GL11蛋白和编码GL11蛋白的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用的制作方法

gl11蛋白和编码gl11蛋白的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，更具体地说，涉及gl11蛋白在调控水稻粒形和千粒重中的应用。


背景技术：

2.水稻是我国重要的粮食产物，水稻的产量涉及到我国的粮食安全问题。随着耕地面积的减少和国家人口的不断增加，水稻小麦玉米等主要粮食作物的产量受到极大的挑战。因此，提高水稻等作物的产量迫在眉睫。水稻产量主要由四个因素来决定：粒数、结实率、千粒重和有效穗数。水稻的有效穗数主要由农艺性状来决定，这包括单株的分蘖数、株高、穗长、粒密度和结实率；而水稻粒型（包括粒长、粒宽、长宽比和粒厚）主要与粒重有关(wang et al., 2008; xing and zhang, 2010)。
3.水稻粒型是一个非常重要的数量性状，它是由多个数量性状位点（qtls， quantitative trait loci）来调控。至今为止，在水稻中已经鉴定到超过400个qtl位点与水稻粒型相关，但只有很少的基因被克隆到(li and li, 2016; zuo and li， 2014)。在已经克隆的产量相关的qtl中，直接影响水稻粒型、粒重和充实度的qtl有gs3、gs5、qgl3/qgl3.1、qgl3.2、gl7/glw7、tgw6、gw5、gw8、gw2和gif，还有一些影响水稻穗型的qtl如dep1，影响水稻穗粒数的qtl：osckx2、osspl4和prog1，影响水稻结实率的gsd1。
4.尽管目前已经克隆了很多调控水稻粒形相关的基因，但其调控水稻粒性的分子机理和调控网络还不清晰，需要进一步挖掘克隆新的控制粒形的基因，并探索解析器其作用机理。因此，水稻粒长调控基因gl11的克隆和应用，对明确水稻调控粒形的分子机理及其在育种中的应用具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明第一个目的在于提供gl11蛋白和编码gl11蛋白的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用，调节gl11蛋白表达用于改良水稻粒形和千粒重。
6.本发明第二个目的在于提供含有上述gl11蛋白的重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控水稻粒形和千粒重中的应用。
7.本发明第三个目的在于提供gl11蛋白的突变体和编码gl11蛋白的突变体的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用。
8.本发明第四个目的在于提供含有上述gl11蛋白的突变体的重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控水稻粒形和千粒重中的应用。
9.本发明第五个目的在于提供一种调控水稻粒形和千粒重的方法。
10.为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：gl11蛋白和编码gl11蛋白的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用，所述gl11蛋白为如下（1）—（3）任一所示：
（1）由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；（2）由seq id no.2所示的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质；（3）由来源于其他品种水稻，同源性至少为80%的同源序列而生成的具有与（1）相同功能的蛋白质或其衍生物。
11.本发明分离克隆水稻中一个粒长调控基因gl11，该基因编码一个含有两个rna识别结构域的rna结合蛋白，利用该基因对水稻粒形长短及千粒重的调控，用于改良水稻粒形和产量。
12.上述（2）中的gl11蛋白可人工合成，也可先获得其编码基因，再进行生物表达得到。上述（2）中的gl11的编码基因可通过将序列表中seq id no.1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
´
端和/或3
´
端连上标签的编码序列得到。
13.由于不同品种间的同一基因往往存在单核苷酸多态性，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，不同物种甚至同一物种不同品种间，具有相同功能的蛋白质其氨基酸序列也不完全相同，但具有高度的同源性。同源序列还包括与本发明所公开的gl11蛋白所示的氨基酸序列有至少80%、85％、90％、95%、96％、98％、或99％序列相似性，且具有调控水稻粒形和千粒重的蛋白质。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
