两亲性聚多肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于材料领域并且涉及两亲性聚多肽及其制备方法和应用。特别地，本发明涉及两亲性聚多肽在制备高稳定性且可体内原位增强超声造影的共聚多肽微泡中的应用，并且进一步探索了微泡的基本性质和在超声成像诊断方面的潜在应用。


背景技术：

2.超声(us)成像被广泛使用，并且被认为是用于疾病诊断和治疗的安全医疗工具。其具有非侵入性、利用非电离辐射、成本相对较低、携带方便、便于实时可视化等优点。通过将气体包覆在生物相容性材料中形成的微米级颗粒的微泡(mb)由于其高超声反射率和高稳定性而在作为超声造影剂(uca)方面取得了巨大成功。临床超声的对比基于各种组织声阻抗的变化，与其它成像技术相比，空气微泡的对比度较低。全氟碳化合物(pfc)由于不溶于生物流体而被用作微泡的气核，导致体积传递减少和半衰期延长(theranostics 2012,2,1185，reviews:nanomedicine and nanobiotechnology 2012,4,492)。虽然液体pfc微滴在高剂量下是有效的超声造影剂，但是气相pfc微泡的效果要好得多，需要的剂量是灰度超声成像的1/30(invest.radiol.1994,29,s139)，并且与非线性成像相比产生更高的图像对比度(acad.radiol.1998,5,s63)。
3.各种纳米载体已经被用于基于pfc的超声造影剂，包括脂质体、聚合物纳米颗粒、蛋白和无机纳米颗粒。最近聚多肽的发展非常迅速，并且在一些生物医用高分子领域有了一定的应用，诸如基因治疗、药物输送、聚多肽水凝胶等等。因此，具有生物相容性的聚多肽对生物安全性具有重要作用。这些物质通常在pfc核心周围建立功能化的外壳以通过降低表面张力来提高稳定性，并且提供扩散屏障。交联聚合物壳为稳定聚合物网络和防止全氟碳化物的逸出提供了一种选择。但是基于dna的交联策略已经被用来阻止响应于超声刺激的微泡的非线性振荡(adv.mater.2012,24,6010)。同时，frinking等提出了描述造影剂quantison的现象学模型，研究表明，壳增加了造影剂颗粒的机械刚度，并且壳粘度增加了吸声(ultrasound med.biol.24,523
–
533,1998)。
4.过去，在微泡制备中人们使用最多的材料包括磷脂、聚酯和聚氰基丙烯酸酯。由于这些试剂的疏水部分的表面张力大于30mn/m，使用表面张力低至6.7mn/m的氟化聚合物封装气泡可以大幅提高气泡的稳定性(langmuir 1999,15,4321
–
4323,angew.chem.int.ed.2015,54,14291
–
14294)。其在水和人体血液中的超声作用下比商用的第三代超声造影剂更稳定。研究结果表明，改变封装材料是制备稳定的微气泡和纳米气泡的一种可行方法。这些微泡的未来版本可能会在高级诊断和药物输送中得到应用。


技术实现要素：

5.本发明设计并合成了一系列含氟或可交联的两亲性聚多肽，并且由此提供了一种高稳定性且可体内原位增强造影的共聚多肽微泡，从而实现超声诊断中的灵敏检测。具体地，两亲性聚多肽中的氟嵌段减小了微泡的拉普拉斯压力，大大增强了微泡的稳定性，同时
在进行交联的情况下进一步增强了稳定性，部分聚合物微泡甚至可以非可逆地与蛋白结合以增强材料的声学性能。超声束使其运行通过的介质发生压缩-拉伸现象，暴露在超声束中的微泡同样发生一致性的收缩-膨胀动作。当声能进一步加大时，微泡的振动变为非线性，从而使产生的回波信号不仅包含微泡最初暴露于超声中的频率-基波频率，还包含谐波频率。由于谐波信号主要发自微泡，所以使得信噪比大大增强。
6.在一个方面，本发明提供了一系列新型的两亲性聚多肽，分为二嵌段聚多肽或三嵌段聚多肽，其中所述二嵌段聚多肽包含i)具有低表面张力性质的强疏水性含氟聚多肽嵌段作为内核以及亲水性聚乙二醇嵌段作为外部基团，并且所述三嵌段聚多肽包含i)具有低表面张力性质的强疏水性含氟聚多肽嵌段作为内核以及亲水性聚乙二醇嵌段作为外部基团；以及ii)可交联的二炔嵌段作为两者的链接嵌段。
7.(a)、(b)、(c)和(d)所涉及的氨基酸衍生物单体如下式(a)和(b)所示：
[0008][0009]
其中，l为2～4，i为4～11。
[0010]
在一个方面，本发明提供了式(a)、(b)、(c)和(d)的两亲性聚多肽：
[0011][0012][0013]
其中每个l独立地为2-4；i为4-11；k为4-400；n为1-50；并且m为1-100。
[0014]
在一些实施方案中，两亲性聚多肽的数均分子量为1000-100000。
[0015]
