剂盒。具体而言，该试剂盒包含可以特异性检测如本文所述的(复数个)标记的试剂(例如，抗体、引子、探针，或标记试剂)。该试剂盒可以进一步说明使用该试剂盒检测生物样品中(复数个)标记的存在或含量，以预测疾病的预后及/或监测疾病的进展。包含如本文所述的检测试剂的组成分可以试剂盒的形式包装在一起。例如，检测试剂可以包装在单独的容器中，例如，核酸(引子或探针)或抗体(与固体基质结合或与试剂分开包装以将它们与基质结合)，对照试剂(阳性及/或阴性)及/或可检测标记，用于进行测定的说明(例如，书面、磁带、vcr、cd-rom等)也可包括在该试剂盒中。例如，该试剂盒的测定形式可为北方杂交分析、芯片或elisa。还提供了这种试剂用于实施预测疾病评估预后及/或监测疾病进展的方法的用途。试剂可以与载体混合，例如药学上可接受的载体，以形成用于检测或诊断目的的组合物。这种载体的实例包括可注射盐水、可注射蒸馏水、可注射缓冲溶液等。
82.另一方面，本发明基于意想不到的发现，即tnap抑制剂可作为治疗僵直性脊椎炎(as)的活性成分。因此，本发明涉及通过抑制tnap来治疗僵直性脊椎炎(as)。
83.具体而言，通过tnap抑制剂进行tnap(表现或活性)的抑制。tnap抑制剂的实例可包括核酸分子(例如，针对相应基因的反义核酸分子或针对相应核酸的小干扰rna(sirna))、多胜肽(例如，抗体)或小分子tnap抑制性化合物。
84.如本文所用，术语“小分子”是指在自然界中合成或发现的有机或无机分子，通常具有小于10,000克/摩尔，特别是小于5,000克/摩尔，特别是小于2,000克/ 摩尔，特别是小于1,000克/摩尔的分子量。于一些具体实施例中，如本文所述的小分子是指非聚合物，例如非蛋白质或核酸类、化学分子。作为tnap抑制剂的小分子的实例包括，但不限于，左旋咪唑、硫酸铍四水合物、帕米膦酸盐。
[0085][0086][0087]
本文所用的术语“治疗(动名词)”或“治疗(名词)”是指将含有一种或多种活性剂的组合物应用或施用于患有疾病的受试者，该疾病的症状或病症，或该疾病的进展的影响，目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善，促进，或影响该疾病、该疾病的症状或病症，由该疾病引起的残疾，或该疾病的进展或其症状或病症。
[0088]
本文使用的术语“有效量”是指在受治疗的受试者中赋予所需治疗效果的活性成分的量。例如，治疗僵直性脊椎炎(as)的有效量可为能够禁止、改善、减缓、减轻或预防一种或多种症状或病症或其进展的量，特别是僵直性脊椎炎(as)的射线照相特征，例如侵蚀、硬化、方形、骨赘形成、骨桥、及脊椎僵直。可使用本领域已知的方法确定并评估症状，例如，x射线或mri影像。本领域技术人员可基于本文的公开内容、已建立的方法，及其自身的经验确定每种情况下的剂量。
[0089]
于一些具体实施例中，可将有效量的活性成分与药学上可接受的载体一起配制成适当形式的医药组合物，以便递送及吸收。根据给药方式，本发明的医药组合物较佳包含约0.1％重量至约100％重量的活性成分，其中重量百分比基于整个组合物的重量计算。
[0090]
如本文所用，“医药上可接受的”是指该载体与该组合物中的活性成分兼容，且较佳地可稳定该活性成分并对接受治疗的个体而言是安全的。该载体可为该活性成分的稀释剂、载体、赋形剂或基质。合适的赋形剂的一些实例包括，乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆，以及甲基纤维素。该组合物可另外包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁，以及矿物油；润湿剂；乳化剂与悬浮剂；防腐剂，如甲基与羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；以及调味剂。本发明的组合物可在给予患者后提供该活性成分的快速、持续或延迟释放的效果。
[0091]
根据本发明，该组合物的形式可为片剂、丸剂、粉末、锭剂、小包、锭剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、软及硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液，以及包装粉末。
[0092]
本发明的组合物可通过任何生理学上可接受的途径递送，例如，口服、肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、皮下，以及腹膜内)、透皮、栓剂，以及鼻内方法。关于肠胃外给药，较佳
以无菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液与血液等渗的其他物质，例如，盐或葡萄糖。根据需要，可适当地缓冲水溶液(较佳ph值为3 至9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可以本领域技术人员熟知的标准药理学技术完成，且不需要额外的创造性劳动。
