水稻耐高温基因TT1的KASP标记开发及其应用的制作方法

水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发及其应用
技术领域
1.本发明涉及水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发及其应用，属于基因生物技术领域。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa)是我国重要的粮食作物，其种植面积占粮食作物种植总面积的30％。水稻不仅是我国人民的主粮，还是我国重要的工业加工原料，常用于制作淀粉、酿酒、制醋及医药用；同时，稻杆还是良好饲料及造纸原料和编织材料(张治波.浅谈水稻种植重要性[j].农家科技旬刊,2014,005:112-112.)。因此，水稻对我国民生保障有着重要的战略意义，水稻稳产提产是我国研究的重要方向。
[0003]
近年来，高温热害已经成为影响水稻生产的重要自然灾害，长江中下游作为主要的水稻产区也成为高温热害的重灾区。培育耐高温水稻是解决这一问题的重要途径，利用耐高温基因连锁分子标记在水稻苗期从dna水平对目标植株进行高温耐性选择，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，是提高耐高温水稻育种效率的有效途径(tanksley等，rflp mapping in plant breeding:new tools for an old science.1989,biotechnology,7:257-263)。目前，部分耐高温基因已被挖掘，如ostt1基因(胡雪娇,程灿,涂荣剑,等.水稻耐高温tt1基因的功能标记的开发与应用[j].分子植物育种,2019,v.17(22):148-153.)。上述基因也已开发了连锁的分子标记，然而ssr标记、indel标记或caps标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率低，还可能会产生气溶胶污染环境，不适用于高通量的分子检测平台。
[0004]
kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测snp位点和indel位点。与ssr、rflp、indel等分子标记相比，kasp标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻粒型kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，提高我国水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
[0006]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发，所述分子标记是与水稻耐高温基因tt1紧密连锁的kasp标记kasp_tt1，所述kasp_tt1是水稻基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或g，为序列表中seq id no.4的第101位核苷酸。
[0007]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发在c1、c2、c3或c4中的应用：
[0008]
所述c1为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性中的应用；
[0009]
所述c2为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定耐高温水稻产品中的应用；
[0010]
所述c3为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
[0011]
所述c4为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在选育耐高温的水稻资源中的应用。
[0012]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发的应用，提供一种鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性的方法，包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性；所述基因型为水稻基因组中kasp_tt1位点的基因型；所述记kasp_tt1位点是水稻基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或g，为序列表中seq id no.4的第101位核苷酸。
[0013]
作为优选实例，所述kasp_tt1位点的基因型为aa基因型时，水稻为耐高温或者候选为耐高温；所述kasp_tt1位点的基因型为ag基因型或者gg基因型时，水稻为不耐高温或者候选为不耐高温；其中，所述aa基因型表示水稻基因组中所述kasp_tt1位点的核苷酸种类为a的纯合型；所述gg基因型表示水稻基因组中所述kasp_tt1位点的核苷酸种类为g的纯合型；所述ag基因型表示水稻基因组中所述kasp_tt1位点的核苷酸种类为a和g的杂合型。
[0014]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发的应用，提供一种检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在a1、a2、a3或a4中的应用；所述kasp_tt1位点是水稻基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或g，为序列表中seq id no.4的第101位核苷酸：
[0015]
所述a1为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性中的应用；
[0016]
所述a2为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定耐高温水稻产品中的应用；
[0017]
所述a3为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
[0018]
所述a4为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在选育耐高温的水稻资源中的应用。
[0019]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发的应用，提供一种选育耐高温的水稻资源的方法，包括选择kasp_tt1位点的基因型为aa的水稻进行育种，其中，所述kasp_tt1位点是水稻基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或g，为序列表中seq id no.4的第101位核苷酸；所述aa基因型表示水稻基因组中所述kasp_tt1位点的核苷酸种类为a的纯合型。
[0020]
水稻耐高温基因tt1的kasp标记开发的应用，提供含有检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质的产品，为e1-e4中任一种产品：