在另一个方面，本发明提供了制备式(a)和(b)的两亲性聚多肽的方法，所述方法包括：
[0016]
在另一个方面，本发明提供了制备式(a)和(b)的两亲性聚多肽的方法，所述方法包括：(1)将式(a)的单体或者式(a)和(b)的单体与式(c1)的链引发剂在溶剂中反应，并且(2)加入苄基异氰酸酯反应，得到式(a)和(b)的两亲性聚多肽，
[0017][0018]
其中每个l独立地为2-4；i为4-11；k为4-400；n为1-50；并且m为1-100。
[0019]
一个具体实例如以下方案所示：
[0020]
[0021]
在一些实施方案中，步骤(1)中的溶剂选自n,n-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜。
[0022]
在一些实施方案中，步骤(1)中的反应温度为60-90℃。
[0023]
在一些实施方案中，步骤(1)中的反应时间为3小时至2天。
[0024]
在一些实施方案中，步骤(2)中的溶剂选自n,n-二甲基乙酰胺或氯仿。
[0025]
在一些实施方案中，步骤(2)中的反应温度为50-110℃。
[0026]
在一些实施方案中，步骤(2)中的反应时间为1-6小时。
[0027]
在一些实施方案中，链引发剂为一端甲氧基另一端修饰有质子化氨基的亲水性聚合物；其特征在于，所述链引发剂为一端为甲氧基另一端通过氨基甲酸酯修饰了苄基质子化氨基的亲水性聚合物。
[0028]
在另一个方面，本发明提供了制备式(c)和(d)的两亲性聚多肽的方法，所述方法包括：(1)将式(a)的单体或者式(a)和(b)的单体与式(c2)的链引发剂在溶剂中反应，并且(2)加入苄基异氰酸酯反应，得到式(c)和(d)的两亲性聚多肽，
[0029][0030]
其中每个l独立地为2-4；i为4-11；k为4-400；n为1-50；并且m为1-100。
[0031]
一个具体实例如以下方案所示：
[0032]
[0033][0034]
在一些实施方案中，步骤(1)中的溶剂选自n,n-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜。
[0035]
在一些实施方案中，步骤(1)中的反应温度为60-90℃。
[0036]
在一些实施方案中，步骤(1)中的反应时间为3小时至2天。
[0037]
在一些实施方案中，步骤(2)中的溶剂选自n,n-二甲基乙酰胺或氯仿。
[0038]
在一些实施方案中，步骤(2)中的反应温度为50-110℃。
[0039]
在一些实施方案中，步骤(2)中的反应时间为1-6小时。
[0040]
在一些实施方案中，链引发剂为一端修饰有马来酰亚胺并且另一端修饰有质子化氨基的亲水性聚合物；其特征在于，所述链引发剂为一端通过氨基甲酸酯修饰了苄基马来酰亚胺；另一端通过氨基甲酸酯修饰了苄基质子化氨基的亲水性聚合物。
[0041]
在另一个方面，本发明提供了由本发明的两亲性聚多肽制备的聚多肽微泡，以及制备聚多肽微泡的方法。特别地，制备的微泡是大小可调的具有生物相容性的聚多肽微泡。
[0042]
在另一个方面，制备聚多肽微泡的方法包括：将两亲性聚多肽溶解在有机溶剂中，将所得有机溶液旋蒸以形成薄膜，加入水进行水化，最后将所得体系在含氟气体的气氛下超声，得到聚多肽微泡。
[0043]
在一些实施方案中，有机溶剂选自氯仿、六氟异丙醇或它们的任意比例的混合物。
[0044]
在一些实施方案中，在有机溶液中，两亲性聚多肽的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml。
[0045]
在一些实施方案中，加入的水的体积为有机溶剂的体积的0.1～100倍。
[0046]
在一些实施方案中，水化的温度为25-70℃，优选50℃。
[0047]
在一些实施方案中，水化的时间为2小时-3天，优选2天。
[0048]
在一些实施方案中，所述含氟气体选自全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫，优选全氟丙烷。
[0049]
在一些实施方案中，超声时间为10-60秒。
[0050]
在一些实施方案中，超声振幅为40％-70％。
[0051]
在一些实施方案中，微泡的直径范围为0.5～10μm。
[0052]
在一些实施方案中，微泡应用于超声成像诊断。
[0053]
在另一个方面，本发明提供了本发明的微泡在制备用于超声成像诊断的药物中的用途。
[0054]
本发明的有益效果
[0055]
以前的微泡在实际应用中往往存在着稳定性差、打开必须即用的缺点，而这些缺点大大限制了微泡的实际应用范围。过去，在微泡制备中人们使用最多的材料包括磷脂、聚
