猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用的制作方法

猕猴桃溃疡病感病基因acbxl1及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及猕猴桃溃疡病感病基因acbxl1 及其应用。


背景技术：

2.猕猴桃属猕猴桃科猕猴桃属，是上世纪驯化最为成功的水果之一，其富含膳食 纤维和维生素c，营养丰富，经济价值高。我国是猕猴桃属植物的起源地和分布中心， 栽培面积居世界之首，在我国农业供给侧改革、精准扶贫、乡村振兴及生态保护中 发挥重要作用。然而，由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv. actinidiae，psa)引起的猕猴桃溃疡病已在全国猕猴桃产区扩散蔓延，成为影响猕猴 桃产业发展的“卡脖子”问题。
3.溃疡病主要危害猕猴桃属中华猕猴桃和美味猕猴桃，但品种之间抗病性差异显 著。新西兰利用有性杂交，培育出黄肉型耐溃疡品种
‘
zesy002’(阳光金果 g3)代替易感溃疡品种
‘
hort16a’取得了巨大成功，在有效控制溃疡病的同时，经 济价值也大幅提升，迅速占领了全球猕猴桃高端市场。可见，抗病种质资源的挖掘 与创制是解决猕猴桃溃疡病问题的关键，研究猕猴桃抗溃疡病的调控机制是一个重 大的科学问题。我国现有栽培品种达180种，但是整体上主栽品种对猕猴桃溃疡病较 为敏感。猕猴桃遗传高度杂合，前人对猕猴桃如何调控抗病的分子机理缺乏系统了 解。因此，借鉴模式作物的研究结果，挖掘猕猴桃应答溃疡病的重要基因及调控元 件，构建分子网络，提升猕猴桃抗溃疡病的认知水平，为保障我国猕猴桃产业健康 稳定发展奠定理论、技术和材料基础。
4.猕猴桃溃疡病菌可以长时间附生于猕猴桃叶片、花蕾等表面，通过自然孔口、 伤口等侵入并快速繁殖，随后进入茎叶等维管组织系统(gao et al.2016；donati et al. 2018)。植物细胞壁是抵御大多数病原菌侵染的第一道动态结构屏障(qiao and dixon2014；et al.2018)，其主要成分包括纤维素、果胶、半纤维素、木质素和 结构蛋白等。在病原菌诱导下，植物会发生细胞壁木质素沉积(zhao and dixon 2011； hu et al.2018)、胼胝质积累(luna et al.2010)、活性氧迸发、结构改变(vorwerket al.2004)和植保素合成等(ahuja et al.2012)。同时，细菌会分泌酶和毒素等来 克服、抑制或干扰植物细胞壁介导的抗病性以建立侵染关系。营腐生病原细菌，如 软腐病菌(erwinia spp.)，产生各种细胞壁降解酶，分解植物细胞壁，建立侵染关 系(toth and birch 2005)；营活体或半活体寄生病原细菌利用一些效应蛋白来抑制 细胞壁介导的防卫反应，如在丁香假单胞菌(p.syringae)中非常保守的效应蛋白cel 可以抑制水杨酸(sa)介导的细胞壁抗性(debroy et al.2004)。
5.以链霉素、四环素和春雷霉素等抗生素类，硫酸铜等铜制剂类和噻霉酮是目前 猕猴桃溃疡病最有效的防治药剂，但因抗药性及病菌可侵入猕猴桃枝干木质部等问 题造成一旦侵染，药剂很难防控(colombi et al.2017)。因此，亟需开发新的植物溃疡 病防治方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供猕猴桃溃疡病感病基因acbxl1及其应用。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供猕猴桃溃疡病感病基因acbxl1， 其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
8.(a)由seq id no:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
9.(b)seq id no:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等 功能的由(a)衍生的蛋白质。
10.基因acbxl1是从猕猴桃品种
‘
金魁’中克隆获得的，其核苷酸序列如seq idno:1所示。
11.启动子gus染色结果显示，基因acbxl1主要表达于猕猴桃的根、茎中，而这些 部位正好是溃疡病主要危害部位。
12.第二方面，本发明提供含有所述基因acbxl1的生物材料，所述生物材料包括但 不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植 物部分。