[0093]
根据本发明，可将tnap抑制剂给予有需要治疗僵直性脊椎炎(as)的受试者。因此，本发明提供了通过对有需要的受试者施用如本文所述的tnap抑制剂或含其的组合物来治疗僵直性脊椎炎(as)的方法。特别是，如本文所述的tnap抑制剂以有效量给予，可(i)抑制tnap的酶活性或表现量，以及(ii)减少或预防一种或多种症状或病症或其进展，特别是僵直性脊椎炎(as)的放射照相特征，例如，侵蚀、硬化、方形、骨赘形成、骨桥、及脊椎僵直。于一些具体实施例中，如本文所述的tnap抑制剂以基本上不降低僵直性脊椎炎(as)患者的骨密度(例如，总骨质密度 (bmd))的量施用。更具体而言，如本文所述的tnap抑制剂以在僵直性脊椎炎(as) 患者中不会导致骨质疏松症的量施用。
[0094]
于一些具体实施例中，如本文所述的tnap抑制剂可与常规抗僵直性脊椎炎 (as)治疗方法组合施用，例如，用于僵直性脊椎炎(as)的手术及/或物理疗法及/或已知药物，包括，但不限于，皮质类固醇、非类固醇消炎止痛药(nsaiss)、免疫抑制剂、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)阻断抑制剂、抗介白素-6抑制剂、介白素17a抑制剂。
[0095]
于另一方面，本发明提供一种用于产生僵直性脊椎炎(as)的非人类动物模式的方法。还提供了一种由此制备的僵直性脊椎炎(as)的非人类动物模式。
[0096]
于一些具体实施例中，该方法包括以下步骤
[0097]
(i)自僵直性脊椎炎(as)患者的患有脊椎僵直的脊椎的骨髓中提供骨髓间质干细胞(bmscs)；
[0098]
(ii)将该骨髓间质干细胞(bmscs)植入免疫缺陷非人类动物中的与腰椎节椎板相邻的区域；以及
[0099]
(iii)使该动物在适于诱导一种或多种僵直性脊椎炎(as)的症状/病症的条件下生长。
[0100]
在某些具体实施例中，该腰椎节椎板为l4至l5。
[0101]
在某些具体实施例中，该僵直性脊椎炎(as)的症状/病症包括放射照相严重程度(例如，侵蚀、硬化、方形、骨赘形成、骨桥、脊椎僵直，及其任何组合)。
[0102]
于一些具体实施例中，该动物模式为哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、猪、牛、狗，以及猴。
[0103]
根据本发明，该动物模式可用于筛选治疗僵直性脊椎炎(as)的候选药剂。
[0104]
因此，本发明进一步提供了一种方法，作为基于如本文所述的动物模式筛选候选抗僵直性脊椎炎(as)药剂的平台。
[0105]
特别是，该方法包括以下步骤：(i)对该动物模式施用测试药剂，以及(ii)测量僵直性脊椎炎(as)症状/病症中的至少一种是否减轻或缓解，其中在该动物模式中的至少一种僵直性脊椎炎(as)症状/病症的减轻或缓解通过施用该测试药剂而达成，表示该测试药剂为可用于治疗僵直性脊椎炎(as)的候选药剂。
[0106]
通过以下实例进一步说明本发明，提供这些实例是为了说明而非限制。根据本发明公开的内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可以对所公开的特定具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
[0107]
实例
[0108]
1.材料及方法
[0109]
1.1人类受试者
[0110]
根据赫尔辛基宣言，所有捐赠者在抽样前都提供了书面知情同意书。该研究方案经台北慈济医院研究伦理委员会、佛教慈济医学基金会、台北荣民总医院、台湾地区“中央研究院”(全部在中国台湾)以及英国皇家国立风湿病医院批准。
[0111]
获得的骨髓(bm)样品用于从经历脊椎截骨术(a1、a2、a3)的僵直性脊椎炎 (as)患者以及非僵直性脊椎炎对照(c1、c2、c3)中分离间质干细胞(mscs)。所有用于间质干细胞(mscs)分离的骨髓捐赠者皆为中国台湾人。此外，招募了两个独立的群组用于研究具有放射学进展倾向的高风险僵直性脊椎炎(as)患者的预测性周边血标记。“中国台湾群组”由104名患者组成，他们以及50名健康对照在台北慈济医院完成了经过修改的纽约僵直性脊椎炎(as)诊断标准。该人群的一部分(37 名僵直性脊椎炎(as)患者进行了影像学检查的回顾性追踪)包括“中国台湾群组”的纵向僵直性脊椎炎(as)次群组。“英国群组”为在英国皇家国立风湿病医院招募的184名僵直性脊椎炎(as)患者。在同一天获得临床评估以及放射学评估。临床评估包括以下内容：僵直性脊椎炎(as)疾病持续时间；血清学试验(hla-b27，c-反应蛋白或红血球沉降率)；疾病活动评分以经过验证的bath僵直性脊椎炎疾病活动指数(bath ankylosing spondylitis disease activity index,basdai；范围，0-10；评分≥4表示对疾病的控制不理想)进行评分。两个可靠的评分系统，经过验证的bath 僵直性脊椎炎放射学指数-总分(总basri)在中国台湾群组中获得，并且在两个群组中使用改良的stoke僵直性脊椎炎脊椎评分(modified stoke ankylosingspondylitis spinal score,msasss)。总basri为腰椎、颈椎、骶髂关节，以及髋关节的综合评分(范围：2-20)。在msasss中，通过在24个脊椎程度(每个脊椎程度范围0-3，范围：0-72)的评分来评估颈椎及腰椎的前部。