酯和聚氰基丙烯酸酯。这些试剂的疏水部分的表面张力大于30mn/m，而使用表面张力低至7-12mn/m的氟化聚合物封装气泡可以大幅提高气泡的稳定性。另一方面，交联聚合物壳为稳定聚合物网络和防止全氟碳化物的逸出提供了一种选择。显然，这一类型的微泡能够为超声诊断提供更大的环境耐受性和更长的检测时间。因此，新型聚合物微泡的合成以及将其在超声诊断检测中的应用具有重要的科学意义和重大的实用价值。
[0056]
本发明的高稳定性且可体内原位增强超声造影的共聚多肽微泡实现了超声诊断中的灵敏检测。具体地，本发明设计并合成了一系列含氟或可交联的两亲性聚多肽，其中氟嵌段减小了微泡的拉普拉斯压力，大大增强了微泡的稳定性，同时若进行交联可以进一步增强稳定性，部分聚合物微泡甚至可以非可逆地与蛋白结合以增强材料的声学性能。这些微泡的未来版本可以应用于高级诊断和药物输送。特别地，本发明的含合适疏水链或合适亲水甘醇链的聚合物能够很好制备微泡并且使其分散到水溶液中，并且在超声诊断时能够有效地发生回波信号。
附图说明
[0057]
图1示出了含二炔的赖氨酸衍生物单体的核磁氢谱(a)、核磁碳谱(b)和高分辨率质谱(esi-mass)(c)。
[0058]
图2示出了含二炔的赖氨酸衍生物单体的核磁氢谱(a)、核磁碳谱(b)、核磁氟谱(c)和高分辨率质谱(esi-mass)(d)。
[0059]
图3示出了制备的两亲性聚多肽的结构(a)及核磁氢谱(b)。
[0060]
图4示出了本发明的两亲性聚合物经过薄膜水化后的tem照片。
[0061]
图5示出了基于peg
45-b-pfok
11
(其中下标数字“45”表示peg的聚合度，“11”表示fok的聚合度)制备的2.4微米微泡在共聚焦荧光显微镜下的明场图片。
[0062]
图6示出了本发明的两亲性聚多肽微泡的皮管造影稳定性结果。
[0063]
图7示出了本发明的两亲性聚多肽mi-peg
45-pfok
11
微泡的兔子体内超声成像结果。
具体实施方式
[0064]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。本发明中所用原料说明如下：
[0065]
n-boc-n'-cbz-l-赖氨酸购自毕得医药，原样使用。10,12-五角叉二炔酸购自alfa aesar。来自牛血清的白蛋白购自阿拉丁，并按原样使用。2-巯基苯并噻唑、氯甲酸苯酯、2,2,2-三氯乙亚氨酸叔丁酯、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、三氟乙酸、三乙基硅烷购自安耐吉化学，并按原样使用。十五氟辛酸购自九鼎公司，原样使用。全氟丙烷购自上氟科技，并按原样使用。碳酸钠(na2co3)、二月桂酸二丁基锡(dbtl)、乙酸乙酯(etoac)、四氢呋喃(thf)、甲醇、乙醚、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)、甲苯购自国药控股化学试剂有限公司并按原样使用。用milli-q sp试剂水系统(密理博(millipore))将水去离子(di)，使电阻率达到18.4mωcm。商业化的磷脂包封的六氟化硫微泡样品来自中国科学技术大学第一附属医院，商品名为sonovue
tm
。除非另有说明，否则所有其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，并按原样使用。
[0066]
实施例
[0067]
以下实施例将对本发明作进一步说明，其中采用r＝-ch3，聚乙二醇(peg)分子量为2000，k＝～45为例，其目的仅在于更好地理解本发明，而不是限制本发明的保护范围。
[0068]
实施例1
[0069]
第一步，制备以下赖氨酸衍生物1(其中l＝4)：
[0070][0071]
其特征为：nα-叔丁氧羰基-赖氨酸叔丁酯的侧基与含有二炔基团的烷基链反应。
[0072]
制备方法：将nα-叔丁氧羰基-赖氨酸叔丁酯(3.7g，12.2mmol)和10,12-五己二炔酸(5.5g，14.7mmol)溶解在40ml无水四氢呋喃中并搅拌2分钟。加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(4.24g，15.3mmol)和n-甲基吗啡啉(2.71g，26.8mmol)，并在25℃下反应8小时。抽滤，并用少量thf洗涤残留物。通过柱色谱法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，得到白色固体产物6.1g(88％)。
[0073]
第二步，合成侧链带有二炔基团的赖氨酸衍生物2(其中l＝4)：