[0021]
所述e1为检测与水稻高温耐性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
[0022]
所述e2为鉴定或辅助鉴定耐高温水稻的产品；
[0023]
所述e3为用于水稻辅助育种的产品；
[0024]
所述e4为用于选育耐高温水稻资源的产品。
[0025]
作为优选实例，所述含有检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质的产品在b1、b2、b3或b4中的应用；
[0026]
所述b1为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻高温耐性中的应用；
[0027]
所述b2为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定耐高温水稻产品中的应用；
[0028]
所述b3为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中的应用；
[0029]
所述b4为检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质在选育耐高温的水稻资源中的应用。
[0030]
作为优选实例，所述检测检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质为如下d1、d2或d3：
[0031]
所述d1为所述检测检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述kasp_tt1位点在内的水稻基因组dna片段的pcr引物；
[0032]
所述d2为所述检测水稻基因组中kasp_tt1位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；
[0033]
所述d3为含有d1所述pcr引物或d2所述pcr试剂的试剂盒。
[0034]
作为优选实例，所述pcr引物为p1或p2：
[0035]
p1、所述pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.1的第22-45位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第22-45位的单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna组成的引物组；
[0036]
p2、所述pcr引物为由序列表中seq id no.1所示的单链dna、序列表中seq id no.2所示的单链dna和由序列表中seq id no.3所示的单链dna的引物组。
[0037]
本发明的有益效果是：本发明提供了一种水稻耐高温基因tt1紧密连锁的kasp分子标记开发与应用，所述分子标记是与水稻耐高温基因tt1紧密连锁的kasp标记kasp_tt1。该标记基于kasp技术开发，可高通量检测水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基。本发明应用kasp技术对水稻耐高温基因tt1进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测水稻耐高温基因tt1，对促进耐高温水稻育种具有重要意义。
附图说明
[0038]
图1为标记流程开发图；
[0039]
图2为利用分子标记kasp_tt1检测品种材料的分型图；
[0040]
图3为利用分子标记kasp_tt1检测f2群体的分型图。
具体实施方式
[0041]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0042]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
[0044]
实施例1
[0045]
与水稻耐高温基因tt1紧密连锁kasp标记开发
[0046]
与水稻耐高温基因tt1紧密连锁kasp标记开发流程如图1所示。据文献报道，获得一个与tt1基因紧密连锁的snp位点。
[0047]
1.引物的确定：将tt1基因的紧密连锁snp位点锚定在水稻3号染色体的第15422542位碱基上(胡雪娇,程灿,涂荣剑,等.水稻耐高温tt1基因的功能标记的开发与应用[j].分子植物育种,2019,v.17(22):148-153.)。从ncbi数据库下载tt1基因的紧密连锁snp位点的侧翼序列，并利用primer5.0软件，共设计3组kasp引物。利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，挑选出1套多态性良好的kasp引物用于后续验证，所述用于检测与水稻耐高温基因tt1紧密连锁kasp标记的引物具体如下：
[0048]
primer x：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattaaagcaagcacaacagtattatca-3’(seq id no.1，小写字母部分为特异荧光标签序列vic)；
[0049]
primer y：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctaaagcaagcacaacagtattatcg-3’(seq id no.2，小写字母部分为特异荧光标签序列fam)；
[0050]
primer r：5
’‑
ttaggatagcactgtaaaactgca-3’(seq id no.3)。
[0051]
所述引物对应的snp位点为水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基(对应序列表中序列4中第101位核苷酸)。
[0052]
2.dna提取：采用常规ctab法从水稻叶片中提取基因组dna。
[0053]
3.kasp反应测试
[0054]
snp标记扩增及反应体系：
[0055]
(1)荧光定量pcr仪ab-q6 flex检测：
[0056]
5μl pcr荧光定量仪检测反应体系包括：基因组dna 50ng，引物混液0.07μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl,ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(low rox)2.5μl。按照荧光定量pcr仪ab-q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
[0057]
以上反应体系为ab-q6 flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0058]
(2)选择douglas scientific公司arraytape平台检测
[0059]
1.6μl pcr arraytape平台检测反应体系包括：含基因组dna 50ng/μl0.8μl，引物混液0.03μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl,ddh2o46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(std rox)0.8μl。根据arraytape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