[0112]
还记录了bath僵直性脊椎炎功能指数(bath ankylosing spondylitis functionalindex,basfi)。其为用于确定功能限制程度的经过验证的指针，其中平均视觉仿真评分(0为“简单”且10“不可能”)用于回答测试中的问题。十个等级的平均值给出basfi评分在0到10之间的值。此外，获得了反映僵直性脊椎炎(as)对患者健康的影响的bath僵直性脊椎炎全面评分(bath ankylosing spondylitis global score, bas-g)。两个分数的平均值得出bas-g得分为0-10。分数越高，疾病对患者健康的感知效果越大。
[0113]
1.2自僵直性脊椎炎(as)患者受脊椎关节僵直影响的组织中分离骨髓间质干细胞(bm-mscs)
[0114]
分离来自三名僵直性脊椎炎(as)患者(a1、a2、a3)的脊椎关节僵直组织中的骨髓间质干细胞(bm-mscs)，所述患者经历了脊椎楔形截骨术(僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs))。在相似部位(正常间质干细胞(n mscs))经历骨髓创伤性手术的三个非僵直性脊椎炎个体(c1、c2、c3)的间质干细胞(mscs)作为对照。这些都是中国台湾人。将这些样品精细切碎并以含有抗生素-抗真菌溶液的α-最低必需培养基(α-mem；gibco公司，格兰德岛，纽约州，美国)冲洗后，以1mg/ml胶原酶d (roche公司，巴塞尔市，瑞士)消化。在37℃培养过夜后，将消化的组织通过40-μm 尼龙过滤器过滤以除去碎片。通过离心收集细胞并将之铺在培养皿中以允许其附着。通过在48小时内更换培养基然后每3天更换培养基，以去除未黏附
的细胞。当细胞长满时，收获细胞并进行继代培养。在第3代，将初级间质干细胞(mscs)的等分试样在液氮中冷冻保存并扩增用于实验。比较僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)与正常间质干细胞(n mscs)的相同继代(p3至p5代)。
[0115]
1.3间质干细胞(mscs)的特征描述
[0116]
为了分析间质干细胞(mscs)的标记的细胞表面表现，使用下列抗人类抗体标记间质干细胞(mscs)：cd31-pe、cd34-pe、cd44-pe、cd29-fitc、cd45-fitc，以及cd105-fitc(均来自ancell公司，bayport市，明尼苏达州，美国)。以小鼠同种型抗体(ancell公司)作为对照。总之，获得100,000个标记的细胞并使用 facscanto流式细胞仪(bd biosciences公司，法兰克林湖，纽泽西州，美国)进行分析。使用fcs express v3.0(de novo软件公司，葛伦代尔市，加州，美国)进行数据分析。
[0117]
为了描述间质干细胞(mscs)的三谱系分化潜能的特征，在三种培养条件下处理间质干细胞(mscs)。第一种培养条件为诱导成骨作用，其中α-mem培养基补充有10％胎牛血清(gibco公司)、50μg/ml抗坏血酸-2磷酸盐(sigma-aldrich公司，圣路易斯市，密苏里州，美国)、10nmol/l地塞米松(sigma-aldrich公司)，以及10 mmol/lβ-甘油磷酸盐(sigma-aldrich公司)。第二种培养条件为诱导脂肪形成，其中α-mem补充有10％胎牛血清、50μg/ml抗坏血酸-2磷酸盐、100nmol/l地塞米松、 50μg/ml吲哚美辛(sigma-aldrich公司)，以及10μg/ml胰岛素(gibco公司)。第三种培养条件为诱导形成软骨，其中无血清α-mem补充有50μg/ml抗坏血酸-2磷酸盐、 100nmol/l地塞米松、50mg/ml胰岛素转铁蛋白-硒预混物(gibco公司)，以及10 ng/ml转化生长因子-β1(prepotech公司，rocky hill，纽泽西州，美国)。培养基每3 天更换一次。在出现分化的形态学特征后，以4％多聚甲醛固定细胞。通过成骨培养物处理的细胞针对茜素红s(sigma-aldrich公司)进行染色以进行矿化。通过以滴定盘读取器(molecular devices公司，sunnyvale，加州，美国)在波长550nm处测量萃取的染料的光密度(od)以进行茜素红s染色的定量。在脂肪形成或软骨形成培养条件下处理的细胞则以油红o(sigma-aldrich公司)或艾尔逊蓝(alcian blue) (scytek公司，卡什县，犹他州，美国)染色以分别评估脂肪形成以及软骨形成分化。