14.本发明所述来源于其他品种水稻的同源序列而生成的具有相同功能的蛋白质或其衍生物，是因为水稻品种数量很多，发明人不可能进行一一列举， 本发明提供了具有代表性的序列，比如，本发明中seq id no.2所示的gl11蛋白序列来源于93-11 (o. sativa indica)；。
15.作为一个优选方案，所述编码gl11蛋白的基因序列为如下（1）—（3）任一所示：（1）编码区为seq id no.1所示序列的dna分子；（2）在严格条件下与（1）限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；（3）与（1）限定的dna序列至少具有80%同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
16.同源基因还包括与本发明所公开的gl11基因所示的序列有至少95％序列相似性，且具有调控水稻粒形和千粒重功能的dna序列。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比对法、smith-waterman局部比对法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
17.为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：含有所述gl11蛋白的重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控水稻粒形和千粒重中的应用。
18.可用现有的植物表达重组载体构建含有所述基因的重组表达载体。本发明实施例中重组载体可将该片段酶切连接进植物双元表达载体pcambia1300，得到重组载体p1300-gl11，把构建好的载体通过电击转入农杆菌eh105菌株中。其他载体比如pcambia1306系列载体、pchf系列载体等，也能产生相似调控水稻粒形和千粒重性状。
19.使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
20.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工或增加其他组分，这主要取决于载体构建的目的和用途。如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（gus基因、萤光素酶基因等）、加入融合flag标签蛋白编码序列等。
21.本发明所提供的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或重组载体可被插入或转化植物细胞的基因组中。
22.为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：gl11蛋白的突变体和编码gl11蛋白的突变体的基因在调控水稻粒形和千粒重中的应用，所述突变体具有水稻大粒的表型，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
23.作为一个优选方案，所述编码gl11蛋白的突变体的基因序列如seq id no.3所示。
24.为实现上述第四个目的，本发明提供了含有上述gl11蛋白的突变体的重组载体、转基因细胞系或重组菌在调控水稻粒形和千粒重中的应用。
25.本发明筛选得到的具有大粒表型的突变体基因序列（来源于cssl133），其为在seq id no.1基因编码区的第694bp插入一个核苷酸，使其在720bp提前产生一个终止密码子，导致得到的转录本于蛋白产物均发生变化，其与下游其他控制粒型基因产生竞争，从而使水稻具有大粒的表型。本领域技术人员应该知晓，可以将基因序列seq id no.3构建到水稻表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因大粒突变体材料。
26.本发明的将核苷酸序列、表达载体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法，将核苷酸序列、表达载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。植物生物技术领域技术人员已知的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法包括农杆菌介导的植物转化方法、聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。本发明实施例使用了农杆菌转化法获得转化水稻株系。
27.为实现上述第五个目的，本发明提供了一种调控水稻粒形和千粒重的方法，所述方法为调节所述gl11蛋白的表达。