13.第三方面，本发明提供所述基因acbxl1或含有该基因的生物材料在制备转基因 植物中的应用。
14.第四方面，本发明提供所述基因acbxl1在猕猴桃抗溃疡病育种中的应用。
15.本发明中，所述溃疡病由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringaepv.actinidiae，psa)导致，优选具有强致病力的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种致病 类型3(biovar 3)。
16.第五方面，本发明提供易感溃疡病的转基因植物的制备方法，所述方法包括： 在植物中过表达所述基因acbxl1；
17.所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
18.1)通过导入具有所述基因的质粒；
19.2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
20.3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
21.4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
22.5)通过导入增强子。
23.所述植物包括但不限于猕猴桃、烟草、番茄。
24.携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna 转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998， method for plant molecular biology viii，academy press，new york，第411
‑
463页； geiserson和corey，1998，plant molecular biology，2
nd edition)。
25.第六方面，本发明提供易感溃疡病的猕猴桃的制备方法，所述方法包括：将所 述基因acbxl1构建到植物表达载体上，所得重组表达载体通过农杆菌介导法转化猕 猴桃。
26.优选地，所述植物表达载体为pcambia1300。
27.优选地，基因acbxl1受35s启动子驱动表达。
28.第七方面，本发明提供用于扩增所述基因acbxl1的pcr引物，包括序列如seqid no:3所示的上游引物和如seq id no:4所示的下游引物。
29.第八方面，本发明提供猕猴桃溃疡病感病基因acbxl1启动子，其序列为：
30.i)seq id no:5所示的核苷酸序列；或
31.ii)seq id no:5所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 具有相同功能的核苷酸序列；或
32.iii)在严格条件下与seq id no:5所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列， 所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃ 下杂交，并用该溶液洗膜；或
33.iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷 酸序列。
34.第九方面，本发明提供所述启动子在调控下游基因表达中的应用，所述下游基 因包括但不限于基因acbxl1，报告基因gfp。
35.本发明通过对猕猴桃基因组和转录组分析，成功获得猕猴桃acbxl1基因序列， 通过瞬时表达和稳转的遗传转化实验，证实基因acbxl1具有对溃疡病的感病性，其 对猕猴桃溃疡病病菌发病具有显著促进作用，为猕猴桃抗病育种提供新思路，为后 续植物溃疡病的防治工作奠定基础。
附图说明
36.图1为本发明较佳实施例中猕猴桃组培叶片接种溃疡病后的acbxl1基因的表达 分析。其中，左图和右图分别对应抗病品种
‘
金魁’和感病品种
‘
红阳’。ck：未 处理的猕猴桃组培苗叶片；cl：psa处理1、6、12、24、48、96h的猕猴桃组培苗叶 片。
37.图2为本发明较佳实施例中acbxl1基因猕猴桃叶片瞬时表型。其中，ck：猕猴 桃叶片注射无菌水；psa：猕猴桃叶片注射psa菌液；acbxl1：猕猴桃叶片注射 p1300
‑
35s
‑
acbxl1
‑
gfp菌液；psa acbxl1：猕猴桃叶片注射psa和 p1300
‑
35s
‑
acbxl1
‑
gfp混合菌液。
38.图3为本发明较佳实施例中猕猴桃叶片溃疡病的含量。其中，psa：猕猴桃叶片注 射psa菌液；psa acbxl1：猕猴桃叶片注射p1300