[0118]
1.4在诱导成骨作用下tnap抑制剂治疗间质干细胞(mscs)
[0119]
将间质干细胞(mscs)以每6孔盘8
×
104个细胞接种，并于37℃，5％co2环境下培养，在有/无左旋咪唑(100μm；sigma-aldrich公司)(非竞争性tnap抑制剂)，硫酸铍四水合物(竞争性tnap抑制剂)(100μm；santa cruz生物科技公司)，或帕米膦酸盐(非竞争性tnap抑制剂)(1μg/ml；sigma-aldrich公司)的成骨诱导培养基中生长。形态分化后，对细胞进行茜素红s染色。
[0120]
1.5反转录定量聚合酶连锁反应(rt-qpcr)
[0121]
使用rneasy mini试剂盒(qiagen公司，hilden，德国)根据制造商的说明萃取总 rna。使用高容量cdna反转录试剂盒(applied biosystems公司，waltham，麻州，美国)从2μg总rna合成第一股cdna。在prism 7300序列检测系统(appliedbiosystems公司)上以sybr green pcr master mix进行rt-qpcr。使用甘油醛3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,gap dh)作为内部对照基因，根据δct方法进行标记基因的相对定量。用于rt-qpcr的特异性引子如下所示。
[0122][0123][0124]
1.6免疫墨点分析
[0125]
使用蛋白质萃取试剂(pierce公司，罗克福德市，伊利诺伊州，美国) 与蛋白酶抑制剂混合物(halt
tm
；pierce公司)制备细胞裂解物。于10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质裂解物(20-40μg)，并转移到聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difluoride,pvdf)膜上。将pvdf膜在tbst(20mm tris-hcl[ph 7.6]，137mm nacl，1％tween 20)中的5％墨点等级牛奶中封闭。然后以指定的一级抗体于4℃下侦测pvdf膜过夜，洗涤，然后以相应的二级抗体进一步侦测1小时。根据制造商的说明，通过western bright sirius化学发光检测试剂(advansta公司，门洛帕克市，加州，美国)检测免疫反应蛋白。使用las 3000系统(fujifilm公司，东京，日本)捕获化学发光信号的影像。使用的一级抗体为大鼠抗tnap抗体(1μg/ml； r&d systems公司，明尼亚波利斯市，明尼苏达州，美国)，以及兔抗gapdh抗体 (1:10000；gentex公司，西兰市，密执安州，美国)以及小鼠抗-β-肌动蛋白抗体 (1:10000；thermofisher scientific公司)。使用的辣根过氧化物酶缀合的二级抗体为山羊抗大鼠igg以及抗兔igg(均以1:5000稀释并来自sigma-aldrich公司)。免疫墨点分析实验至少进行两次。将所有蛋白质条带密度标准化为gapdh或β-肌动蛋白加载对照的那些。
[0126]
1.7细胞内碱性磷酸酶(alp)活性的测量
[0127]
荧光碱性磷酸酶(alp)活性检测试剂盒(abcam公司，剑桥，英国)用于测量细胞内碱性磷酸酶(alp)活性。简言之，将细胞(5
×
104个)在100μl测定缓冲液中匀质化，并加入4-甲基伞形酮磷酸二钠盐基质。alp裂解非荧光4-甲基伞形基磷酸酯基质的磷酸基团，产生荧光4-甲基伞形酮。30分钟后加入终止溶液，并使用荧光微量滴定盘读取器(spectramax gemini；molecular devices公司)测量激发/发射波长为 360/440nm的荧光强度。使用下式计算样品中的碱性磷酸酶(alp)活性：碱性磷酸酶(alp)活性＝a/v/t(mu/ml)其中a为样品产生的4-甲基伞形酮的量(nmol)，v为测定孔中加入的样品的体积(ml)，t为反应时间(分钟)。
[0128]
1.8慢病毒载体调节的rna干扰
[0129]
获得tnap的短发夹rna(shrna)表现质体以及细菌选殖株 (trcn0000052005，目标序列：gcgcaagagacactgaaatat，(seq id no:7)) 以及trcn0000052007，目标序列：actgccatcctgtatggcaat，(seq id no: 8))来自台湾地区“中央研究院”的rnai核心设施(中国台湾，台北)。从获自阳明大学基因组研究中心的“哺乳动物基因集合”(clone：066116)的质体切下alpl cdna片段，并以phusion high-fidelity dna聚合酶(thermo公
