结合CSF-1R的抗体及其用途的制作方法

结合csf-1r的抗体及其用途
1.相关申请和引用并入
2.本技术要求2019年5月15日提交的美国临时专利申请us 62/847,950的优先权。
3.上述申请、在上述申请中引用或在其审查过程中引用的全部文件(“申请引用文件”)，在本技术中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本技术引用文件”)，在本技术引用文件中引用或提及的所有文件，以及本技术或任意本技术引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本技术，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本技术，如同各文件具体且个别地通过引用的方式并入。在本技术中提及的任何genbank序列通过引用的方式并入本技术，这些genbank序列为本技术最早有效递交日的序列。
技术领域
4.大体而言，本技术涉及分离的单克隆抗体，特别是以高亲和力和功能性特异结合人csf-1r的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供一种编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本技术还提供包含该抗体或其抗原结合部分的免疫结合物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒、和药物组合物，以及使用本技术csf-1r抗体或其抗原结合部分的治疗方法。


背景技术：

5.集落刺激因子1受体(csf-1r)，一种iii型受体酪氨酸激酶，含有胞内激酶结构域、和构造在五个免疫球蛋白样亚结构域中的配体结合胞外域。其以较低量表达于造血干细胞，并以较高量表达于例如单核细胞和组织驻留巨噬细胞、破骨细胞和骨髓树突状细胞，并控制这些细胞类型的发展(stanley er and chitu v，(2014)cold spring harb perspect biol6(6)：a021857)。
6.csf1和il34是两个已知的csf-1r配体。il34表达限制在中枢神经系统和皮肤，而csf1为全身性表达(baghdadi m et al.，(2018)scientific reports 8(1)：418)。这两种配体的差异化表达引起经由csf-1r的差异化时空调节。
7.csf-1r与csf1或il34结合，激活csf-1r信号通路，在胚胎发育、骨生理、先天免疫、炎症、组织修复和肿瘤微环境中发挥作用(stanley er and chitu v，(2014)同上)。例如，研究表明，csf-1r信号通路会调节大多数循环和组织驻留巨噬细胞的产生、分化和稳态。csf1和/或il34表达的升高可能导致巨噬细胞功能失调，从而导致慢性炎性疾病如类风湿关节炎、骨关节炎和炎性肠病的发生。已证明，csf1和il34的双重阻断消除了小鼠模型中的关节炎或炎症性肠病(lin w et al.，(2019)frontiers in immunology 10：2019)。
8.csf1-csf-1r相互作用也与癌症的发生和进展有关。近来已发现，在移植mc38肿瘤细胞的小鼠中，肿瘤相关巨噬细胞的聚集需要csf1，而非il34，已知肿瘤相关巨噬细胞可以产生免疫抑制因子并有助于免疫抑制细胞如tregs(lin w et al.，(2019)同上)。csf1还支
持肿瘤微环境中的血管生成。除csf1外，csf-1r也在许多肿瘤例如卵巢癌和子宫内膜癌中过表达，且csf-1r的表达与较大的肿瘤体积以及降低的生存率相关(kluger，et al.(2004)clinical cancer research.10(1)：173-177；scholl，et al.(1994)journal of the national cancer institute.86(2)：120-126；et al.(1991)cancer，67(4)：990-996)。
9.csf-1r信号通路还被证实在骨重塑中发挥生理作用。基因敲除csf-1或csf-1r的动物均表现出骨质疏松表型。据报道，csf1阻断显著地减少了转移性骨病和类风湿关节炎模型中的骨质疏松(patel s and player mr，(2009)current topics in medicinal chemistry 9(7)：599-610)。
10.作为有潜力的治疗癌症、炎性疾病和骨质流失的候选药物，csf-1r抑制剂已经被研究多年。一种csf-1r抑制剂，培西达替尼(pexidartinib)，于2019年获fda批准用于腱鞘巨细胞瘤的治疗。然而，另一csf-1r抑制剂，卡比利珠单抗(cabiralizumab)，一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的单克隆抗体，在晚期胰腺癌的ii期临床试验中未达主要终点。因此，需要额外的csf-1r抑制剂，特别是具有增强的结合亲和力和其他所需药物特性的抗体，以用于治疗上述疾病。
11.在本技术中对任何文件的引用或标示，并不意味着认为这些文件是本技术的现有技术。


技术实现要素：

12.本技术提供一种分离的单克隆抗体，例如，小鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合csf-1r(例如人csf-1r)，并且相比于现有技术csf-1r抗体如卡比利珠单抗，具有相当的，如果不是更高的话，与人和/或猴csf-1r的结合亲和性/结合力，以及相当的，如果不是更高的话，对csf-1r-csf1/il34相互作用的阻断活性。
13.因此，在一个方面，本技术涉及结合csf-1r的分离的单克隆抗体(例如小鼠、嵌合或人源化抗体)或其抗原结合部分，包含重链可变区，该重链可变区可以包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中该cdr1区、cdr2区和cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：1、8和14；(2)seq id nos：2、9和15；(3)seq id nos：3、10和16；(4)seq id nos：4、11和17；(5)seq id nos：5、12和18；(6)seq id nos：5、12和19；(7)seq id nos：6、12和18；或(8)seq id nos：7、13和20具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
14.本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区，其可以包含与seq id nos：37、38(x1＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)、39、40、41、42、43、44或45具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。seq id no：37的氨基酸序列可以由seq id no：63或64的核苷酸序列编码。seq id no：38(x1＝r、x2＝t、x3＝a)的氨基酸序列可以由seq id no：65的核苷酸序列编码。
15.本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含轻链可变区，其可以包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中该cdr1区、cdr2区和cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：21、27和32；(2)seq id nos：22、28和33；(3)seq id nos：23、29和34；(4)seq id nos：24、30
和35；(5)seq id nos：25、29和36；或(6)seq id nos：26、31和34具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
16.本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含轻链可变区，其可以包含与seq id nos：46、47(x1＝i、x2＝s、x3＝k、k4＝p；x1＝i、x2＝y、x3＝t、x4＝l；x1＝l、x2＝s、x3＝t、x4＝l；x1＝i、x2＝s、x3＝t、x4＝l；或x1＝l、x2＝y、x3＝t、x4＝l)、48、49、50、51、52、53或54具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。seq id no：46的氨基酸序列可以由seq id no：66或67的核苷酸序列编码。seq id no：47(x1＝l、x2＝y、x3＝t、x4＝l)的氨基酸序列可以由seq id no：68的核苷酸序列编码。
17.在一些实施方式中，本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，各自可以包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中重链可变区cdr1、cdr2和cdr3、以及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3可以分别包含与(1)seq id nos：1、8、14、21、27和32；(2)seq id nos：2、9、15、22、28和33；(3)seq id nos：3、10、16、23、29和34；(4)seq id nos：4、11、17、24、30和35；(5)seq id nos：5、12、18、25、29和36；(6)seq id nos：5、12、19、25、29和36；(7)seq id nos：6、12、18、25、29和36；或(8)seq id nos：7、13、20、26、31和34具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
18.在一些实施方式中，本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)seq id nos：37和46；(2)seq id nos：38(x1＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)和47(x1＝i、x2＝s、x3＝k、k4＝p)；(3)seq id nos：38(xi＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)和47(x1＝i、x2＝y、x3＝t、x4＝l)；(4)seq id nos：38(x1＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)和47(x1＝l、x2＝s、x3＝t、x4＝l)；(5)seq id nos：38(x1＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)和47(x1＝i、x2＝s、x3＝t、x4＝l)；(6)seq id nos：38(x1＝v、x2＝r、x3＝a；x1＝r、x2＝t、x3＝a；或x1＝r、x2＝t、x3＝v)和47(x1＝l、x2＝y、x3＝t、x4＝l)；(7)seq id nos：39和48；(8)seq id nos：40和49；(9)seq id nos：41和50；(10)seq id nos：42和51；(11)seq id nos：43和52；(12)seq id nos：44和53；或(13)seq id nos：45和54具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
19.在一些实施方式中，本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含经二硫键连接的重链和轻链，重链可以包含重链可变区和重链恒定区，轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的c端与重链恒定区的n端相连，轻链可变区的c端与轻链恒定区的n端相连，重链可变区和轻链可变区可以包含上述氨基酸序列。重链恒定区可以是具有例如如seq id no：55所示氨基酸序列的人igg4恒定区，轻链恒定区可以是具有例如如seq id no：56所示氨基酸序列的人κ恒定区。重链恒定区也可以是人igg1或igg2恒定区。seq id nos：55和56的氨基酸序列可以分别由seq id nos：69和70的核苷酸序列编码。
20.在一些实施方式中，本技术的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或由两条重链
和两条轻链构成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或cdr序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或cdr序列。本技术的抗体可以是全长抗体，例如igg1、igg2或igg4亚型。在其他实施方式中，本技术的抗体或抗原结合部分可以是单链可变片段(scfv)，或抗体片段，例如fab或fab
′
2片段。
