一种制备达托霉素杂质RS-7a的方法与流程

一种制备达托霉素杂质rs-7a的方法
技术领域
1.本发明属于药物制备领域，具体涉及达托霉素杂质rs-7a的制备方法。


背景技术：

2.达托霉素(daptomycin)是经链霉菌(s.roseosporus)发酵液中提取得到的含有十碳侧链的首个新型环脂肽类抗生素，它通过多方面破坏细菌细胞膜的功能，并迅速杀死革兰氏阳性菌，尤为重要的是，它在体外对甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑胺等高致病性耐药菌有很好的杀菌效果，且毒副作用小，为临床危重感染患者提供了一种新的治疗手段。
3.达托霉素杂质的研究是保证产品质量和安全性的前提，因此能够分离纯化出达托霉素中的杂质并进行系统研究是非常必要的。达托霉素杂质rs-7a(c
72h99n17o25
)的结构式如下：
[0004][0005]
达托霉素的生产主要是通过微生物发酵法来实现的，该方法具有产量高和污染小的显著优势，是目前工业化生产首选的技术。发酵产物的复杂性、特殊性以及制药行业对发酵产品纯度、收率的严格要求，使得发酵产品的分离纯化在整个生物加工过程(包括髙产菌株的选育、微生物发酵、酶促反应等)中所处地位举足轻重。发酵液是一种极其复杂的多相、多组分体系，含有多种不明成分，杂质的研究是保证产品安全性的前提，因此研究药物杂质的来源、检测方法、限度和分离纯化等，具有重要意义，尤其影响药品研发中剂型选择、处方组成、工艺确定、分析方法的研究以及产品的储存等。杂质是创新药物质量研究、质量控制和安全性研究的重点，直接体现创新的研究水平。达托霉素产品中常包含有脱水达托霉素、异构达托霉素、达托霉素内酯水解物等杂质，严重影响产品质量和安全，因此能够分离纯化出达托霉素中的杂质并进行系统研究是非常必要的。
[0006]
欧洲专利1586580a2、cn01805212.6公开了达托霉素14个杂质及其归属，并未具体涉及达托霉素杂质分离方法。
[0007]
中国抗生素杂志(2013年10月第38卷第10期,760～764)中报道了达托霉素在不同酸碱(ph2、ph4、ph6、ph8、ph10)条件下产生的5个主要的相关杂质，利用分析和制备型hplc进行杂质制备并对其结构进行研究，其中液相制备需要消耗大量的流动相、收率低、生产周期长、操作复杂和制备成本高。cn106866791 a、cn 105699554a和周旭燕《达托霉素产品杂质组分的鉴定与分离控制》公开了高纯度达托霉素内酯水解物的分离纯化及制备方法。
[0008]
cn104387444 a公开了达托霉素杂质rs-2高纯度样品的制备方法，使用树脂层析、超滤/纳滤、硅胶层析，并结合高效液相分析，方法复杂，操作难度大。
[0009]
cn106866790 a公开了达托霉素rs-5/6、rs-7和rs-7a/7b杂质的制备方法，使用制备液相纯化时需使用手性色谱柱ib-sitc8/6045-1，制备成本较高，且发明中并没有阐述是否分别得到纯度较高的rs-7a和rs-7b，且未公开杂质rs-7a的分子结构或分子量等信息，不利于主产物达托霉素质量的提高和其质量的研究。
[0010]
中国抗生素杂志(2019年5月第44卷第5期,574-579)中报道了分子量为1617的新杂质，根据杂质的化学结构，推测该杂质可能来源于发酵过程中补加的癸酸，杂质的制备仍是使用液相制备，也需消耗大量的流动相、收率低、制备成本高。
[0011]
达托霉素中各杂质的分离纯化和检测对于提高产品质量、保证用药安全性至关重要，杂质的分离纯化有利于提高产品纯度、制定质量标准和提高用药安全性，达托霉素相关杂质rs-7a是达托霉素质量控制中重点关注的杂质，高纯度的杂质样品对rs-7a杂质研究有重要作用。根据“国家食品药品监督管理局进口药品注册标准”(标准号jx20070250)关于注射用达托霉素的描述，将高压液相检测达托霉素时候，保留时间在46.32分钟(相对达托霉素保留时间1.27)的杂质命名为rs-7a。本发明针对达托霉素杂质rs-7a的分离纯化方法进行研究，以期得到高纯度的杂质，提高达托霉素产品质量，加快达托霉素的高水平产业化。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉且能快速地从达托霉素成品制备高纯度达托霉素杂质rs-7a的制备方法。
[0013]
本发明的技术方案为：达托霉素样品用乙腈-水溶液溶解，然后加酸液反应，得到含达托霉素杂质rs-7a的料液，再通过制备色谱纯化，得到达托霉素杂质rs-7a的纯品。
[0014]
一种制备达托霉素杂质rs-7a的方法，具体包括如下步骤：
[0015]
a.酸反应：达托霉素样品用乙腈-水溶液溶解，然后加酸液调至酸性，加热反应；
[0016]
b.纯化：将步骤a所得的酸反应后的溶液上样至制备色谱柱上，分离纯化，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；
[0017]
c.冷冻干燥：将步骤b所得的达托霉素杂质rs-7a的制备液冷冻干燥，得达托霉素杂质rs-7a的固体。
[0018]
优选地，步骤a中所述的达托霉素样品为达托霉素粗品、达托霉素成品或达托霉素粉针。
[0019]
进一步优选地，步骤a中所述的达托霉素样品的色谱纯度》90％。
[0020]
优选地，步骤a中所述的乙腈-水溶液中乙腈与纯化水的体积比为20∶80～55∶45。
[0021]
进一步优选地，步骤a中所述的乙腈-水溶液中乙腈与纯化水的体积比为30∶70～40∶60。
[0022]
优选地，步骤a中所述的将达托霉素样品用乙腈-水溶液溶解成20～60mg/ml的溶液。
[0023]
进一步优选地，步骤a所述的将达托霉素样品用乙腈-水溶液溶解成30～50mg/ml的溶液。
[0024]
优选地，步骤a中所述的酸液为无机酸溶液。
[0025]
进一步优选地，步骤a中所述酸液为盐酸、硫酸或磷酸。
[0026]
优选地，步骤a中所述的酸液的浓度为0.1～1mol/l。
[0027]
优选地，步骤a中所述的加酸液调至ph为3.0～5.5。
[0028]
进一步优选地，步骤a中所述的加酸液调至ph为3.5～4.5。
[0029]
优选地，步骤a中所述的加热反应的温度为30～70℃。
[0030]
进一步优选地，步骤a中所述的加热反应的温度为40～65℃。
[0031]
优选地，步骤a中所述的加热反应的时间为50～80h。
[0032]
进一步优选地，步骤a中所述的加热反应的时间为68～76h。
[0033]
优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化时，流动相为乙腈和磷酸二氢铵溶液的混合液。
[0034]
进一步优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化时，流动相为乙腈和0.02～0.06mol/l的磷酸二氢铵溶液的混合液。
[0035]
更为优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化时，流动相为乙腈和ph为3.0～5.0的0.02～0.06mol/l的磷酸二氢铵溶液的混合液。