28.作为一个优选方案，所述调节包括下调gl11蛋白的表达，水稻粒形变长、千粒重增加；上调gl11蛋白的表达，水稻粒形变短。
29.作为一个优选方案，所述下调gl11蛋白的表达包括突变或敲除所述gl11蛋白的编码基因，或者过表达所述突变体的基因。
30.基于发明人的新发现，本发明提供了gl11蛋白用于调控水稻粒形和千粒重的应用，通过影响gl11基因表达水平，从而影响水稻种子大小，改良水稻的品质及产量性状。在一种方式下，本发明提供下调gl11蛋白的表达，得到粒形变长、千粒重增加的转基因水稻品
种，或者上调gl11蛋白的表达，得到粒形变短的转基因水稻品种。比如，利用超表达具有大粒表型的突变体基因序列（seq id no.3）或crispr/cas9基因编辑等技术将调控水稻粒长基因gl11转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；或者利用常规杂交和回交方法将gl11基因导入目标水稻品种中，培育水稻新品系。
31.本发明通过实验发现gl11蛋白具有负向调节水稻粒形和千粒重的功能，调控基因的表达水平可以使用本领域技术人员可获得的工具进行，例如通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的转入等，都可以用于破坏gl11基因的正常表达，从而获得种子粒型变大的转基因水稻品系。比如本发明的实施例中，与野生型相比，互补转化与超表达转化gl11（来源于93-11，oryza indica）植株均表现出其粒长显著降低，在另一种方式下，比如，可采用crispr/cas9系统进行基因编辑敲除gl11基因或沉默(如采用基因干扰的方法) gl11基因(或基因片段)后可增加水稻粒形和千粒重，或者过表达本发明筛选得到的具有大粒表型的突变体基因序列（来源于cssl133），可显著增加水稻粒形和千粒重。因此，可基于gl11蛋白对于植物性状的影响作用来改变水稻粒形和千粒重，从而达到根据实际生产需要改良水稻品质的目的。
32.本发明具有以下有益效果：本发明公开了gl11蛋白和具有水稻大粒表型的gl11蛋白突变体在调控水稻粒形和千粒重中的应用，通过图位克隆的方法定位到了一个新的调控水稻粒形基因gl11并利用互补实验、超表达载体和crispr/cas9基因编辑对该基因进行了互补实验、超表达和基因敲除，其在转化背景籼稻93-11和粳稻日本晴（nipponbare）中所得到的转基因植株，与野生型相比，互补转化与超表达转化植株均表现出其粒长和千粒重显著降低，基因编辑得到的突变体gl11其粒长和千粒重显著提高，说明该基因是调控水稻粒形和千粒重的基因，可用于改良水稻粒性和和产量方面的应用，并根据实际需要获得转基因水稻品种，为水稻的高产育种提供了新的基因资源。
附图说明
33.图1是93-11和cssl133水稻粒形的表型(a、b和c) 和粒长(d)、粒宽(e)、粒厚(f)和千粒重(g)统计数据。
34.图2是gl11基因的图位克隆。a为初步定位；b为精细定位；c为定位区间存在的候选基因；d为基因结构分析。
35.图3是cssl133背景下表达野生型gl11基因互补实验验证。a位互补载体示意图；b为互补转化植株水稻粒形的表型；粒长(c)、粒宽(d)、粒厚(e)和千粒重(f)统计数据。
36.图4是93-11背景下利用crispr/cas9基因编辑敲除gl11基因的转基因植株粒形表型。a为基因编辑的特异识别位点以及所得突变体的具体突变碱基；b为基因编辑突变体gl11
93-11
水稻粒形的表型；粒长(c)、粒宽(d)、粒厚(e)和千粒重(f)统计数据。
37.图5是在日本晴背景下超表达gl11
93-11
改良水稻粒性和千粒重的应用。a为超表达载体示意图；b为超表达转化植株水稻粒形的表型；c为超表达转化植株gl11表达量分析；粒长(d)、粒宽(e)、粒厚(f)和千粒重(g)统计数据。
38.图6是在日本晴背景下超表达gl11
cssl133
改良水稻粒性和千粒重的应用。a为超表达载体示意图；b为超表达转化植株水稻粒形的表型；c为超表达转化植株gl11表达量分析；粒长(d)、粒宽(e)、粒厚(f)和千粒重(g)统计数据。
39.图7是在日本晴背景下利用crispr/cas9基因编辑敲除gl11基因改良水稻粒形和千粒重的应用。a为基因编辑的特异位点以及所得突变体的具体突变碱基；b为基因编辑所得突变体gl11水稻粒形的表型；粒长(c)、粒宽(d)、粒厚(e)和千粒重(f)统计数据。
具体实施方式
40.以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意义相同。本发明不对所采用的原料的来源进行限定，如无特殊说明，均为普通市售产品。
41.实施例1.gl11基因的定位与克隆以非洲栽培稻 (oryza glaberrima 119) 作为供体亲本，93-11 (oryza indica) 作为轮回亲本，回交4代，然后鉴定粒形的表型再自交2代，得到染色体片段渗入系cssl133。与93-11的粒长相比，cssl133（oryza sativa）的粒长显著增加了7% (10.88