[0074][0075]
其特征为：经过两步反应得到侧链带有二炔基团的赖氨酸衍生物。
[0076]
制备方法：将产物1(2.31g，3.5mmol)溶解于15ml二氯甲烷中，加入1.40ml三乙基硅烷，并在搅拌下逐滴加入15ml的三氟乙酸，并使反应继续过夜。蒸发溶剂，得到1.42g产物(99％)。
[0077]
第三步：合成侧链带有二炔基团的赖氨酸衍生物苯氧单体3(其中l＝4)：
[0078][0079]
制备方法：将产物2(1.75g，3.5mmol)添加到15ml水中，并添加碳酸钠(0.37g，3.5mmol)并将混合物加热至45℃并搅拌2分钟。将s-(1,3-苯并噻唑-2-基)-o-苯基硫代碳酸酯(1.2g，4.2mmol)溶解在45ml四氢呋喃中，滴加到体系中，并在45℃下反应2小时。用20％硫酸溶液将ph调节至3，用ea萃取并干燥。通过柱色谱纯化，得到1.0g产物(55％)。其结构通过核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨率质谱(esi-mass)表征，结果显示于图1。
[0080]
实施例2：二嵌段聚多肽mi-peg
45-b-pfok
11
的制备
[0081][0082]
将fu-mi-peg
45-nh
3
cl-大分子伯胺引发剂(45mg，0.02mmol，1当量)、fok(199mg，0.3mmol，15当量)和n,n-二甲基乙酰胺(1.5ml)装入装有搅拌磁子的反应管中。在油浴中于70℃恒温后搅拌48h；加入苄基异氰酸酯(20微升)100℃反应1小时，然后将混合物沉淀到过量的甲醇中，并将沉淀再次用氯仿溶解。重复上述溶解-沉淀循环3次。将最终产物在真空烘箱中在室温下干燥过夜，得到白色固体(96mg，产率：57％)。将白色固体产物分散在5ml甲苯中，并在100℃下搅拌6小时。然后将混合物沉淀到过量的甲醇中。将最终产物在真空烘箱中在室温下干燥过夜，得到白色固体(40mg，87％)。氢谱如图3所示。通过氢谱分析确定pfok嵌段的平均dp为11。
[0083]
实施例3：具有2.4微米大小的微泡制备
[0084]
将25mg的两亲性聚多肽mi-peg
45-pfok
11
(实施例2)溶解在5ml的氯仿中，形成透明溶液。将该溶液在50℃下移至旋转蒸发仪中以除去有机溶剂并形成薄膜。然后，加入5ml水，在50℃下搅拌48小时，使薄膜再水化以形成半透明的乳白色悬浮液形成胶束(图4)。然后抽空并通入全氟丙烷气体3次，以确保在全氟丙烷气氛中进行超声，振幅40％。最后，超声时间为25秒，可以形成2.4微米的微泡。共聚焦荧光显微镜明场照片如图5所示。
[0085]
实施例4：peg
45-pfok
11
微泡在超声刺激下的稳定性研究
[0086]
将1ml peg
45-pfok
11
(实施例2)微泡产品通过使用100ml水稀释，然后输入到一次性输液器中。当微泡进入输液管时，流量停止。使用配备有谐波模式超宽带非线性对比成像技术的彩色多普勒超声系统获得b超模式和对比增强超声模式获得超声图像。所有微泡的初始浓度固定5g/l。利用imagej(nih)计算b超模式和对比增强超声模式下相应区域的超声成像信号。结果如图6所示。可以看出我们的微泡在超声刺激下的稳定性远高于传统商业微泡，以延长超声成像的时间。
[0087]
实施例5：mi-peg
45-pfok
11
微泡体内超声成像研究
[0088]
选择雌性新西兰白兔(由安徽医科大学动物中心提供)进行动物实验。随机选择雌性新西兰白兔(平均体重2kg)并通过腹膜内注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)进行麻醉。使用配备有谐波模式超宽带非线性对比成像技术的彩色多普勒超声系统对兔肝脏和肾脏进行b超模式和对比增强超声模式获得超声图像。mi-peg
45-pfok
11
微泡分散液以0.5ml/kg的剂量通过耳静脉注射。分别使用imagej(nih)计b超模式和对比增强超声模式下相应区域的超声
成像信号。如图7所示，左上图为b超模式下的兔肝成像，左下图为b超模式下的兔肾成像，右上图为为对比增强超声模式下的兔肝成像，右下图为为对比增强超声模式下的兔肾成像，都具有很强的超声信号。是一种高稳定且具有高成像信号的微泡。
[0089]
以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具体实施方式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以作出其他更改和变形。本发明的范围由所附权利要求限定。