[0036]
优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化时，流动相中乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为25∶75～50∶50。
[0037]
进一步优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化时，流动相中乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为30∶70～40∶60。
[0038]
优选地，步骤b中所述的制备色谱纯化的色谱条件为：
[0039]
色谱柱：lp-c8、250
×
21.2mm；
[0040]
波长：214nm；
[0041]
流动相：乙腈和ph为3.0～5.0的0.02～0.06mol/l的磷酸二氢铵溶液的混合液；
[0042]
流速：15ml/min；
[0043]
柱温：室温(20～30℃)。
[0044]
优选地，步骤c所述的冷冻干燥条件为：先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻2～8h；然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干50～80h；再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干2～8h。
[0045]
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
[0046]
1、通过我们的研究，明确了达托霉素杂质rs-7a的化学结构以及产生来源，而对相关杂质及其产生背景的深入了解，有助于控制生产工艺，提高产品质量；
[0047]
2、本发明提供的制备达托霉素杂质rs-7a的方法，工艺简单，可将杂质rs-7a的含量由约0.5％提高至8％以上，制备前获得较高浓度的杂质样品，节约了时间和制备成本；
[0048]
3、本发明对达托霉素样品的起始物料来源要求低，易于获得，且杂质的制备可根据需要放大制备，满足研究和生产的需要；
[0049]
4、通过本发明提供的制备达托霉素杂质rs-7a的方法，分离得到杂质rs-7a，色谱纯度高于95％，并经esi-ms质谱进行结构鉴定。
附图说明
[0050]
图1是实施例中达托霉素成品hplc检测图谱。
[0051]
图2是实施例中达托霉素杂质rs-7a纯化后的hplc检测图谱。
[0052]
图3是实施例中达托霉素杂质rs-7a纯化后的esi-ms质谱图。
具体实施方式
[0053]
下面列举具体实施方式对本发明予以进一步说明，但不以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0054]
实施例1
[0055]
取色谱纯度95％的达托霉素成品(5g)，用体积比为35％乙腈-水溶液溶解成40mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入1mol/l的盐酸溶液，使反应液ph调至4.1，置于50℃恒温水浴锅内，加热反应72h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为9.8％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.03mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为35∶65，磷酸二氢铵溶液的ph为4.0)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温25℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻5h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干65h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干5h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度98.9％。
[0056]
实施例2
[0057]
取达托霉素粉针(2g)，用体积比为30％乙腈-水溶液溶解成50mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入1mol/l的盐酸溶液，使反应液ph调至3.5，置于40℃恒温水浴锅内，加热反应76h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为9.6％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.04mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为30∶70，磷酸二氢铵溶液的ph为3.5)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温25℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻6h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干70h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干6h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度98.7％。
[0058]
实施例3
[0059]
取色谱纯度95％的达托霉素成品(5g)，用体积比为40％乙腈-水溶液溶解成30mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入0.1mol/l的硫酸溶液，使反应液ph调至4.5，置于65℃恒温水浴锅内，加热反应68h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为9.5％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.02mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为30∶70，磷酸二氢铵溶液的ph为4.5)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温25℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻3h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干60h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干3h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度98.5％。