21.本技术还提供一种双特异性分子，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分，与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。本技术还提供免疫结合物，例如抗体-药物结合物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分，与治疗剂例如细胞毒素连接。在另一方面，本技术的抗体或其抗原结合部分可以制备成嵌合抗原受体(car)的一部分。还提供可包含该抗原嵌合受体的免疫细胞，例如t细胞。本技术的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒一起使用。
22.本技术还提供组合物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分，或免疫结合物、双特异性分子、溶瘤病毒、car或具有该car的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含用于治疗特定疾病的治疗剂，例如抗炎剂或抗癌剂。
23.本技术还涉及编码本技术抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体、和包含该表达载体的宿主细胞。还提供使用包含表达载体的宿主细胞制备csf-1r抗体或其抗原结合部分的方法，其可以包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分；以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体或其抗原结合部分。
24.另一方面，本技术提供一种在受试者中治疗肿瘤或癌症的方法，可以包括向该受试者施用治疗有效量的本技术抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，该方法可以包括施用本技术的药物组合物、双特异性分子、免疫结合物、具有car的免疫细胞、或者编码或携带抗体的溶瘤病毒，或者可选地，本技术中能够表达上述各分子的核酸分子或载体。在一些实施方式中，可以施用至少一种另外的抗癌抗体，例如pd-1抗体、lag-3抗体、和/或ctla-4抗体。在另一个实施方式中，如果合适的话，向受试者再施用细胞因子(例如il-2和/或il-21)、或共刺激抗体(例如cd137抗体和/或gitr抗体)。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合或人源化抗体。癌症或肿瘤包括但不限于卵巢癌、子宫内膜癌、腱鞘巨细胞瘤、胰腺癌、乳癌、宫颈癌、肺癌和前列腺癌。
25.在另一方面，本技术提供一种在受试者中治疗炎性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，该方法可以包括施用本技术的药物组合物、双特异性分子、免疫结合物、具有car的免疫细胞、或者编码或携带抗体的溶瘤病毒，或者可选地，本技术中能够表达上述各分子的核酸分子或载体。在一些实施方式中，还可以施用至少一种另外的抗炎剂，例如stat3抑制剂，特别是stat3抗体。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合或人源化抗体。炎性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、骨关节炎和炎性肠病。
26.另一方面，本技术提供一种用于治疗骨质流失的方法，包括但不限于牙周炎、组织细胞增生症、骨质疏松、佩吉特骨病(pdb)、由癌症疗法引起的骨质流失、假体骨解溶解和糖皮质激素诱导的骨质疏松症，该方法可以包括向受试者施用治疗有效量的本技术抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，该方法可以包括施用本技术的药物组合物、双特异性分子、免疫结合物、具有car的免疫细胞、或者编码或携带抗体的溶瘤病毒，或者可选地，本技术中能够表达上述各分子的核酸分子或载体。在又一个实施方式中，受试者可以进一步施
用共刺激抗体(例如cd137抗体和/或gitr抗体)。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合或人源化抗体。
27.基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本技术中引用的所有文献、genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
28.本技术的目标是不在本技术中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本技术并不打算在本技术的范围内包含任何不符合uspto(35u.s.c.
§
112，第一段)或epo(epc，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合epc第53条(c)和细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本技术同族或任何其他非同族或任何第三方在先申请中涉及本技术人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。
29.应当注意的是，在本技术中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；而术语例如“基本由...组成”或“基本由...构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。
附图说明
30.以下以示例方式给出但不意在将本技术限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
31.图1a-1b示出小鼠抗体2b6、3b1、1h8和1f7-2(a)、1g8、2b7、1d10-1和2b12(b)对细胞表面人csf-1r的结合力。
32.图2a-2c示出小鼠抗体3b1和2b7(a)、1d10-1、2b12、1f7-2和1h8(b)、和1g8(c)对人csf-1r-csf-1结合的阻断力。
33.图3a-3c示出小鼠抗体3b1、2b6和2b7(a)、1d10-1、2b12、1f7-2和1h8(b)、和1g8(c)阻断卡比利珠单抗-人csf-1r结合的能力。
34.图4a-4c示出小鼠抗体2b6、1g8和2b7(a)、1d10-1和2b12(b)、3b1、1h8和1f7-2(c)对由csf1结合诱导的csf1r酪氨酸磷酸化的抑制作用。
35.图5a-5c示出嵌合抗体2b6(a)、1h8(b)和1g8(c)对人csf-1r的结合力。
36.图6a-6b示出嵌合抗体2b6和1h8(a)、和1g8(b)对人csf-1r-csf-1结合的阻断力。
37.图7示出嵌合抗体2b6和1g8对由csf1结合诱导的csf1r酪氨酸磷酸化的抑制作用。
38.图8a-8b示出人源化抗体hu1g8-v1-hu1g8-v9(a)、和hu1g8-v10-hu1g8-v15(b)与人csf-1r的结合力。
39.图9示出人源化抗体hu1g8-v13与人csf-1r的结合力。
40.图10示出人源化抗体hulg8-v13与猴csf-1r的结合力。
41.图11示出人源化抗体hu1g8-v13对人csf-1r-csf-1结合的阻断力。
42.图12示出人源化抗体hu1g8-v13对人csf-1r-il34结合的阻断力。
43.图13示出人源化抗体hu1g8-v13对卡比利珠单抗-人csf-1r结合的阻断力。
44.图14示出人源化抗体hu1g8-v13对由csf1结合诱导的csf1r酪氨酸磷酸化的抑制。
45.图15示出人源化抗体hu1g8-v13与细胞表面人csf-1r的结合力。
46.图16示出人源化抗体hu1g8-v13的蛋白热漂移检测结果。
具体实施方式
47.为确保更好地理解本技术，在详细描述中阐明一些术语。
48.术语“csf-1r”是指集落刺激因子1受体，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体(m-csfr)和cd115。术语“csf-1r”可以包括变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人csf-1r蛋白特异的抗体可能在某些情况下与来自人以外物种(例如食蟹猴)的csf-1r蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人csf-1r蛋白特异的抗体可能完全对人csf-1r蛋白特异，而对其他物种或其他类型表现出无交叉反应性，或者可能与来自某些其他物种但不是所有其他物种的csf-1r交叉反应。
49.术语“人csf-1r”是指具有来自人的氨基酸序列，例如uniprotkb/swiss-prot登录号p07333.2的人csf-1r的氨基酸序列，的csf-1r蛋白。术语“猴csf-1r”或“cyno csf1r”是指具有来自食蟹猴的氨基酸序列，例如具有genbank登录号ehh54662的氨基酸序列，的csf-1r蛋白。
50.本文中的术语“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。全抗体是可以包含两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链可以由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区可以由三个结构域构成，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。各轻链可以由轻链可变区(简称v
l
)和轻链恒定区构成。轻链恒定区可以由一个结构域c
l
构成。vh和v
l
区可以进一步划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的骨架区(fr)区分隔开。各vh和v
l
由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(clq)，的结合。
51.本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如csf1r蛋白)能力的一个或多个片段。已知抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由v
l
、vh、c
l
和c
h1
构成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含由铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和c
h1
结构域构成的fd片段；(iv)由抗体单臂v
l
和vh结构域构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中v
l
和vh区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；以及huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片
段通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
52.本文所用的“分离的抗体”意指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与csf-1r蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合csf-1r蛋白以外抗原的抗体)。但是，特异结合人csf-1r蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的csf-1r蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
53.本文所用的术语“单克隆抗体”、“单抗”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组合物呈现出对于特定表位的单结合特异性和亲和力。
54.本文所用的术语“小鼠源抗体”或“小鼠抗体”意在包括可变区骨架和cdr区来自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本技术的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种cdr序列的抗体。
55.术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而制备的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是有得自某一物种的遗传物质以及得自另一物种遗传物质的抗体。
56.本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经修改成增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
57.术语“同型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如igm或igg1)。
58.术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
59.术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如，抗体与另一种制剂或抗体的结合物。