‑
35s
‑
acbxl1
‑
gfp菌液。
39.图4为本发明较佳实施例中acbxl1在转基因猕猴桃中的表达情况。
40.图5为本发明较佳实施例中野生型和acbxl1转基因猕猴桃叶片接种psa表型。其 中，ck为p1300空载对照，acbxl1
‑
acbxl4为p1300
‑
35s
‑
acbxl1
‑
gfp四个转基因株系。
41.图6为本发明较佳实施例中acbxl1基因启动子烟草叶片gus染色结果。
42.图7为本发明较佳实施例中psa诱导acbxl基因启动子烟草叶片gus染色结果。
43.图8为本发明较佳实施例中acbxl1基因启动子果实gus染色结果。
44.图9为本发明较佳实施例中acbxl1基因启动子稳定转化番茄gus染色结果。其 中，a为番茄整株植物，b、c、d为番茄的茎、叶、根。
45.图中，不同小写字母表示差异显著。
具体实施方式
46.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施 例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw, molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
47.以下实施例中涉及的pcambia1300载体、猕猴桃品种
‘
金魁’、
‘
红阳’，以 及其他各
种试剂均为市售。
48.以下实施例中使用的psa为猕猴桃溃疡病菌，菌株jf8分离自安徽省岳西县主簿镇
ꢀ‘
金丰’猕猴桃叶片，mlst研究证实该病菌为丁香假单胞猕猴桃致病变种的致病类 型3，为我国猕猴桃溃疡病的主要致病类型(he et al)，该菌株现保存于中国典型培 养物保藏中心(cctcc ab2018305)。jf8菌株可参见rong he
#
,pu liu
#
,bing jia, shi
‑
zhou xue,xiao
‑
jie wang,jia
‑
yong hu,yosef ai shoffe,giorgio m balestra,lorenzogallipoli,angelo mazzaglia,li
‑
wu zhu
*
.genetic diversity of pseudomonas syringaepv.actinidiae strains from different geographic regions in china.phytopathology.2019, 109：347
‑
357。
49.实施例1感溃疡病基因acbxl1的获得及序列分析
50.1、acbxl1基因转录组和荧光定量分析
51.荧光定量实验处理：本试验材料取自抗病猕猴桃品种
‘
金魁’和感病猕猴桃品种
ꢀ‘
红阳’组培苗。用无菌水作对照，用od
600
＝0.6的psa菌液分别处理组培苗1h、6h、12 h、24h、48h、96h后放
‑
80℃冰箱保存样品。
52.通过对抗病品种
‘
金魁’和感病品种
‘
红阳’的转录组分析，挑选出在
‘
金魁
’ꢀ
中下调，
‘
红阳’中上调的基因acbxl1。通过对
‘
金魁’和
‘
红阳’猕猴桃组培叶 片接种psa菌液1h、6h、12h、24h、48h和96h后，分别对
‘
红阳’和
‘
金魁’的acbxl1 基因的表达量用qrt
‑
pcr技术分析(图1)。
‘
金魁’猕猴桃组培苗接种psa后，与对 照相比，接种psa后acbxl1基因表达经历了先上调后下调的过程，在6h表达量达到最 大值，而后一直很低。与对照相比，96h后acbxl1基因的表达量低于对照。
‘
红阳
’ꢀ
猕猴桃组培苗接种psa后，acbxl1基因的表达量先下调后上调，在48h达到最大值， 最终96h表达量也高于对照。总体来说，acbxl1基因在抗病品种
‘
金魁’品种中下调， 在感病品种
‘
红阳’中上调。这与转录组数据表达趋势一致。
53.2、基因acbxl1全长cdna序列的获得
54.使用rna试剂盒提取
‘
金魁’猕猴桃叶片的rna。根据基因组结合转录组数据 获取猕猴桃acbxl1基因cds完整序列，用primer 5.0软件设计全长引物。cdna为模 板，进行pcr扩增，优化后的反应体系如下：
55.cdna2.0μlprimer
‑
f(10μm)2.0μlprimer
‑
r(10μm)2.0μli
‑
5酶25.0μlddh2o19.0μl总体积50.0μl
56.注：i
‑
5酶购自北京擎科生物科技有限公司。
57.pcr扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min， 35次循环；72℃再延伸10min，4℃保存。
58.3、基因acbxl1序列分析