[0060]
实施例4
[0061]
取色谱纯度90％的达托霉素粗品(5g)，用体积比为20％乙腈-水溶液溶解成60mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入0.2mol/l的磷酸溶液，使反应液ph调至5.5，置于70℃恒温水浴锅内，加热反应50h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为9.1％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.05mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为25∶75，磷酸二氢铵溶液的ph为3)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温20℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻8h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干80h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干2h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度98.2％。
[0062]
实施例5
[0063]
取色谱纯度90％的达托霉素粗品(5g)，用体积比为55％乙腈-水溶液溶解成20mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入0.5mol/l的盐酸溶液，使反应液ph调至3.0，置于30℃恒温水浴锅内，加热反应80h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为9.3％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.06mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为50∶50，磷酸二氢铵溶液的ph为5)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温30℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻2h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干50h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干8h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度98.4％。
[0064]
实施例6
[0065]
取色谱纯度90％的达托霉素成品(5g)，用体积比为15％乙腈-水溶液溶解成10mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入0.2mol/l的醋酸溶液，使反应液ph调至6.0，置于20℃恒温水浴锅内，加热反应45h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液
中杂质rs-7a纯度为8.1％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.01mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为20∶80，磷酸二氢铵溶液的ph为2.0)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温20℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻9h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干90h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干1h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度84.6％。
[0066]
实施例7
[0067]
取色谱纯度95％的达托霉素成品(5g)，用体积比为60％乙腈-水溶液溶解成70mg/ml溶液，然后向含有达托霉素的乙腈-水溶液中加入0.5mol/l的盐酸溶液，使反应液ph调至2.0，置于80℃恒温水浴锅内，加热反应88h，得酸反应后的溶液，hplc检测酸反应后的溶液中杂质rs-7a纯度为8.2％；然后将酸反应后的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.08mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为55∶45，磷酸二氢铵溶液的ph为5.5)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温30℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻1h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干40h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干9h，得到达托霉素杂质rs-7a固体，其中达托霉素杂质rs-7a纯度85.2％。
[0068]
对比实施例
[0069]
取色谱纯度90％的达托霉素成品(5g)，用饱和氢氧化钠溶液溶解成50mg/ml溶液，4℃冰箱保温8h，得到含达托霉素rs-7a/7b杂质的溶液，hplc检测碱反应后的溶液中杂质rs-7a/7b纯度为1.1％；然后将含达托霉素rs-7a/7b杂质的溶液经制备色谱(色谱柱为lp-c8、250
×
21.2mm)分离纯化，流动相为乙腈与0.06mol/l磷酸二氢铵溶液的混合溶液(乙腈与磷酸二氢铵溶液的体积比为50∶50，磷酸二氢铵溶液的ph为5)，流动相的上样流速15ml/min，柱温为室温30℃，并用高效液相跟踪检测(检测波长214nm)，检测条件与欧洲专利ep1586580a2公开的方法相同，收集含达托霉素杂质rs-7a/7b的制备液；将制备所得的含达托霉素杂质rs-7a/7b的制备液，先在-60℃～-45℃、压力低于20pa的条件下冷冻2h，然后在-40℃～-10℃、压力为20～60pa条件下冻干50h，再在10℃～30℃、压力低于10pa的条件下冻干8h，得到达托霉素杂质rs-7a/7b固体，其中达托霉素杂质rs-7a/7b纯度78.6％。