60.如本文所使用的，“特异结合人csf-1r”的抗体是指与人csf-1r蛋白(以及可能来自一种或多种非人物种的csf-1r蛋白)结合但基本不与非csf-1r蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人csf-1r蛋白，即kd值为1x10-8
m以下，更优选为5x10-9
m以下。
61.如本文所用的的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的kd为1x10-6
m以上，更优选1x10-5
m以上，更优选1x10-4
m以上，更优选1x10-3
m以上，更优选1x10-2
m以上。
62.本文所用术语“k
assoc”或“k
a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“k
dis”或“k
d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“k
d”是指从kd与ka的比(即kd/ka)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(m)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的kd值。用于确定抗体kd的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如biacore
tm
系统。
63.术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指抗体对于靶抗原的kd为1x10-6
m以下，更优选5x10-8
m以下，更优选1x10-8
m以下，更优选5x10-9
m以下，更优选1x10-9
m以下。然而，对于其他抗体亚型而言，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指抗体的kd为10-6
m以下，优选10-7
m以下，更优选10-8
m以下。
64.术语“ic
50”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体而言，抑制50％特定
生物或生化功能的抗体浓度。
65.术语“ec
50”，又叫半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体浓度。
66.术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
67.术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本技术抗体量。治疗有效量在所治疗疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。
68.本技术的多个方面在以下亚章节中更加具体地加以描述。
69.本技术的抗体与人csf-1r以及和猴csf-1r特异性结合，且亲和性与现有技术csf-1r抗体例如卡比利珠单抗相当或更佳。
70.本技术的抗体可以阻断csf-1r与csf1或il34结合，从而抑制由配体结合引起的csf-1r酪氨酸磷酸化。
71.本技术的抗体是单克隆抗体。此外或者另外可选地，抗体可以是例如小鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。
72.本技术的示例性抗体是在以下以及实施例中结构和化学表征的单克隆抗体。抗体的重/轻链cdr和可变区的氨基酸序列id编号总结于以下表1中，一些抗体具有相同的vh或v
l
。抗体的重链恒定区可以是具有如seq id no：55所示的氨基酸序列的人igg4重链恒定区，并且抗体的轻链恒定区可以是具有例如seq id no：56的氨基酸序列的人κ恒定区。本技术的抗体还可以包含人igg1重链恒定区和人κ轻链恒定区。
[0073][0074]
表1中的重链可变区cdr和轻链可变区cdr经kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，cdr区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如chothia、imgt、abm或
contact编号体系/方法确定。
[0075]
结合人csf-1r的其他csf-1r抗体的vh和v
l
序列(或cdr序列)可以与本公开的csf-1r抗体的vh和v
l
序列(或cdr序列)“混合和匹配”。优选地，当vh和v
l
链(或这些链中的cdr)混合并匹配时，来自特定vh/v
l
配对的vh序列被结构上相似的vh序列代替。同样地，优选来自特定vh/v
l
配对的v
l
序列经结构类似的v
l
序列替换。
[0076]
因此，在一个实施例中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以包括：
[0077]
(a)可包含表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和
[0078]
(b)可包含表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一csf-1r抗体的v
l
，其中抗体特异性结合人csf-1r。
[0079]
在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以包括：
[0080]
(a)列于表1中的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；以及
[0081]
(b)列于表1中的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3，或者另一csf-1r抗体的cdr，其中该抗体特异结合人csf-1r。
[0082]
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括csf-1r抗体的重链可变区cdr2区以及其他结合人csf-1r的抗体的cdr，例如重链可变区cdr1和/或cdr3，和/或另一csf-1r抗体的轻链可变区cdr1、cdr2和/或cdr3。
[0083]
因而，在另一实施方式中，本技术的抗体可以包含csf-1r抗体的重链可变区cdr2以及至少csf-1r抗体的重链和/或轻链可变区cdr3，或另一csf-1r抗体的重链和/或轻链可变区的cdr3，其中该抗体能够特异结合人csf-1r。优选这些抗体(a)竞争结合csf-1r；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本技术csf-1r抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含csf-1r抗体的轻链可变区cdr2，或者另一csf-1r抗体的轻链可变区cdr2，其中该抗体能够特异结合人csf-1r。在另一实施方式中，本技术的抗体还可以包括csf-1r抗体的重链/轻链可变区cdr1，或另一csf-1r抗体的重链和/或轻链可变区cdr1，其中该抗体能够特异结合人csf-1r。
[0084]
在另一实施方式中，本技术的抗体可以包含与本技术csf-1r抗体存在一个或多个保守修饰差异的重链和/或轻链可变区序列或cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域已知，一些保守序列修改可以在不使抗原结合性消失的情况下做出。参见，例如，brummell et al.，(1993)biochem 32：1180-8；de wildt et al.，(1997)prot.eng.10：835-41；komissarov et al.，(1997)j.biol.chem.272：26864-26870；hall et al.，(1992)j.immunol.149：1605-12；kelley and o
′
connell(1993)biochem.32：6862-35；adib-conquy et al.，(1998)int.immunol.10：341-6and beers et al.，(2000)clin.can.res.6：2835-43。
[0085]
因此，在一个实施方式中，抗体可以包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区可以包含包含cdr1、cdr2和cdr3序列，轻链可变区可以包含cdr1、cdr2和cdr3序列，其中：
[0086]
(a)重链可变区cdr1可以包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0087]
(b)重链可变区cdr3可以包含表1列出的序列，和其保守修改；和/或
[0088]
(c)轻链可变区cdr1、和/或cdr2、和/或cdr3序列可以包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
[0089]
(d)该抗体特异结合人csf-1r。
[0090]
本技术的抗体具有上述一项或多项功能特性，如与人csf-1r高亲和力结合，抑制
csf-1r与csf1或il34结合的能力，以及/或抑制配体结合引起的csf-1r酪氨酸磷酸化的能力。
[0091]
在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化、或嵌合抗体。
[0092]
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和pcr介导的突变，将修饰引入本技术抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的那些。领域内已定义出具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、b-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本技术抗体的cdr区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即，上述的功能)。
[0093]
本技术的抗体可以以具备本技术csf-1r抗体的一个或多个vh/v
l
序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，vh和/或v
l
)内(例如，在一个或多个cdr区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过在恒定区内修饰氨基酸残基，以例如改变抗体的效应功能。
[0094]
在某些实施方式中，cdr区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，cdr内的氨基酸序列比起cdr外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为cdr序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的cdr序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(riechmann et al.，(1998)nature 332：323-327；jones et al.，(1986)nature 321：522-525；queen et al.，(1989)proc.natl.acad；u.s.a.86：10029-10033；u.s.pat.nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0095]
因此，本技术的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其可以包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区可以包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3序列，轻链可变区可以包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3序列。尽管这些抗体包含本技术单克隆抗体的vh和v
l cdr序列，它们可以含有不同的骨架序列。
[0096]
这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开dna数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及kabat et al.，(1991)，同上；tomlinson et al.，(1992)j.mol.biol.227：776-798；和cox et al.，(1994)eur.j.immunol.24：827-836中获得，上述文件各自的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在genbank数据库中得到。例如，下列hco7 humab小鼠中的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng-0010109、nt
‑‑
024637&bc070333)、3-33(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)和3-7(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)。作为另一例子，以下来自hco12 humab小鼠的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng-0010109、nt