[0060]
以上反应体系为douglas scientific公司arraytape平台的优选反应体系，其他
合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0061]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0062]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg2 等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接一个vic荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，其5’端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0063]
4.扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
[0064]
实验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照(ntc)，每个板设置1个或多个空白对照。
[0065]
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中kasp_tt1位点的基因型(即检测水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基是a还是g)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴(vic信号)，则待测水稻基因组中kasp_tt1位点的基因型为aa纯合型(即水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基为a纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴(fam信号)，则待测水稻基因组中kasp_tt1位点的基因型为gg纯合型(即水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基为g纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间(vic和fam信号)，则待测水稻基因组中kasp_tt1位点的基因型为ag杂合型(即水稻基因组第3号染色体的第15422542位碱基为ag杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
[0066]
5.标记分型数据分析
[0067]
为了验证kasp_tt1位点的可靠性，首先，利用kasp_tt1对8个水稻品种材料进行分子标记检测(图2)；然后，对8份水稻品种材料进行高温耐性测试，获得材料的表型数据，表型鉴定方法及评价标准见文献(胡雪娇,程灿,涂荣剑,等.水稻耐高温tt1基因的功能标记的开发与应用[j].分子植物育种,2019,v.17(22):148-153.)。材料基因型采用douglas scientific公司arraytape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复。扩增结果表明，kasp_tt1位点在8份材料中能够获得稳定的pcr产物，并且能够检测到a和g两个等位位点，且与材料抗病性一致(图2)。因此，本发明所述的kasp_tt1位点可用于水稻耐高温基因tt1的分子标记辅助选择育种。
[0068]
表1.8份测试水稻品种的表型与基因型信息
[0069]
序号品种名称表型基因型序号品种名称表型基因型1cg14taa5粤丰bsgg2明恢86sgg6恒丰bsgg3绵恢523sgg7地谷sgg4绵恢725sgg8武运粳sgg
[0070]
注：表中
‘
t’表示材料的表型为耐高温；
‘
s’表示材料的表型为不耐高温；
‘
aa’表示
纯合耐高温基因型；
‘
gg’表示纯合不耐高温基因型；
‘
ag’表示杂合不耐高温基因型；
‘
*’表示无检测信号。
[0071]
实施例2
[0072]
与水稻耐高温基因tt1紧密连锁的kasp标记在分子标记辅助选择水稻耐高温植株中的应用
[0073]
为检测本发明kasp_tt1位点的实用性，利用耐高温水稻材料cg14与不耐高温水稻材料绵恢725杂交获得f1群体，通过f1天然自交产生f2自然分离群体48株，对分离群体进行kasp标记检测和表型验证(表2)，标记检测和表型验证实施方法参考实施例1。通过对分离群体进行表型与基因型检测和分析，在48份分离群体单株中，仅4株基因型与表型结果不一致，标记kasp_tt1与田间抗性的一致性结果为p＝91.67％(一致性p＝表型与基因型相符的植株数/总植株数*100％)，表明标记kasp_tt1在水稻耐高温植株筛选中具有较高的实用性。
[0074]
表2.水稻分离群体的表型与基因型信息
[0075]
材料编号抗性基因型材料编号抗性基因型tt1_f2_001sggtt1_f2_025taatt1_f2_002sggtt1_f2_026sagtt1_f2_003sggtt1_f2_027taatt1_f2_004sggtt1_f2_028taatt1_f2_005taatt1_f2_029saatt1_f2_006sggtt1_f2_030saatt1_f2_007sagtt1_f2_031sggtt1_f2_008saatt1_f2_032taatt1_f2_009sagtt1_f2_033sagtt1_f2_010sagtt1_f2_034sagtt1_f2_011taatt1_f2_035sagtt1_f2_012taatt1_f2_036sggtt1_f2_013sagtt1_f2_037sagtt1_f2_014taatt1_f2_038sagtt1_f2_015sagtt1_f2_039taatt1_f2_016sagtt1_f2_040sggtt1_f2_017taatt1_f2_041taatt1_f2_018sggtt1_f2_042sagtt1_f2_019sagtt1_f2_043taatt1_f2_020sagtt1_f2_044sggtt1_f2_021tagtt1_f2_045sggtt1_f2_022sggtt1_f2_046sagtt1_f2_023sagtt1_f2_047sagtt1_f2_024sagtt1_f2_048sgg
[0076]
注：表中
‘
t’表示材料的表型为耐高温；
‘
s’表示材料的表型为不耐高温；
‘
aa’表示
纯合耐高温基因型；
‘
gg’表示纯合不耐高温基因型；
‘
ag’表示杂合不耐高温基因型；
‘
*’表示无检测信号。
[0077]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0078]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0079]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。