59.猕猴桃acbxl1基因cds长2202bp(seq id no:2)，编码734个氨基酸(seq idno:1)。在protparam网站分析acbxl1基因理化性质，缬氨酸(11.6％，85个)在acbxl1 蛋白中含量相对最多，色氨酸(1.5％，11个)在acbxl1蛋白中含量相对最少，带正 电荷总残基数(asp
glu)共59个。该蛋白预测分子式为c
6517
h
10834
n
2202
o
2749
s
438
，相 对分子量为177819.83da，原子总数为22706，推测其理论半衰期为4.4h，蛋白为不稳 定蛋白。
60.实施例2感溃疡病基因acbxl1的遗传转化
61.1、acbxl1基因p1300载体的构建(用于基因的瞬时表达和转基因猕猴桃)
62.根据pcambia1300载体的功能，将目的基因插入到35s启动子之后，载体自带 egfp标记基因，同时满足亚细胞定位和基因超表达的功能。根据p1300载体可供选 择的酶切位点(xba i和bamh i)，利用诺唯赞提供的软件(ce design v1.04)设计 出如下同源臂引物：
[0063][0064]
使用同源加酶切位点的引物对重新pcr扩增目的基因片段，片段纯化并测其浓 度。扩增体系如下：
[0065]
cdna2.0μlacbxl1
‑
xba i
‑
f(10μm)2.0μlacbxl1
‑
bamh i
‑
r(10μm)2.0μli
‑
5酶25.0μlddh2o19.0μl总体积50.0μl
[0066]
同时，对pcambia1300空载大肠杆菌进行活化后摇菌提取质粒，检测浓度，按 照如下体系进行双酶切操作：
[0067]
pcambia1300质粒2.0μgxba i2.0μlbamh i2.0μl10
×
green buffer4.0μlddh2o补齐至总体积40.0μl
[0068]
在水浴锅中37℃酶切1.0h，结束置于65℃、5min使酶失活。1.5％琼脂糖凝胶电 泳进行检测，纯化回收目的片段。
[0069]
根据诺唯赞提供的软件(ce design v1.04)计算其片段和载体片段的加入量。 连接体系如下：
[0070]
pcambia1300片段200ng目的基因片段68ng5
×
ce ii buffer4.0μlexnase2.0ulddh2o补齐至总体积20.0μl
[0071]
将混合物置于pcr仪中37℃、30min连接，反应结束后转化到大肠杆菌感受态细 胞trans1
‑
t1，并进行重组子筛选和测序验证。对经测序验证正确的阳性重组子菌液 中吸取0.5μl在5ml lb(含kan)液体培养基中37℃、200rpm过夜震荡培养，使用质 粒回收试剂盒提取大肠杆菌中的p1300
‑
35s
‑
jk
‑
acbxl1
‑
gfp质粒。将重组质粒 p1300
‑
35s
‑
acbxl1
‑
gfp、转
放25℃培养箱一周后观察发病情况，如图5所示，转基因猕猴桃叶片发病面积明显大 于野生型猕猴桃叶片。说明acbxl1基因可加速猕猴桃感病。
[0085]
实施例3 acbxl1基因启动子活性分析
[0086]
1、p1391z启动子载体的构建
[0087]
首先使用诺唯赞公司的ce design v1.04软件对测序正确的acbxl1基启动子序列 设计酶切引物(表1)。用克隆出正确序列的acbxl1基因启动子菌液划板、挑单、摇 acbxl1启动子菌液，以acbxl1启动子菌液为模板，用kod酶进行高保真pcr扩增， pcr反应结束后在pcr管中中加入10μl 6
×
loading buffer吸打混匀，用于后续电泳检 测和并切胶回收。
[0088]
表1启动子载体构建所需引物
[0089][0090]
用takara公司的快切酶quickcut
‑
bamhi和quickcut
‑
ecori对pcambia 1391z载体的 酶切位点bamhi和ecori进行双酶切，电泳检测得到目条带后，胶回收线性化载体 pcambia 1391z。
[0091]
重组反应使用hieffplus one step cloning kit酶，将插入片段acbxl1启动 子与线性化载体pcambia 1391z进行重组反应，反应结束后，将重组产物转化到大肠 杆菌里，对得到的单菌落用pcr鉴定、送去测序。acbxl1基因启动子序列如seq idno:5所示。
[0092]
2、acbxl1基因启动子活性烟草瞬时表达(瞬转)
[0093]
用温室培养的本氏烟草进行p1391
‑
acbxl1
‑
gus启动子活性的瞬时表达，使用前 两天对烟草控水处理。活化p1391
‑
gus阴性对照、p1391
‑
acbxl1
‑
gus菌液、p1391
‑
35s
‑