‑‑
024637&bc070333)、
5-51(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、4-34(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、3-30.3(caj556644)&3-23(aj406678)。
[0097]
通过使用本领域公知的称为空格blast的序列相似性搜索方法(altschul et al.，(1997))，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。
[0098]
用于本技术抗体的优选骨架序列是结构上与本技术抗体所用的骨架序列相似的那些。v
h cdr1、cdr2、和cdr3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者cdr序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如u.s.pat.nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0099]
另一类的可变区修饰是将vh和/或v
l cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或pcr介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变cdr区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
[0100]
此外，在另一实施方式中，本技术提供分离的csf-1r单克隆抗体或其抗原结合部分，其可以包含重链可变区，其包含：(a)v
h cdr1区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)v
h cdr2区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)v
h cdr3区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)v
l cdr1区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)v
l cdr2区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)v
l cdr3区，其可以包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
[0101]
本技术的基因改造抗体包括在vh和/或v
l
的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
[0102]
另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个cdr区的一个或多个残基进行突变，以去除t细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
[0103]
此外，或者作为骨架或cdr区内修饰之外的另一种选择，本技术的抗体可以基因改造成在fc区包含基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本技术的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能特性。
[0104]
在一个实施方式中，c
h1
铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少，铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变c
h1
铰链区的半胱氨酸残基，以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
[0105]
在另一个实施方式中，对抗体的fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入fc铰链片段的c
h2-c
h3
结构域连接区，从而抗体相对于天然fc-铰链结构域的金黄色葡萄球菌(spa)结合而言，具有减弱的spa结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
[0106]
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
[0107]
另外地或者可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型glcnac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的adcc活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本技术重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺少岩藻糖基转移酶基因fut8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在ms704、ms705和ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。ms704、ms705和ms709 fut8-/-细胞系通过在cho/dg44细胞中使用两种替换载体定向破坏fut8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和yamane-ohnuki et al.，(2004)biotechnol bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，ep 1,176,195记载了fut8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。ep 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体fc区的n-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公开本文wo 03/035835描述了cho变体细胞系，lec13细胞，其具有降低的向asn(297)-连接糖添加岩藻糖的能力，从而引起宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见shields et al.，(2002)j.biol.chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如在pct公开文本wo 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。在植物体系中制备抗体的方法在对应alston&bird llp律师记录号040989/314911的2006年8月11日提交的美国专利申请中有过记载。pct公开文本wo 99/54342记载了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-n-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型glcnac结构，其引起抗体增强的adcc活性(umana et al.，(1999)nat.biotech.17：176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-l-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(tarentino et al.，(1975)biochem.14：5516-23)。
[0108]
包含在本技术中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(peg)，例如peg的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个peg基团附于抗体或抗体片段
的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性peg分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的peg，例如单(cl-c10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在领域内已知，且可以应用到本技术的抗体。参见，例如epo 154 316和ep 0 401 384。
[0109]
本技术的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同分类。
[0110]
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pk值(marshall et al(1972)annu rev biochem 41：673-702；gala and morrison(2004)j immunol 172：5489-94；wallick et al(1988)j exp med 168：1099-109；spiro(2002)glycobiology 12：43r-56r；parekh et al(1985)nature 316：452-7；mimura et al.，(2000)mol immunol 37：697-706)。已知糖基化发生在含有n-x-s/t序列的基序中。在一些情况下，优选csf-1r抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域内的残基来实现。
[0111]
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在n-g或d-g序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
[0112]
各抗体将具有独特的等电点(pi)，其基本落在6-9.5的ph范围内。igg1抗体的pi通常落在7-9.5的ph范围内，而igg4抗体的pi基本落在6-8的ph范围内。推测pi在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选csf-1r抗体的pi值落在正常范围内。这可以通过选择pi在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。
[0113]
在另一方面，本技术提供编码本技术抗体重链和/或轻链可变区或cdr的核酸分子。核酸可以存在完整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“呈现为基本纯的”。本技术的核酸可以为例如dna或rna，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cdna分子。
[0114]
本技术的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核酸。
[0115]
优选的本技术核酸分子包括编码csf-1r单克隆抗体的vh和v
l
序列或cdr的那些。一旦获得了编码vh和v
l
的dna片段，这些dna片段可以进一步通过标准的重组dna技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操作中，编码vh或v
l
的dna片段与编码另一蛋白，例如抗体恒定区或柔性接头，的另一dna片段可操作地连接。术语“可操作地连接”结合上下文是指两个dna片段连接在一起，从而两个dna片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
[0116]
编码vh区的分离dna可以通过可操作地连接vh编码dna与编码重链恒定区(c
h1
、c
h2
和c
h3
)的另一dna分子而转变成全长重链基因。小鼠/人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是优选为igg1或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，编码vh区的dna可以可操作地与仅编码重链c
h1
恒定区的另一dna分子连接。
[0117]
编码v
l
区的分离dna可以通过可操作地连接v
l
编码dna与编码轻链恒定区c
l
的另一dna分子而转变成全长轻链基因(以及fab轻链基因)。小鼠/人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
[0118]
为创建scfv基因，编码vh和v
l
的dna片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段连接，从而vh和v
l
序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中v
l