司)通过pcr扩增。通过在nhei以及 ecori位点(neb公司)连接将alpl片段插入plas2w.ppuro载体(rnai核心设施，台湾地区“中央研究院”)。如前所述
36,37
进行制备慢病毒载体以及转导的方法。在8μg/ml聚凝胺(sigma-aldrich公司)存在下，用5的复数的慢病毒载体转导亚汇合的间质干细胞 (mscs)。二十四小时后，以含有嘌呤霉素(1μg/ml)的新鲜生长培养基替换培养基，以筛选转导的细胞共48小时。
[0130]
1.9免疫荧光染色
[0131]
将间质干细胞(mscs)在成骨诱导下培养14天，然后以pbs冲洗两次并于室温下在4％多聚甲醛中固定20分钟，然后于室温下以0.1％triton x-100透化5分钟。然后于室温下以含有1％牛血清白蛋白的pbst阻隔细胞1小时。将小鼠抗骨钙黏蛋白抗体(1:500稀释，r&d公司)加入阻隔缓冲液中，于4℃培养过夜。以pbs洗涤细胞三次，然后与二级抗体(与alexa fluor-488缀合的山羊抗小鼠抗体)(1:400；invitrogen 公司)在室温下作用1小时。细胞核以含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(', 6-diamidino-2-phenylindole,dapi)(sigma-aldrich公司)的pbs复染色。通过共聚焦显微镜(carl zeiss lsm510)检查荧光影像，并以zeiss ec plan-neofluar 40x/1.30oildic m27捕获。
[0132]
1.10免疫组织化学染色
[0133]
用于免疫组织化学染色的bm(骨髓)切片获自三个僵直性脊椎炎(as)患者(a1、 a2，以及a3)，两个健康个体(c4、c5)以及一个非僵直性脊椎炎患者对照(c6)。非僵直性脊椎炎患者对照为接受淋巴瘤检查的骨髓活体组织切片且没有淋巴瘤的患者。其中，健康对照(c4、c5)为白人，他们的骨髓载玻片购自美国biomax公司 (rockville，马里兰州，美国)。僵直性脊椎炎(as)患者以及非僵直性脊椎炎患者对照者均为中国台湾人。将它们的骨髓组织的石蜡块切成4-μm切片并使用标准方法处理。将切片以tris/edta(ph 9)溶液(thermo fisher scientific公司)中的抗原修复试剂(antigen retrieval reagent)处理，并以含有0.1％triton x-100的磷酸盐缓冲盐水作用15分钟，然后以3％人类血清(invitrogen公司，carlsbad市，加州，美国)阻隔 30分钟。将切片与兔抗tnap抗体(1:200稀释；abcam公司)在4℃培养过夜，然后与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二级抗体(dako公司)在室温下作用1小时。通过与发色体3,3'-二氨基联苯胺(thermo fisher scientific公司)一起培养进行棕色显色。根据需要，以苏木精(thermo fisher scientific公司)对细胞核进行复染色。将切片于自来水中洗涤5分钟，脱水，并盖上盖玻片。
[0134]
对于双染色，在使用如上所述的hrp的兔抗tnap抗体(1:200稀释；abcam公司)的第一次染色显色后，然后将切片与第二种一级抗体作用：兔抗mpo抗体 (1:1000稀释，过夜反应；dako公司)用于染色骨髓谱系、小鼠抗cd68抗体(1:200 稀释，于室温下反应3小时；dako公司)用于单核细胞谱系，或兔抗cd44抗体(1:200 稀释，于4℃下过夜反应；abcam公司)用于间质干细胞(mscs)，然后在室温下与碱性磷酸酶偶联的二级抗体(1:500稀释；southernbiotech公司)作用1小时。通过与硝基蓝四唑氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，甲苯胺盐(roche公司)一起作用以使蓝色显色。将切片在自来水中洗涤5分钟，脱水，并盖上盖玻片。
[0135]
为了鉴定tnap阳性细胞，通过使用具有metamorphic offline第7.8.2.0版软件的光谱影像技术来说明tnap/mpo、tnap/cd68，以及tnap/cd44阳性细胞的共定位。在使用光谱库进行光谱分离(以棕色的tnap抗体染色；以蓝色的另一种二级抗体染色)后，创建复合伪
彩色影像，其中tnap/mpo、tnap/cd68，以及 tnap/cd44的共定位表示为绿松石色。
[0136]
1.11动物模式
[0137]