±
0.39 mm vs 10.17
±
0.20 mm)，而粒宽和粒厚没有显著性差异，因此千粒重cssl133比93-11增加了23%（1000-grain weight: 37.08
±
0.91g vs 30.08
±
0.23g）（图1）。说明为了在对粒形基因图位克隆时有足够的分子标记可用，构建了gh998 (广辉998）与gssl133的定位群体。利用gh998与cssl133之间的多肽标记以及简单序列重复标记（ssr）对235株长粒表型植株进行了初步连锁分析，将区间定位在rm6499和rm27256之间。同过高密度的分子标记筛选6781株长粒植株，我们最终将区间定位在indela和indelb之间11.6 kb的范围内，该区间包含一个开放型阅读框，基因编号为loc_os11g41890（图2），gl11基因具有seq id no .1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质序列为seq id no .2，与93-11相比csll133在该基因编码区的第694bp插入一个a，使其在720bp提前产生一个终止密码子。将该基因作为调控水稻粒形表型的候选基因并将其命名为gl11 (grain length 11)，该基因编码一个rna结合蛋白，该蛋白包含两个保守的rna识别结构域。csll133来源的gl11基因被认为是新发现的gl11基因突变体，其具有水稻大粒表型，氨基酸序列如seq id no.4所示，核苷酸序列如seq id no.3所示。
42.实施例2. gl11基因功能分析以93-11的基因组 dn a为模板，用该 gl11基因启动子上游 5’和3’端的寡核苷酸作为 pcr引物，将得到的4.5kb包含gl11基因上游启动子区的基因组dna的扩增产物连接进克隆载体，并测序验证。确认序列无误后将该片段酶切连接进植物双元表达载体pcambia1300，得到重组载体p1300-gl11，把构建好的载体通过电击转入农杆菌eh105菌株中。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法导入cssl133，获得转基因植株pcpl。通过对粒形的表型观察，发现转基因植株pcpl的粒长与cssl133相比显著变短，千粒重显著降低（图3）。
43.利用crispr/cas9系统构建gl11基因敲除载体，首先设计并生成grna靶序列，在gl11 基 因 的 基 因 组 序 列 上 寻 找 目 标 序 列 ，并 选 择 特 异 性 序 列作为识别的靶序列，获得重组载体。采用实上述相同的遗传转化方法将重组载体导入93-11中，获得水稻 gl11基因功能缺失的转基因植株gl1
93-11
。观察水稻粒形表型，发现与对照93-11相比，gl11基因功能缺失突变植株的粒长变长，千粒重显著增加，说明gl11基因功能缺失会使粒形变长 (图4)。
44.实施例3.gl11基因改良水稻粒形和千粒重以93-11的rna为模板，合成第一链cdna，用gl11基因编码序列5’和3’端的寡核苷酸作为pcr引物，然后将得到的1395bp包含gl11基因全长cdna的扩增产物连接进克隆载体，并测序验证。确认无误后将该片段酶切连接进植物双元表达载体pcambia1300(详见www .cambia .org)得到重组载体p1300-gl11cdna；再通过pcr扩增获得烟草花椰菜病毒组成型启动子camv 35s片段，将pcr产物连接到p1300-gl11载体，获得重组载体p1300-35s-gl11cdna，用相同的水稻遗传转化方法将重组载体p1300-35s-gl11cdna导入日本晴，获得转基因植株oe-gl11
93-11
。通过rt-pcr验证转基因植株的表达量后，对转基因粒形表型进行观察，发现转基因植株oe-gl11
93-11
的粒长与野生型日本晴相比变的显著变短，千粒重显著降低。表明过量表达gl11基因会使水稻粒长变短(图5)。
45.利用上述的方法以cssl133的rna为模板，合成第一链cdna，构建载体p1300-35s-gl11
cssl133
cdna导入日本晴，获得转基因植株oe-gl11
cssl133
。通过rt-pcr验证转基因植株的表达量后，对转基因粒形表型进行观察，发现转基因植株oe-gl11
cssl133
的粒长与野生型日本晴相比变的显著变长，千粒重显著增加。表明过量表达突变的gl11基因会使水稻粒长变长(图6)。
46.利用实施例2中crispr/cas9系统构建gl11基因敲除载体，将其转化日本晴，得到转化植株gl11对转基因粒形表型进行观察，发现转基因植株ql11的粒长与野生型日本晴相比变的显著增长，千粒重显著增加。表明gl11基因的无义突变会使水稻粒长变长，千粒重增加(图7)。
47.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。