和vh区域通过该柔性接头连接(参见，例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；mccafferty et al.，(1990)nature 348：552-554)。
[0119]
本技术的单克隆抗体(mab)可以使用熟知的kohler and milstein (1975)nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括b淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
[0120]
本技术的抗体还可以使用例如本领域公知的重组dna技术与基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中生成(例如morrison，s.(1985)science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的dna插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录以及翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
[0121]
术语“调控序列”意在包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如goeddel(gene ex-pression technology.methods in enzymology 185，academic press，san diego，calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(admlp)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如sra启动子系统，其包含来自sv40早期启动子的序列和人t细胞白血病i型病毒的长末端重复(takebe et al.，(1988)mol.cell.biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
[0122]
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区可以通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而vh部分与载体中的ch部分可操作地连接，v
l
部分与载体中的c
l
部分可操作地连接。此外，或者另外可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号
肽)。
[0123]
除抗体链基因和调控序列外，本技术的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于已导入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如对g418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于g418选择)。
[0124]
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”意在包括多种常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本技术抗体在理论上是可行的，最优选抗体在真核细胞中表达，最最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这类真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌出适当折叠且有免疫活性的抗体。
[0125]
优选的用于表达本技术重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括与dhfr可选择标记物一起施用的dhfr-cho细胞，在urlaub and chasin，(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77：4216-4220中有过描述，dhfr可选择标记物在例如r.j.kaufman and p.a.sharp(1982)j.mol.biol.159：601-621中描述)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。特别在使用nso骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是gs基因表达系统，记载于wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收。
[0126]
本技术的抗体可以与治疗剂结合，形成免疫结合物，例如抗体-药物结合物(adc)。合适的治疗剂包括抗代谢剂、烷化剂、dna小沟结合分子、dna嵌入剂、dna交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶i或ii抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在adc中，抗体和治疗剂优选地通过可切割的接头结合，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如val-cit、ala-val、val-ala-val、lys-lys、pro-val-gly-val-val、ala-asn-val、val-leu-lys、ala-ala-asn、git-git、val-lys、lys、git、ser或glu。adc可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；pct公开wo 02/096910；wo 07/038,658；wo 07/051,081；wo 07/059,404；wo 08/083,312；和wo 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。
[0127]
另一方面，本技术涉及可以包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本技术抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。因而，本文所用的，“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
[0128]
在一个实施方式中，除了fc结合特异性和csf-1r结合特异性之外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以针对抗增强因子(ef)，例如与细胞毒性中涉及的表面蛋白结合的分子，从而增加对靶细胞的免疫应答。例如，抗增强因子可以结合细胞毒性t细
胞(例如，经由cd2、cd3、cd8、cd28、cd4、cd40或icam-1)或其他免疫细胞，引起对靶细胞的免疫应答增强。
[0129]
双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，而不是具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scfv)构成，称为bs(scfv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同f(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。参见，例如kufer et al，同上；cao and suresh，bioconjugate chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van spriel et al.，immunology today，21(8)，391-397(2000)，以及其中引用的文献。
[0130]
溶瘤病毒偏好侵染并杀灭癌细胞。本技术的抗体可以与溶瘤病毒一起使用。或者，编码本技术抗体的溶瘤病毒可以引入到人体中。
[0131]
本技术还提供包含csf1r scfv的嵌合抗原受体(car)，该csf1r scfv可以包含本文所述的cdr、和重链/轻链可变区。
[0132]
csf1r car可以包含(a)可以包含csf1r scfv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导域。
[0133]
car可以在胞外抗原结合域的n-端含有信号肽，该信号肽指导新生受体进入内质网，以及在胞外抗原结合域的n-端的铰链肽，其使受体更容易结合。car优选地在胞内信号传导域包括主要胞内信号传导域和一个或多个共刺激信号传导域。主要使用的和最有效的主要胞内信号传导域是cd3-ζ胞质结构域，其包含itam，其磷酸化引起t细胞活化。共刺激信号传导域可以衍生自共刺激蛋白，例如cd28、cd137和ox40。
[0134]
car还可以添加增强t细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子，例如细胞因子、和共刺激配体。
[0135]
还提供基因修饰的免疫效应细胞，其可以包括本文提供的car。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t细胞、nk细胞、外周血单核细胞(pbmc)、造血干细胞、多能干细胞、或胚胎干细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t细胞。
[0136]
在另一方面，本技术提供一种药物组合物，其可以包含本技术的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上有效的成分，例如另一抗体或药物。本技术的药物组合物还可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或疫苗的组合疗法中施用。
[0137]
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在gennaro，ed.，remington：the science and practice of pharmacy，20th ed.(lippincott wil-liams&wilkins 2003)中有教导，该文献公开通用引用的方式并入本文。
[0138]
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的施用模式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、
心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本技术的抗体可以通过非肠道外的路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
[0139]
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
[0140]
可以与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上是产生疗效的组合的量。基本而言，以百分比计，该量为约0.01％-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最优选约1％-约30％。
[0141]
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
[0142]
对于抗体施用，剂量范围为宿主重量的约0.0001-100mg/kg，通常为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案涉及每周一次给药、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、或每3-6个月一次。本技术csf-1r抗体的优选给药方案包括1mg/kg体重、或3mg/kg体重，通过静脉内给药，其中抗体使用以下给药方案之一进行施用：(i)每4周六个剂量，之后每3个月；(ii)每3周；(iii)3mg/kg体重一次，之后每3周1 mg/kg体重。在一些方法中，调节剂量，以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
[0143]“治疗有效量”的本技术csf-1r抗体优选地引起疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期频率和持续时间的增加、或者防止由疾病折磨引起的损伤或失能。例如，对于荷瘤受试者的治疗，与未治疗受试者相比，优选“治疗有效量”将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选抑制至少约60％，更优选抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者通常为人，或者可以是另一哺乳动物。
[0144]
药物组合物可以是缓释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978。
[0145]
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)，上述文献通过引用的方式并入本文。
[0146]