动物实验方案经台北慈济总医院动物照护暨使用委员会批准。nod-scid小鼠(8-10周龄)购自biolasco公司(中国台湾，台北)并维持在无特定病原体的环境中。将人类间质干细胞(mscs)以β-甘油磷酸盐处理培养5天，包埋在纤维蛋白(106个细胞在5μl纤维蛋白中)(baxter公司，维也纳，奥地利)中并植入与nod-scid小鼠腰椎节l4至l5的右侧椎板相邻的区域中。使用镊子将腰椎椎板剥离。手术后对小鼠喂食0.9％磷酸盐饮食(dyets公司，伯利恒市，宾州，美国)。植入后3周进行针对腰椎的微型计算机断层扫描(skyscan 1076；kontich市，比利时)。以僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)植入nod-scid小鼠后，通过微型计算机断层扫描测量股骨上的骨质密度，每日口服h2o左旋咪唑(10mg/kg)、硫酸铍四水合物(7.5mg/kg)，或帕米膦酸盐(0.3mg/kg)，持续12周。通过bruker ct-volume第2.0版软件获得新骨骼接合的定量。
[0138]
1.12血清bap含量的测量
[0139]
将来自人类受试者的血液样品收集到edta处理的试管中。收集血清用于通过 liason分析仪使用diasorin liason bap ostase分析(一步延迟添加夹心化学发光免疫分析)测量骨特异性tnap(bap)的含量。根据制造商建议，血清bap含量在5.1-20.2μg/l之间的参考范围被认为是正常的。
[0140]
1.13细胞激素释放
[0141]
在成骨诱导下培养间质干细胞(mscs)以确定细胞激素的产生。于第3、7，以及10天收获上清液。使用human milliplex试剂盒(merck millipore公司，比乐瑞加镇，麻州，美国)根据制造商的说明检测细胞激素。数据通过luminex 200仪器(luminex，奥斯汀市，德州，美国)获得，并通过milliplex analyst第5.1版(merck millipore公司) 分析。
[0142]
1.14微数组分析
[0143]
于第0、3，以及7天在成骨诱导下从僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)以及正常间质干细胞(n mscs)制备总rna，并用于台湾地区“中央研究院”grc微数组核心设施的人类微数组芯片(affymetrix公司，圣塔克拉拉市，加州，美国)。以3
′ꢀ
ivt express试剂盒(thermo scientific公司，沃尔瑟姆市，麻州，美国)进行反转录，生物素缀合的核苷酸掺入/片段化，以及将线性rna转化成35-200nt的生物素标记的片段的顺序程序。然后，将样品与genechip human genome u133 plus 2.0数组杂交。使用fluidics station 450(thermo scientific公司)进行数组的洗涤与染色，并以 genechip scanner 3000(thermo scientific公司)获取数组数据。最后，通过 genespring gx v12(agilent technologies公司，圣塔克拉拉市，加州，美国)分析数组数据。
[0144]
1.15统计分析
[0145]
数据显示为平均值
±
平均值的标准误差(sem)或平均值
±
标准偏差(sd)。通过学生氏t检验，mann-whitney u检验或fisher精确检验分析数据。以spearman等级相关性检验确定变量之间的相关性。p《0.05被认为是显著的。通过spss或prism v6.01 分析数据。
[0146]
2.结果
[0147]
2.1成骨诱导下僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)加速矿化的病理表型为 runx2非依赖性
2j)。此外，在正常间质干细胞(nmscs)中通过慢病毒转导的tnap过表现显示增强的矿化(图2k-2m)。我们在β-甘油磷酸盐(tnap的基质)
21
的存在下在生长培养基(gm)中进一步培养间质干细胞(mscs)(图5)。正如所料，在生长培养基(gm)中培养的正常间质干细胞(nmscs)没有钙化。然而，在僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)中添加β-甘油磷酸盐显示出比在正常间质干细胞(nmscs)中更高的矿化速率，表示僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)中tnap的表现增加足以在其基质存在下诱导加速矿化。总之，这些结果表示tnap的增强表现对于僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)中的加速矿化是必需的。
[0152]