gus阳性对照，在超净台挑取单克隆，置于30ml yeb kan rif的锥形瓶 中，将锥形瓶放入28℃培养箱过夜震荡培养。用gus侵染液重悬菌液，5500rmp离心 8min，重复2
‑
3次，调至od
600
＝0.6。为了复苏菌液，需要将p1391
‑
acbxl1
‑
gus侵染 液放28℃培养箱震荡培养1
‑
2h。选择烟草叶片大小、生长状况一致、叶面平整的叶片， 从叶背面注射p1391
‑
acbxl1
‑
gus侵染液，注满整片叶子。试验完成后把烟草植株避 光处理两天，而后进行染色处理。
[0094]
使用培养6
‑
7周后的本氏烟草叶片进行瞬时表达，将带有gus表达序列的acbxl1 启动子菌液注射到本氏烟草叶片中，以pc1391z
‑
gus载体为阴性对照，插入35s启动 子的pc139z1
‑
gus载体为阳性对照，在37℃培养箱暗培养48h后浸泡在gus染色中。 2天后，用75％的酒精脱色6h，再用90％的酒精脱色48h,直到完全脱去叶片的叶绿素。 图6结果显示，阴性对照pc139z1
‑
gus经gus染色液染色后没有蓝色， pc139z1
‑
35s
‑
gus阳性对照呈现深蓝色，pc1391z
‑
acbxl1
‑
gus基因启动子呈蓝色， 说明acbxl1基因启动子在叶片中具有活性。
[0095]
3、psa病菌诱导后启动子烟草叶片的瞬时表达
[0096]
将psa菌液与acbxl1启动子菌液1:1混合后对本氏烟草叶片进行瞬时表达，以 pc1391z
‑
gus载体为阴性对照，插入35s启动子的pc139z1
‑
gus载体为阳性对照，暗 培养48h后浸泡在gus染色中。图7结果显示，经psa病菌介导的pc1391z
‑
acbxl1
‑
gus 基因启动子染
色后呈蓝色，且颜色比pc1391z
‑
acbxl1
‑
gus基因启动子颜色更深。
[0097]
4、acbxl1基因启动子猕猴桃果实的瞬时表达
[0098]
将od
600
＝0.6的p1391
‑
acbxl1
‑
gus的重悬液用注射器注射到猕猴桃果实中，在 37℃培养箱暗培养2天后，将猕猴桃果实浸泡在gus染色液中染色。2天后，先用75％ 的酒精脱色6h，再用90％的酒精脱色2天。结果见图8，阴性对照pc139z1
‑
gus经gus 染色液染色后没有蓝色，pc139z1
‑
35s
‑
gus阳性对照呈现深蓝色， pc1391z
‑
acbxl1
‑
gus基因启动子呈蓝色，说明acbxl1基因启动子在猕猴桃果实中具 有活性。
[0099]
5、农杆菌介导番茄的遗传转化(启动子稳转番茄)
[0100]
野生型番茄(lycopersicon esculentum nudicaulis)种子放在37℃培养箱用无菌水 浸泡8h后拿出待用。在无菌超净台进行以下所有操作：将种子放入无菌组培瓶中， 用5ml移液枪吸取75％的酒精,浸泡3
‑
5min，给番茄种子表面消毒；将番茄种子移入新 的无菌组培瓶中，用无菌水冲洗番茄种子3
‑
5次，洗去番茄种子表面的酒精；再用15％ 次氯酸钠浸泡番茄种子5
‑
10min，无菌水冲洗3
‑
5次，洗去种子表面的次氯酸钠溶液； 最后把番茄种子放在灭菌的滤纸上，直到吸干种子表面的多余的水分。把种子移入 1/2ms培养基中，用黑布盖上，暗培养3
‑
5天后放在组培室正常培养。1
‑
2周后，番茄 成苗。
[0101]
待番茄成苗后，将番茄组培苗的叶子和茎切成1cm
×
1cm的叶盘并且去除生长 点，放到ms 1mg.l
‑1zt 1mg.l
‑1iaa的培养基上，用黑布盖住，暗培养2
‑
3d。2 天后，拿出叶盘，将预培养过的叶片和茎放到番茄侵染液里侵染4
‑
5min，转移到无 菌的滤纸上，吸干多余的农杆菌，放到ms 1mg.l
‑1zt 1mg.l
‑1iaa的培养基上 进行共生培养，用黑布盖住暗培养2天。2天后用无菌水冲洗，洗去番茄叶片和茎上 残留的农杆菌，放在无菌滤纸上，吸去多余的水分后转移到到ms 1mg.l
‑1zt 1 mg.l
‑1iaa 500mg.l
‑1cef 3mg.l
‑1hyg的培养基上进行筛选培养，每隔20天换一 次培养基，直至长出愈伤组织和芽。最后转移到ms 0.1mg.l
‑1iaa 250mg.l
‑1cef 3mg.l
‑1hyg的番茄生根培养基中生长。长出根后移栽到营养土中。
[0102]
将p1391
‑
acbxl1
‑
gus通过农杆菌介导法转基因番茄，得到番茄的转基因的阳性 植株。通过对整株植物的gus染色，图9结果显示，acbxl1基因启动子在根茎叶中均 表达，在叶片中表达量较低，而在茎和根中表达量较高。
[0103]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。