在某些实施方式中，本技术的人单克隆抗体可以配制成确保合适的体内分布。例
如，为确保本技术的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685；umezawa et al.，(1988)biochem.biophys.res.commun.153：1038；bloeman et al.，(1995)febs lett.357：140；m.owais et al.，(1995)antimicrob.agents chemother.39：180；briscoe et al.，(1995)am.j.physiol.1233：134；schreier et al.，(1994)j.biol.chem.269：9090；keinanen and laukkanen(1994)febs lett.346：123；和killion and fidler(1994)immunomethods 4：273。
[0147]
本技术的抗体(组合物、双特异分子、免疫结合物、带有car的免疫细胞、和溶瘤病毒)在体外和体内有许多效用，涉及例如癌症、炎性疾病或骨质流失的治疗。抗体(组合物、双特异性分子、免疫结合物、带有car的免疫细胞和溶瘤病毒)可以施用于人受试者，例如在体内抑制肿瘤生长或骨质流失，或治疗炎性疾病。
[0148]
csf-1r可能通过三种不同的机制参与到肿瘤生长和转移中。第一个是，源自女性生殖系统(乳房、卵巢、子宫内膜、宫颈)的肿瘤细胞中发现存在csf-1和csf-1r的表达(scholl，s.m.，et al.，(1994)j.natl.cancer inst.86，120-126；kacinski，b.m.，(1997)mol.reprod.dev.46，71-74；ngan，h.y.，et al.，(1999)eur.j.cancer.35，1546-1550；kirma，n.，et al.，(2007)cancer res.67，1918-1926)，并且该表达与乳癌异种移植生长以及乳癌患者预后差相关。在一个研究中，在测试的急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病和骨髓增生患者中，约10-20％患者的csf-1r存在两点突变，且其中一个突变会破坏受体翻转(ridge，s.a.，et al.，(1990)proc.natl.acad.sci usa.87，1377-1380)。然而，在稍后的研究中没有确证突变的发生率(abu-duhier，f.m.，et al.，(2003)br.j.haematol.120，464-470)。在一些肝细胞癌(yang，d.h.，et al.，(2004)hepatobiliary pancreat.dis.int.3，86-89)和特发性骨髓纤维化(abu-duhier，f.m.，et al.，(2003)br.j.haematol.120，464-470)病例中也发现了突变。
[0149]
可能因csf-1基因转位而与胶原基因col6a3融合并导致csf-1过表达，而导致色素沉着绒毛结节性滑膜炎(pvns)和腱鞘巨细胞瘤(tgct)的发生(west，r.b.，et al.，(2006)proc.natl.acad.sci.usa.103，690-695)。景观效应被认为是引起肿瘤肿块的原因，该肿块由csf-1表达细胞所吸引的单核细胞所构成。
[0150]
第二种机制基于在骨转移位置处阻断经由csf-1-csf-1r的信号通路，其诱导破骨细胞形成、骨吸收和骨溶解性骨病变。乳癌、多发性骨髓瘤和肺癌是已发现对骨转移并导致骨溶解性骨病变从而引起骨骼并发症的癌症实例。肿瘤细胞和基质释放的csf-1与核因子κ-b配体受体活化因子-rankl合作诱导造血髓系单核细胞祖细胞向成熟破骨细胞分化。在此过程中，m-csf通过向破骨细胞发出生存信号而起到许可因子的作用(tanaka，s.，et al.，(1993)j.clin.invest.91，257-263)。csf-1r抗体在破骨细胞分化和成熟过程中抑制csf-1r活性，可能可以防止破骨细胞的不平衡活性，这种不平衡活性可导致溶骨疾病和转移性疾病中的相关骨骼事件。乳癌、肺癌和多发性骨髓瘤通常导致溶骨性病变，而前列腺癌中转移到骨最初具有成骨的外貌，即增强的骨形成活动引起“网状骨”，这与正常骨的典型板层结构不同。在疾病进展期间，骨病变显示出大量的骨溶解成分以及较高的血清骨吸收量，表明抗骨吸收治疗可能是有用的。双膦酸盐已显示出可以抑制溶骨病变的形成，并减少
骨相关事件的数量，但仅限患有去势抵抗性转移前列腺癌，在这点上，它们对于成骨病变的作用是有争议的，且双膦酸盐迄今还未在防止骨转移或激素敏感型前列腺癌上显示出有益效应。临床中已研究了抗骨吸收剂在混合溶骨/成骨前列腺癌中的作用(choueiri，m.b.，et al.，(2006)cancer metastasis rev.25，601-609；vessella，r.l.and corey，e.，clin.(2006)cancer res.12，6285s-6290s)。
[0151]
第三种机制基于最近的发现，即乳腺、前列腺、卵巢癌和宫颈癌实体肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞(tam)与不良预后相关(bingle，l.，et al.，(2002)j.pathol.196，254-265；pollard，j.w.，(2004)nat.rev.cancer.471-78)。巨噬细胞经csf-1和其他趋化因子而集中到肿瘤。巨噬细胞可以通过分泌血管生成因子、蛋白酶和其他生长因子和细胞因子来促成肿瘤发展，且可以通过抑制csf-1r信号通路来阻断。zins等人(zins，k.，et al.(2007)，cancer res.67，1038-1045)示出，肿瘤坏死因子α(tnf-α)、csf-1或两者的sirna表达，可以在瘤内注射相应sirna后，使异种移植小鼠模型中的肿瘤生长减少34％-50％。靶向人sw620细胞分泌的tnf-α的sirna降低了小鼠csf-1水平，引起肿瘤中巨噬细胞的减少。此外，用针对csf-1的抗原结合片段处理mcf7异种肿瘤移植，在与化疗药物联合使用时，引起40％的肿瘤生长抑制，逆转了对化疗药物的耐性，并提高了小鼠的存活率(paulus，p.，et al.，(2006)cancer res.66，4349-4356)。
[0152]
tam只是新出现的慢性炎症与癌症之间连接点的一个例子。对于炎症与癌症之间的相关性，还有其他证据。例如，许多慢性疾病与癌症风险增加有关，癌症发生在慢性炎症部位，许多癌症中发现了化学炎症介质。此外，清除细胞或化学炎症介质可以抑制癌症的发展，长期使用抗炎药物可以降低某些癌症的风险。多种炎性症状存在与癌症的相关性，其中，胃癌与幽门螺杆菌引起的胃炎有关，膀胱癌与血吸虫病有关，卡波西式肉瘤与hhvx有关，卵巢癌与子宫内膜异位症有关，且前列腺癌与前列腺炎有关(balkwill，f.，et al.，(2005)cancer cell.7，211-217)。巨噬细胞是慢性炎症的关键细胞，对其微环境有着不同的反应。有两种类型的巨噬细胞被认为是功能状态的极端：m1巨噬细胞参与1型反应。这些反应涉及微生物产物的激活和随后致病微生物的杀灭，产生活性氧中间体。在极端的另一端是m2巨噬细胞，参与2型反应，促进细胞增殖，调节炎症和适应性免疫，促进组织重塑、血管生成和修复(mantovani，a.，et al.，(2004)trends immunol.25，677-686)。导致肿瘤形成的慢性炎症通常与m2巨噬细胞有关。tnf是介导炎症反应的关键细胞因子，名副其实，在高剂量时可以刺激抗肿瘤免疫和出血性坏死，但也被发现由肿瘤细胞表达，并作为肿瘤启动子(zins，k.，et al.，(2007)cancer res.67，1038-1045；balkwill，f.，(2006)cancer metastasis rev.25，409-416)。巨噬细胞在肿瘤中的具体作用仍然需要更多的了解，包括其对功能的潜在空间和时间依赖性以及与特定肿瘤类型的相关性。
[0153]
因此，本公开的一个实施方式是本公开的csf-1r抗体用于治疗癌症。本文所用的术语“癌症”可以是例如肺癌、非小细胞肺(nscl)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、腹部癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺的癌症、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、
室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞白血病，包括任何上述癌症的难治版本，或一种或多种上述癌症的组合。优选地，癌症是乳癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌或前列腺癌。优选地，此类癌症由csf-1或csf-1r表达或过表达所表征。本技术的另一个实施方式是本技术csf-1r抗体，用于同时治疗原发性肿瘤和新转移。或者，csf-1r抗体可以与用于癌症治疗的其他免疫原性剂如溶瘤病毒或其他抗体结合使用。
[0154]
本公开的另一个实施方式是本技术csf-1r抗体，用于治疗骨质流失，例如牙周炎、组织细胞增生症、骨质疏松、佩吉特骨病(pdb)、由癌症疗法引起的骨流失、假体骨解、和糖皮质激素诱导的骨质疏松症。
[0155]
根据另一个实施方式，本技术涉及本技术的抗体、核酸序列、载体、或药物组合物用于炎症和/或自免疫相关疾病的治疗。这些疾病可以包括，但不限于，血清阴性脊柱关节病(银屑病关节炎、强直性脊柱炎、赖特综合征、与炎性肠病相关联的脊柱关节病)、人工关节松动、结缔组织病(幼年类风湿性关节炎、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(sle)和红斑狼疮、硬化病、干燥综合征、混合性结缔组织病、多肌炎、皮肌炎)、炎性肠病(例如克罗恩氏病；溃疡性结肠炎)、惠普尔病、与肉芽肿性结肠炎相关的关节炎、炎性皮肤状况(自免疫大疱性类天疱疮、自免疫寻常型天疱疮、湿疹、皮炎)、炎性肺病(肺泡炎、肺纤维化、结节病、哮喘、支气管炎、闭塞性细支气管炎)、炎性肾病(肾小球肾炎、肾同种异体移植排斥、肾小管炎症)、动脉粥样硬化、全身血管炎(巨细胞动脉炎、多发性大动脉炎、结节性多动脉炎、川崎病、韦格纳肉芽肿、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、微观多动脉炎、坏死性肾小球肾炎、过敏性紫癜、原发性冷凝球蛋白性血管炎和其他小血管炎、贝西氏症)、巨噬细胞活化病(巨噬细胞活化综合症(mas)、成人史迪尔氏症候群、噬血细胞综合征)、风湿性多肌痛、原发胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自免疫性肝炎、i型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格里夫氏症、多发性硬化(ms)、格林-巴利综合征、爱迪生氏病、和/或雷诺现象、古巴斯捷氏综合征。
[0156]
已证实，csf-1基因中的snp表现出与侵袭性牙周炎的正相关性，即因牙槽骨吸收而造成牙齿损伤的牙周组织炎性疾病(rabello，d.，et al.，(2006)biochem.biophys.res.commun.347，791-796)。
[0157]
组织细胞增生症(又称为朗格汉斯细胞组织细胞增生症，lch)是朗格汉斯树突状细胞的增殖性疾病，该细胞似乎在骨和骨外lch病变中分化为破骨细胞。朗格汉斯细胞来源于外周单核细胞。在与疾病严重程度有相关性的血清和病变中检测到升高的m-csf量(da costa，c.e.，et al.，(2005)j.exp.med.201，687-693)。该疾病主要发生于儿科病人群体，当病发展为全身性或复发时，需要进行化疗。
[0158]
骨质疏松症的生理病理是由成骨细胞的流失和增加的破骨细胞依赖性骨吸收介导的。cenci等人的支持数据表明，csf-1抗体注射可保持去卵巢小鼠的骨密度并抑制骨吸收(cenci，s.，et al.，(2000)j.clin.invest.105，1279-1287)。近来发现了因雌激素缺乏引起的绝经后骨流失的潜在联系，且发现产出tnfα的t细胞的存在会影响骨代谢(roggia，c.，et al.，(2004)minerva med.95，125-132)。可能的机制是体内tnfα诱导csf-1。csf-1在tnfα诱导的破骨细胞形成中的重要作用，已经经靶向csf-1的抗体阻断tnfα诱导的小鼠骨溶解而得到证实，从而使得csf-1r信号通路抑制剂成为炎性关节炎的潜在靶点(kitaura，h.，et al.，(2005)j.clin.invest.115，3418-3427)。
[0159]
佩吉特骨病(pdb)是仅次于骨质疏松症的第二常见的骨代谢疾病，其中骨转换增
加的局灶性异常引起骨痛、变形、病理性骨折和耳聋等并发症。已经发现有四种基因的突变调节正常破骨细胞功能，使个体易患pdb和相关疾病：tnfrsf11a的插入突变，其中tnfrsf11a编码细胞核因子受体激活因子(nf)κb(rank)——一种破骨细胞功能的关键调节因子，编码骨保护素的tnfrsf11b(rank配体的诱饵受体)的失活性突变，死骨片蛋白1基因(sqstm1)的突变，sqstm1编码nfκb通路中重要的支架蛋白，以及含缬酪肽蛋白(vcp)的突变。该基因编码vcp，其在靶向nfκb抑制剂以经蛋白酶降解中发挥作用(daroszewska，a.and ralston，s.h.，(2006)nat.clin.pract.rheumatol.2，270-277)。靶向csf-1r抑制剂提供间接阻断rankl信号通路脱调的机会，并为目前使用的双膦酸盐增加了另外的治疗选择。