2.3tnap阻断抑制由nod-scid小鼠中的僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)诱导的新骨结合
[0153]
接下来，我们建立了一种基于僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)的体内疾病模型，以仿真病理性骨骼接合，可用于测试tnap抑制剂的治疗潜力。值得注意的是，在nod-scid小鼠体内与腰椎节l4-5的右侧椎板相邻处植入僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)，而非正常间质干细胞(nmscs)，形成了新的骨骼接合(图3a)。此外，相较于对照shrna转导的僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)，若tnap被shrna沉默，则通过植入僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)诱导的异位骨结合被阻断(图3b)。一致地，口服施用tnap抑制剂在很大程度上消除了植入僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)的nod-scid小鼠中的新骨骼接合(图3c)，但没有改变总体骨质密度(bmd)(图6)。图3d所示为各组间新骨骼接合的定量体积。这些结果表示，tnap阻断可抑制nod-scid小鼠中僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)诱导的新骨骼结合。
[0154]
2.4血清骨特异性tnap含量与僵直性脊椎炎(as)患者的放射照相严重程度显著相关，并有可能成为评估预后标记
[0155]
接下来，我们想知道在僵直性脊椎炎(as)患者的骨髓或周边血中是否可以检测到tnap的增强表现。相较于健康个体(图4a)以及非僵直性脊椎炎(as)患者对照(图7)，骨髓样品的免疫组织化学(ihc)染色显示僵直性脊椎炎(as)患者的骨髓中tnap的表现增加。免疫组织化学(ihc)双染色显示大多数tnap阳性细胞为骨髓(髓过氧化物酶

)、单核细胞(cd68

)谱系，或间质干细胞(mscs)(cd44

)(图4b、4c、4d)。此外，我们使用来自两个独立群组的样品来测量骨特异性tnap(bap)的血清含量，以排除来自肝脏及肾脏的tnap干扰，而非血清tnap：一个为中国台湾群组，其中包括104名僵直性脊椎炎(as)患者以及50名健康对照，另一为包含184名僵直性脊椎炎(as)患者的英国群组。表1-3所示为此二群组的人口统计学特征以及次群组/群组之间的比较差异。中国台湾与英国群组中血清bap含量升高(》20.2μg/l)的僵直性脊椎炎(as)患者百分比分别为9.61％以及25.54％。总体而言，中国台湾群组中僵直性脊椎炎(as)患者血清bap含量显著高于健康对照组(12.954
±
5.538μg/l，以及6.296
±
2.110μg/l；p《0.001)，而英国群组的血清bap含量为17.607
±
8.055μg/l。
[0156]
表1：“中国台湾群组”中bap含量正常与升高的僵直性脊椎炎(as)患者的特征
[0157][0158][0159]
数值显示为平均值(标准偏差：sd)。p由具有正常及增加的bap的僵直性脊椎炎 (as)患者之间的mann-whitney u或fisher精确检验确定。*具有统计学意义。
[0160]
表2：“英国群组”中具有正常及增加的bap含量的僵直性脊椎炎(as)患者的特征
[0161][0162]
数值显示为平均值(sd)。
[0163]
p值由mann-whitney u检验或具有正常及增加的bap的僵直性脊椎炎(as)患者之间的fisher精确检验确定。
[0164]
*具有统计学意义。
[0165]
表3：“中国台湾群组”中僵直性脊椎炎(as)患者与健康对照的人口统计学
[0166][0167]
数值显示为平均值(sd)。
[0168]
p值由mann-whitney u检验或fisher精确检验确定。
[0169]
*具有统计学意义。
[0170]
然后，我们测试了血清bap含量是否与临床参数相关。通过bath僵直性脊椎炎放射学指数-总分(bath ankylosing spondylitis radiology index-total score,总basri)或改良的stoke僵直性脊椎炎脊椎评分(modified stoke ankylosingspondylitis spinal score,msasss)测量放射照相严重程度。值得注意的是，僵直性脊椎炎(as)患者的血清bap含量与放射学严重程度之间存在显著正相关(两个群组的msasss的p《0.05；中国台湾群组的总basri-的p《0.001；英国群组未记录总 basri)(表4a)。同样地，为了阐明可用于预测僵直性脊椎炎(as)患者的影像学严重程度的危险因素，使用各种模型进行多变量回归