[0160]
癌症治疗引起的骨流失，特别是在乳癌和前列腺癌患者中，是额外的适应症，其中靶向csf-1r抑制剂可以防止骨流失(lester，j.e.，et al.，(2006)br.j.cancer.94，30-35)。随着早期乳癌预后的改善，辅助治疗的长期后果变得更加重要，因为一些治疗，包括化疗、放疗、芳香酶抑制剂和卵巢摘除，通过降低骨骼矿物质密度来影响骨代谢，引起骨质疏松和相关骨折的风险增加(lester，j.e.，et al.，(2006)br.j.cancer.94，30-35)。与乳癌的辅助芳香酶抑制剂治疗相当的是，前列腺癌的雄激素阻断治疗，其会导致骨骼矿物质密度的流失，显著增加骨质疏松相关骨折的风险(stoch，s.a.，et al.，(2001)j.clin.endocrinol.metab.86，2787-2791)。
[0161]
当靶向细胞类型包括破骨细胞和巨噬细胞时，例如，在治疗因类风湿性关节炎而置换关节引起的特定并发症时，csf-1r信号通路的靶向抑制也很可能在其他适应症中是有益的。由于假体周围骨流失以及所带来的假体脱落而引起的植入失败是关节置换术的主要并发症，需要反复手术，对个体患者和医疗系统造成很高的社会经济负担。
[0162]
糖皮质激素诱导的骨质疏松症(giop)是另一指征，其中在慢性阻塞性肺病、哮喘和类风湿关节炎等各种疾病中，在长期使用糖皮质激素后，csf-1r抑制剂可防止骨流失(guzman-clark，j.r.，et al.，(2007)arthritis rheum.57，140-146；feldstein，a.c.，et al.，(2005)osteoporos.int.16，2168-2174)。
[0163]
类风湿关节炎、银屑病关节炎和炎性关节炎是csf-1r信号通路抑制剂的潜在应用适应症，因为它们由巨噬细胞成分构成，并具有不同程度的骨骼破坏(ritchlin，c.t.，et al.，(2003)j.clin.invest.111，821-831)。骨关节炎和类风湿性关节炎是由结缔组织中巨噬细胞聚集和巨噬细胞浸润滑膜液引起的炎症性自身免疫疾病，其至少部分地由csf-1介导。已表明，csf-1在体外由人关节组织细胞(软骨细胞、滑膜成纤维细胞)产生，并存在于类风湿性关节炎患者的滑膜液中，表明其有助于滑膜组织增殖和巨噬细胞浸润，这与疾病的发病机制有关(campbell，i.，k.，et al.，(2000)j.leukoc.biol.68，144-150)。csf-1r信号通路的抑制可能会控制关节中巨噬细胞的数量，并减轻相关骨损伤带来的疼痛。为尽量减少不良反应，并进一步了解csf-1r信号通路在这些适应症中的作用，一个方法是特异性地抑制csf-1r，而不靶向各种激酶，如raf激酶。
[0164]
文献也报道了慢性冠状动脉疾病中外周m-csf增加与不良预后以及动脉粥样硬化进展的相关性(saitoh，t.，et al.，j(2000).am.coll.cardiol.35，655-665；ikonomidis，i.，et al.，(2005)eur.heart.j.26，1618-1624)。csf-1通过协助表达csf-1r并表现为初始斑块的泡沫细胞(含有吞入的氧化ldl的巨噬细胞)的形成，来影响动脉粥样硬化过程(murayama，t.，et al.，(1999)circulation99，1740-1746)。
[0165]
csf-1和csf-1r在活化的小胶质细胞中也有表达和信号转导。小胶质细胞是中枢神经系统的驻留巨噬细胞，可被包括感染、创伤在内的多种因素所激活。csf-1被认为是大脑炎症反应的关键调节因子，且csf-1的量在脑炎、阿尔茨海默病(ad)和脑瘤中升高。csf-1/csf-1r自分泌信号转导引起的小胶质细胞增生，诱导炎症细胞因子以及一氧化氮释放，如通过例如使用实验性神经元损伤模型所证实的(hao，a.j.，et al.，(2002)neuroscience.112，889-900；murphy，g.m.，jr.，et al.，(1998)j.biol.chem.273，20967-20971)。在ad以及在淀粉样前体蛋白v717f转基因小鼠ad模型的斑块周围发现了csf-1r表达增加的小胶质细胞(murphy，g.m.，jr.，et al.，(2000)am.j.pathol.157，895-904)。另一方面，与正常对照组相比，脑部小胶质细胞较少的op/op小鼠具有a-β纤维沉积和神经元丢失，表明小胶质细胞在ad发展中有着神经保护功能，而这在op/op小鼠中是缺失的(kaku，m.，et al.，(2003)brain res.brain res.protoc.12，104-108)。
[0166]
此外，csf-1和csf-1r的表达和信号转导也与炎性肠病(ibd)相关(参见wo 2005/046657)。
[0167]
尽管已经具体描述了本技术及其有利之处，应当明白的是，可以在本文中做出多种变化、替换和改变，而不脱离在所附权利要求中定义的本发明的宗旨和范围。
[0168]
本发明将在以下实施例中进一步阐明，实施例仅以示例的目的给出，而不以任何形式限制本发明。
[0169]
实施例
[0170]
实施例1通过杂交瘤技术制备小鼠源csf-1r单克隆抗体
[0171]
免疫
[0172]
根据e harlow，d.lane，antibody：a laboratory manual，cold spring harbor labora-tory press，cold spring harbor，n.y.，1998中所述的方法免疫小鼠。c端带人igg1 fc标签的重组人csf-1r蛋白(aa ile 20-glu 512)(acro biosystems，cat#csr-h5258)用作免疫原。人csf-1r-his蛋白(acro biosystems，cat#csr-h5228)用于测定血清效价以及筛选分泌抗原特异性抗体的杂交瘤。
[0173]
免疫剂量包含用于初次免疫的50μg人csf-1r-fc蛋白/小鼠/注射，以及用于增强免疫的25μg人csf-1r-fc蛋白/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂(sigma，st.louis，mo.，usa)。简而言之，制备佐剂-抗原混合物时，首先使用涡旋混合器在小瓶中轻柔地混合佐剂。将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5ml微量离心管中。将抗原配制在pbs或盐水中，浓度为0.25-0.34mg/ml，然后将计算出的抗原量加到含有佐剂的微量离心管中。通过轻柔地涡旋2分钟，来混合所得的溶液，以形成油包水的乳状液。之后将佐剂-抗原液吸到适当的注射器中，进行动物注射。以150-200μl的体积，共注射50或25μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于血清效价进行2-3次加强。在细胞融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后一次加强。
[0174]
杂交瘤融合和筛选
[0175]
培养小鼠骨髓瘤细胞系(sp2/0-ag14，atcc#crl-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据kohler g，and milstein c，
″
continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity，
″
nature，256：495-497(1975)中提到的方法与骨髓瘤细胞融合。
[0176]
之后将融合的“杂交细胞”在dmem/20％fcs/hat培养基中于96孔细胞板铺板。融合后的7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤群落。在两周后，使用重组人csf1r-his蛋白，对各孔的上清液进行直接elisa和捕获elisa测试。之后选出分泌人csf1r-his结合抗体的阳性杂交瘤。经配体阻断elisa，对这些杂交瘤进一步测试其阻断csf1-his蛋白结合csf1r-fc的活性。通过有限稀释，对产出有具备csf1r高特异结合性以及csf1-csflr阻断活性的抗体的杂交瘤克隆进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性，之后纯化单克隆抗体。简单而言，使用5-10倍柱体积的pbs缓冲液冲洗蛋白a琼脂糖色谱柱(bestchrom(shanghai)biosciences，cat#aa0273)。使细胞上清通过柱子，然后用pbs缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸-hcl，ph 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1m tris-hcl，ph 9.0)的1.5ml管中。将含有免疫球蛋白的部分混合，并在pbs中4℃透析过夜。随后，如下所述对纯化单克隆抗体的功能活性进行体外表征。
[0177]
实施例2使用biacore表面等离子体共振技术的小鼠csf-1r单克隆抗体的亲和力测定
[0178]
用biacore t200系统(ge healthcare，pittsburgh，pa，usa)对实施例1中生成的纯化csf-1r小鼠单克隆抗体(mab)进行亲和性和结合动力学表征。
[0179]
简单地说，使用biacore提供的标准胺偶联试剂盒(ge healthcare，pittsburgh，pa，usa)，将山羊抗小鼠igg(ge healthcare，cat#br100838，小鼠抗体捕获试剂盒)经伯胺共价连接到cm5芯片(ge healthcare#br100530，羧甲基葡聚糖包被的芯片)，将蛋白g芯片(ge healthcare，cat#29-1793-15)用于对照基准物的亲和力测定。生物传感器表面未反应的基团用乙醇胺阻断。然后使实施例1中生产的纯化小鼠csf-1r抗体和卡比利珠单抗(内部制备，重链氨基酸序列为seq id no：57，轻链氨基酸序列为seq id no：58，也称为对照基准物)以浓度10μg/ml流到芯片上，流率为10μl/min。然后，梯度稀释的重组人csf-1r-his(acro biosystems，cat#csr-h5228，起始浓度为120nm)或猴csf-1r-his蛋白(acro biosystems，cat#csr-c52e1，起始浓度为200nm)，即在hbs-ep

缓冲液(biacore提供)中2倍梯度稀释，以30μl/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用biacore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1 langmuir结合模型中。
[0180]
确定ka、kd和kd值，并总结在以下表2中。
[0181]
本技术的所有小鼠抗体均与人csf-1r特异性结合，且与对照基准物相比，具有相当或更高的结合亲和力，其中抗体2b6、1g8、2b7、1d10-1和2b12具有最高的结合亲和力。本技术的所有小鼠抗体也均以高结合亲和力与猴csf-1r特异性结合。
[0182]
表2.小鼠csf-1r单克隆抗体的结合亲和力
[0183][0184]
实施例3流式细胞术(facs)检测csf-1r单克隆抗体与过表达人csf-1r的细胞系表面的结合
[0185]
采用博奥信内部制备的在细胞膜上稳定表达全长人csf-1r(uniprot#p07333，seq id no.：59)的293f-csf-1r细胞，经流式细胞术(facs)检测本技术小鼠csf-1r抗体与293f-csf-1r细胞表面表达的csf-1r的结合活性。按照lipofectamine 3000转染试剂(thermo fisher)的说明书，用noti和xbai位点之间插入有csf-1r编码序列的pcdna3.1质粒转染293f细胞(thermofisher inc.，cat#11625019)，制备出293f-csf-1r细胞。选出名为293f-csf-1r的稳定细胞群，用于之后的基于细胞的结合facs。
[0186]
具体来说，从细胞培养瓶中收集293f-csf-1r细胞，洗涤两次，在含2％v/v胎牛血清的磷酸盐缓冲液(pbs)(facs缓冲液)中重悬。96孔板中每孔2
×
105细胞，在冰上，在100μl于facs缓冲液中的不同浓度的csf-1r抗体或对照(起始浓度为120nm，4倍连续稀释)中孵育40分钟。细胞用facs缓冲液洗涤两次，并加入100μl/孔r-藻红蛋白亲和纯化f(ab’)2片段山羊抗小鼠igg(h l)(1：1000稀释于facs缓冲液，jackson immunoresearch，cat#115-116-146)。4℃暗室孵育40分钟后，细胞洗3次并用facs缓冲液重悬。使用becton dickinson facs canto ii-hts设备进行荧光测定。采用graphpad prism软件进行数据分析，得出ec
50
值。
[0187]
结果如图1a-1b所示。
[0188]
可以看出，本技术的小鼠csf-1r抗体特异性地结合人csf-1r，与卡比利珠单抗相比结合活性相当或较低。如图1b所示，抗体1d10-1示出比对照基准物更高的bmax(最大结合度)。
[0189]
实施例4小鼠csf-1r抗体对csf-1r-对照基准物或csf-1r-csf-1结合的阻断活性
[0190]