分析。这些结果显示，血清bap 含量、患病时间，以及crp为中国台湾群组的独立危险因素；而在英国群组中，血清bap含量、患病时间，以及男性性别为独立危险因素(表4b)。值得注意的是，无论分析的模型如何不同，血清bap含量以及患病时间都是两种常见的预测因子。接下来，我们分析了来自37名僵直性脊椎炎(as)患者的数据，这些患者在中国台湾群组中回顾性地进行了影像学改变的纵向追踪(表5)。在这个纵向僵直性脊椎炎 (as)次群组成分析中，我们发现血清bap含量以及crp是预测僵直性脊椎炎(as) 患者年度影像学进展的两个独立危险因素(表4c)。总之，中国台湾及英国群组的分析显示，血清bap含量可能为具有脊椎僵直高风险的僵直性脊椎炎(as)患者的评估预后生物标记。
[0171]
表4a.斯皮尔曼等级相关检验对血清bap浓度与临床参数的相关性分析。
[0172][0173][0174]
表4b.用于评估“中国台湾群组”以及“英国群组”僵直性脊椎炎(as)患者放射照相严重程度(msasss)预测因子的多元回归分析
[0175][0176][0177]
表4c.用于评估“中国台湾群组”纵向僵直性脊椎炎(as)次群组年度影像学进展预测因子的多元回归分析。*
[0178][0179]
表5：纵向僵直性脊椎炎(as)次群组的人口统计学与“中国台湾群组”中的放射照相进展的回顾性追踪
[0180][0181]
值显示为平均值(sd)。
[0182]
3.总结
[0183]
我们在此从脊椎截骨术后僵直性脊椎炎(as)患者的僵直脊椎关节组织骨随中建立了间质基质细胞(as msc)，其可用于研究成骨过程中间质祖细胞的活化，以及潜在的基于细胞的平台鉴定药物，用于解决僵直性脊椎炎(as)患者的关节僵直。本发明中衍生的僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)显示出成骨诱导后加速矿化的异常表型，其中组织非特异性碱性磷酸酶(tnap)活性高度表现。当植入 nod-scid小鼠的脊椎中时，本发明中衍生的僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs) 可以诱导动物的异位骨接合，作为良好的动物模式。
[0184]
重要的是，通过其非竞争性化学抑制剂，例如，左旋咪唑或含氮二磷酸盐(例如，帕米膦酸盐)阻断tnap将抑制培养物中僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs) 的这种异常矿化。在口服左旋咪唑或帕米膦酸盐后，在nod-scid小鼠中植入僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)引起的异位骨骼接合将被阻断。有趣的是，左旋咪唑几年来一直被作为除虫剂
25
。一些研究记载指出，左旋咪唑可以通过对t调节细胞提出的作用轻微地减少僵直性脊椎炎(as)患者的发炎
26-29
。然而，尚未探索其通过tnap抑制阻断同时形成的临床应用。在我们的实验中，左旋咪唑的长期治疗并未影响治疗小鼠的骨密度。此外，另一关键的前景为开发一种皆具对tnap抑制以及骨质疏松症有预防作用的两用药物，其中含氮二磷酸盐(如，帕米膦酸盐)值得探索
23
。虽然二磷酸盐通过抑制破骨细胞骨吸收已广泛用于骨质疏松症治疗，但它们也可通过螯合mg
2
/zn
2
及其骨钩结构抑制tnap酶
23
。有趣的是，我们的数据发现，帕米膦酸盐不仅阻断了成骨诱导下僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)的增强矿化，而且还抑制了基于僵直性脊椎炎间质干细胞(as mscs)的动物模式中新的骨骼接合。尽管已提出帕米膦酸盐的临床应用通过其抗发炎作用来控制僵直性脊椎炎 (as)疾病活性
30-35
，例如调节巨噬细胞/单核细胞谱系中的促发炎细胞激素，但只有一项研究显示其对降低血清bap含量的
作用
34
。在现有技术中，没有可用的数据表示其对阻断骨赘形成的影响。
[0185]
因此，这里建立的僵直性脊椎炎间质干细胞(asmscs)可以作为探索未来僵直性脊椎炎(as)患者解决脊椎融合问题的潜在治疗效果的有用平台。
[0186]
我们还证明，高血清tnap/或骨特异性alp(bap)含量与僵直性脊椎炎(as)患者的放射学严重程度显著相关，这将成为预测未来僵直性脊椎炎(as)患者脊椎僵直高风险的潜在评估预后生物标记。这一发现可能对临床医生早期识别具有潜在易x射线进展的僵直性脊椎炎(as)患者的高风险组非常有帮助，进一步结合通过口服左旋咪唑或选择性tnap抑制剂的早期治疗将预示到阻止僵直性脊椎炎(as)患者的脊椎僵直的潜在功效。
[0187]
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