4.1配体阻断elisa
[0191]
通过竞争性elisa检定来测量本技术csf-1r抗体阻断csf-1r-csf-1结合的能力。简单地说，用100μl于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)中的人csf-1-his蛋白(内部制备，氨基酸序列为seq id no：60)包被96孔微量滴定板，100ng/孔，4℃过夜。次日，板用洗涤缓冲液(pbs 0.05％tween-20，pbst)冲洗，再用含5％w/v脱脂奶粉的pbst于37℃封闭2小时。
systems，cat#dyc3268-5)对细胞裂解液中磷酸化的csf-1r酪氨酸的量进行定量。采用graphdad prism软件进行数据分析，得出ic
50
值。
[0202]
结果如图4a-4c所示。
[0203]
可以看出，本技术的所有抗体均能抑制293f-csf-1r细胞中由csf1结合诱导的csf-1r酪氨酸磷酸化，抑制活性与卡比利珠单抗相当或更高。具体地，抗体2b6具有最高的抑制活性。
[0204]
实施例6嵌合抗体的制备与表征
[0205]
对csf-1r小鼠单克隆抗体的重链和轻链可变区进行测序，其序列id编号汇总于表1。
[0206]
将csf-1r小鼠mab 2b6、1g8和1h8的重链和轻链可变区分别同框克隆至人igg4重链恒定区(seq id no.：55)和人κ轻链恒定区(seq id no.：56)，其中可变区的c端连接到各自恒定区的n端。
[0207]
各自包含编码连接于人igg4重链恒定区的重链可变区的核苷酸的载体、以及各自包含编码连接于人κ轻链恒定区的轻链可变区的核苷酸的载体，以轻链比重链为1.1∶1的比率，经1mg/ml pei瞬时转染到50ml的293f悬浮细胞培养物中。
[0208]
摇瓶培养6天后，收集含有嵌合抗体的细胞上清，然后从细胞上清中纯化出嵌合抗体。根据以上实施例和后述的方法步骤，采用捕获elisa、octet亲和测试、配体阻断elisa和基于细胞的功能检测来测试抗体。
[0209]
在捕获elisa中，96孔板用100μl于pbs中的2μg/ml亲和纯化山羊抗人igg(特异于f(ab’)2片段，jackson immunresearch，cat#109-005-097)37℃包被2小时。用洗涤缓冲液(pbs 0.05％tween-20，pbst)洗板一次，然后用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的pbst)37℃封闭2小时。再次洗板，并与100μl/孔梯度稀释的本技术嵌合csf-1r抗体、对照基准物、或阴性对照higg(静脉注射用人免疫球蛋白(ph4)，hualan biological engineering inc.)(用含2.5％脱脂奶粉的pbst进行5倍稀释，起始浓度10000ng/ml)37℃孵育40分钟，然后再洗4次。在含有捕获的csf-1r抗体的板中加入100μl/孔生物素标记的人csf-1r-fc蛋白(内部制备，氨基酸序列seq id no：61，0.24nm，于含2.5％脱脂奶粉的pbst中)，37℃孵育40分钟，洗涤4次，再与链霉亲和素结合的hrp(1：10000稀释于pbst，jackson immuno research，cat#016-030-084，100μl/孔)37℃孵育40分钟。最终洗涤后，板用100μl/孔elisa底物tmb(innoreagents，cat#tmb-s-002)室温孵育。3-10分钟后，用50μl/孔1m h2so4终止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于tmb，630nm作为参照波长。用od(450-630)值和抗体浓度做图。使用graphpad prism软件对数据进行分析，得出ec
50
值。结果示于图5a-5c。
[0210]
使用octet系统(fortebio，octet red 96)，进行octet亲和测试。简单地说，ahc生物传感器(抗-人igg fc捕捉，fortebio)用10mm甘氨酸(ph 1.5)预浸3秒，然后浸入有流动缓冲液(含0.5％w/v bsa的pbst)的孔中3秒。预浸和浸入步骤重复三次。然后将传感器浸入到于hbs-ep

中的5μg/ml嵌合csf-1r抗体或对照基准物所在的孔中100秒，然后在有流动缓冲液的孔中浸泡5分钟。在另一具有流动缓冲液的孔中运行新基线180秒。然后将传感器浸入于流动缓冲液中的梯度稀释人csf-1r-his蛋白(acro biosystems，cat#csr-h5228，起始浓度40nm，2倍梯度稀释)所在的孔中100秒，然后浸入基线孔中10分钟。最后，将传感器用
10mm甘氨酸(ph 1.5)预浸3秒，然后在流动缓冲液的孔中浸泡3秒。预浸和浸入步骤重复三次。利用octet评估软件，在1∶1的langmuir结合模型中拟合结合与解离曲线。确定kd值，汇总于以下表3中。
[0211]
csf1r-csf1配体阻断elisa和csf-1r酪氨酸磷酸化抑制试验的结果分别如图6a-6b以及图7所示。
[0212]
数据显示，嵌合csf-1r抗体具有与亲代小鼠mab相似的结合亲和力/能力以及配体阻断活性。特别是，在捕获elisa检测中，嵌合抗体2b6、1h8和1g8显示出比卡比利珠单抗更高的结合力。
[0213]
表3.嵌合抗体的结合亲和力
[0214][0215]
实施例7 csf-1r小鼠单克隆抗体1g8的人源化
[0216]
小鼠csf-1r抗体1g8进行人源化并进一步表征。小鼠抗体的人源化使用领域内成熟的cdr移植法进行，以下具体描述。
[0217]
为选择小鼠抗体1g8人源化的受体框架，将1g8的轻链和重链可变区序列与人免疫球蛋白基因数据库进行对比检索。选择同源性最高的人种系作为人源化的受体框架。将小鼠抗体重/轻链可变区cdr插入所选框架内，对框架内的残基进行回复突变，获得更多候选的重链/轻链可变区。共获得15个人源化1g8抗体，即hu1g8-v1至hu1g8-v15，其重/轻链可变区序列id编号也汇总于表1。
[0218]
各自包含编码连接于人igg4重链恒定区(seq id no：55)的人源化重链可变区的核苷酸的载体、和各自包含编码连接于人κ轻链恒定区(seq id no：56)的人源化轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1∶1的轻链重链比，经1mg/ml pei，瞬时转染到200ml 293f悬浮细胞培养物中。
[0219]
实施例8人源化抗体的表征
[0220]
摇瓶培养6天后，收集含有人源化抗体的细胞上清，并根据部分修改的上述方法步骤，经捕获elisa和octet亲和试验检测其与人csf-1r的结合力/亲和力。
[0221]
在捕获elisa检测中，96孔板用0.2μg/ml山羊抗人igg(亲和纯化山羊抗人igg，特异于f(ab
′
)2片段，jackson immunoresearch，cat#109-005-097)包被，而不是山羊抗小鼠igg f(ab
′
)2片段，100μl/孔。结果示于图8a-8b。
[0222]
在octet亲和试验中，使用含有人源化抗体的细胞上清液，而嵌合抗体和卡比利珠单抗配制在hbs-ep

中，浓度5μg/ml。确定octet亲和测试的ka、kd和kd值，并总结于以下表4中。数据表明，与卡比利珠单抗相比，所有含有人源化1g8抗体的细胞上清液对人csf-1r具有相当的结合亲和力。
[0223]
表4.人源化1g8抗体的结合亲和力
[0224][0225]
人源化抗体hu1g8-v13按上述方法纯化，并按照前述实施例中的方法步骤(略加修改)以及以下描述的方法步骤，经biacore、结合捕获elisa、猴-交叉间接elisa、对照基准物阻断elisa、基于细胞的结合facs、以及细胞类功能检测进行测定。
[0226]
具体地，如下进行间接elisa，以检测抗体与猴csf-1r蛋白的交叉反应。简单地说，96孔微孔板用100μl/孔1μg/ml猴csf-1r-his蛋白(内部制备，氨基酸序列为seq id no：62，于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中)37℃包被2小时。elisa板用清洗缓冲液(pbs 0.05％tween-20，pbst)洗涤一次，然后用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的pbst)4℃封闭过夜。第二天，再次洗涤板，并与梯度稀释的本技术csf-1r抗体或对照(起始浓度66.7nm，5倍梯度稀释于含2.5％脱脂奶粉的pbst中)37℃孵育40分钟。elisa板清洗4次，与过氧化物酶亲和纯化f(ab
′
)2片段山羊抗人igg(特异于fcγ片段，1∶5000稀释于pbst缓冲液，jackson immunoresearch，cat#109-036-098，100μl/孔)37℃孵育40分钟。终洗后，板用100μl/孔tmb(innoreagent)室温孵育。3分钟后，用50μl/孔1m h2so4终止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于tmb，630nm作为参照波长。用od(450-630)值和抗体浓度做图。使用graphpad prism软件对数据进行分析，得出ec
50
值。结果示于图10。
[0227]
biacore试验中，将cm5芯片用于测试抗体，包括对照基准物，其中山羊抗人igg(ge healthcare，cat#br100839，小鼠抗体捕获试剂盒)共价连接到cm5芯片。纯化的hu1g8-v13和卡比利珠单抗，浓度为2μg/ml，以10μl/min的流速流到芯片上，且梯度稀释的重组人csf-1r-his和猴csf-1r-his蛋白的初始浓度均为320nm。数据汇总在以下表6中。
[0228]
对于基于细胞的结合facs，使用r-藻红素亲和纯化山羊抗人igg(特异于fcγ片段，jackson immunoresearch laboratories，inc.，cat#109-115-098)，而非r-藻红素亲和纯化f(ab
′
)2片段山羊抗小鼠igg(h l)，1∶1000稀释于facs缓冲液，100μl/孔。结果如图15所示。
[0229]
在配体阻断elisa中，还检测了hu1g8-v13对csf-1r-il34结合的抑制作用，在测试的一开始，用100μl于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)中的人il34-his(sino biological inc.，cat#10948-h08s)包被96孔微孔板，100ng/孔。csf-1r-csf1和csf-1r-il34阻断的结果分别示于图11和图12。
[0230]
为确定人源化抗体hu1g8-v13的热稳定性，使用glomelt
tm
热漂移蛋白稳定试剂盒(biotium，cat#33022-t)，用蛋白热漂移法测定熔融温度(tm)。简单地说，使glomelt
tm
染料
融化，达到室温。装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μl pbs加入5μl 200x染料，制备10x染料。向2μl 10x染料加入10μg人源化抗体，然后加入pbs至总反应体积20μl。简略地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时pcr热循环仪(roche，lightcycler 480ii)中，将其设置为具有表5参数的熔融曲线程序。结果如图16所示。
[0231]
表5.熔融曲线程序参数
[0232]
大概步骤温度升温速率保持时间初始保持25℃na30s熔融曲线25-99℃0.1℃/sna
[0233]
捕获elisa、对照基准物-csf-1r阻断和csf-1r磷酸化抑制的结果分别示于图9、13和14，以及以下表6。
[0234]
表6.人源化mab hu1g8-v13的结合活性
[0235][0236]
数据显示，在biacore试验、基于细胞的结合facs试验、和捕获elisa试验中，与对照基准物相比，抗体hu1g8-v13具有相当或稍低的对人csf-1r或猴csf-1r的结合亲和力/结合能力，而在间接elisa中，该抗体对猴csf-1r的结合力高于对照基准物(例如，更高的bmax)。此外，该抗体有效地阻断了csf-1r与csf-1或il34的结合，阻断力与对照基准物相当，并从而抑制csf-1r的酪氨酸磷酸化。
[0237]
数据还显示，抗体hu1g8-v13无法阻断人csf-1r-卡比利珠单抗的相互作用，表明它结合了不同的表位。至于熔融温度，t1和t2分别为66℃和77℃。
[0238]
尽管本技术已经在以上结合一个或多个实施方式进行了阐述，应当理解的是，本技术不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的参考文献均通过引用的方式全文并入。
[0239]
本技术中的序列总结如下。
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[0248]
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[0250][0251]
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[0252]
尽管已经在本技术的具体优选实施方式中进行了阐述，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于在上述描述中列出的特定细节，可以在不脱离本发明宗旨和范围的情况下做出很多明显的变形。