高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用与流程

高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用。


背景技术：

2.l-谷氨酰胺(l-glutamine,l-gln)化学名为2,5-二氨基-5-氧代戊酸，分子式为c5h
10
n2o3，相对分子量为146.15，结晶形状为白色斜方晶体或结晶性粉末状，无臭，有独特的甜味。易溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿等多种有机溶剂，熔点为185℃，等电点为5.65，具有热不稳定性，遇热或酸碱易变性。l-谷氨酰胺含有两个氨基，一个是α-氨基，一个是末端酰胺基。由于末端酰胺基易水解，使谷氨酰胺不仅是生物体内嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、核酸和其他氨基酸生物合成的必须原料之一，还是各器官间氮流动的重要载体。
3.谷氨酰胺(l-glutamine，l-gln)是l-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一种中性氨基酸，是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一，在维持人体机能和生命活动方面具有重要作用，其在人体内含量非常高，占人体游离氨基酸的61％。近年来，随着对l-谷氨酰胺的深入研究，l-谷氨酰胺被广泛应用于医药、保健食品、饲料等领域。作为一种具有潜力的新药，l-谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃疡，缓解运动疲劳，改善脑神经机能等方面。随着对l-谷氨酰胺生理作用以及应用范围的深度研究，谷氨酰胺的需求量和生产量都在不断增加，且药用需求量很大，具有广阔的市场前景。谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合成法，酶法和发酵法，其中发酵法生产谷氨酰胺是目前使用的主要方法。
4.l-谷氨酰胺生产菌大多是由l-谷氨酸生产菌经诱变或基因工程改造而来。1963年，木下祝郎等发现在谷氨酸的发酵液中发现了少量谷氨酰胺。1979年，中西透等人通过进一步研究证实，可以改变发酵条件，使谷氨酸生产菌生产谷氨酰胺。谷氨酸为谷氨酰胺的直接前提物质，在高浓度nh
4
和微酸环境下，谷氨酸经谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)催化消耗atp生成谷氨酰胺。目前用来生产谷氨酰胺的菌株主要包括：谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、嗜乙酞乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、北京棒状杆菌(c.pekinense)、黄色短杆菌((b.flavun)、乳糖发酵短杆菌(b.revibacterium lactofentum)及钝齿杆菌(c.crenatum)等。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株。
6.本发明所要解决的技术问题在于提供上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
7.本发明所要解决的技术问题在于提供上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用。
8.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
9.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-1，是通过菌株
cgmcc no.1.16145(菌株tccc 11822于2017年9月由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到并登记入册，受理保存，登记入册编号为cgmcc no.1.16145)改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶(glutamate synthase)基因ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株t-1。
10.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-2，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建出菌株t-2。
11.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-3，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，同时敲除ncgl0181和ncgl2395基因，构建出菌株t-3。
12.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-4，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-3的基础上，在基因组ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,gs)基因glna
bsu
，构建出菌株t-4。
13.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-5，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-4的基础上，在基因组ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
lcb
，构建出菌株t-5。
14.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株t-6，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pxt01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
插入pxt01质粒，构建质粒pxt01-glna
bsu
，并将pxt01-glna
bsu
电转化进入菌株t-5，构建出菌株t-6。
15.对上述谷氨酸棒杆菌菌株t-1～t-6进行发酵实验验证其谷氨酰胺发酵能力的提高。
16.上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，具体步骤如下：
17.(1)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶(glutamate synthase)基因ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株t-1；
18.(2)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建菌株t-2；
19.(3)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，同时敲除ncgl0181和ncgl2395基因，构建菌株t-3，通过发酵实验分析敲除ncgl0181和ncgl2395基因对谷氨酰胺发酵的影响；
20.(4)在菌株t-3的基础上，在基因组ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,gs)基因glna
bsu
，构建菌株t-4；在菌株t-4的基础上，在基因组ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
lcb
，构建菌株t-5。通过发酵实验分析在基因组ncgl0182位点上整合一拷贝glna
bsu
和在基因组ncgl2500位点上整合一拷贝glna
lcb
对谷氨酰胺发酵的影响；
21.(5)在菌株t-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pxt01质粒，将来自枯草芽孢杆
菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
插入pxt01质粒，构建质粒pxt01-glna
bsu
，并将pxt01-glna
bsu
电转化进入菌株t-5，构建出菌株t-6，达到多拷贝过表达glna
bsu
的目的。
22.上述步骤(5)中使用带有tuf强启动子的pxt01质粒过表达来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
。谷氨酸棒杆菌中的gs会受到腺苷酰化的影响，amp以共价方式与gs的肽链上的酪氨酸残基结合，产生gs(amp)。受到腺苷酰化的影响，gs的催化性质会发生明显变化，催化谷氨酸生成谷氨酰胺的活性会明显降低。但是枯草芽孢杆菌中的gs不受腺苷酰化影响。
23.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pk18mobsacb-δncgl0181，将构建好的质粒电转化进入菌株tccc 11822感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例1和图2)，敲除ncgl0181基因，构建出菌株t-1。
24.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pk18mobsacb-δncgl2395，将构建好的质粒电转化进入菌株tccc 11822感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例2和图2)敲除ncgl2395基因，构建出菌株t-2。
25.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pk18mobsacb-δncgl2395，将构建好的质粒电转化进入菌株t-1感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例3和图2)敲除ncgl2395基因，构建出菌株t-3。
26.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pk18mobsacb-ncgl0182::ptufglna
bsu
，并将构建好的质粒电转化进入菌株t-3感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例4)，在基因组ncgl0182位点上整合一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
构建出菌株t-4。
27.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pk18mobsacb-ncgl2500::ptufglna
lcb
，并将构建好的质粒电转化进入菌株t-4感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例5)，在基因组ncgl2500位点上整合一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
lcb
，构建出菌株t-5。
28.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建带有tuf强启动子的质粒pxt01-glna
bsu
，将构建好的质粒电转化进入菌体，过表达glna
bsu
，构建出菌株t-6，达到多拷贝过表达glna
bsu
的目的。
29.上述谷氨酸棒杆菌菌株生产l-谷氨酰胺的应用，具体发酵生产方法如下：
30.(1)将谷氨酸棒杆菌菌株t-1～t-6中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；
31.(2)三个1l一级种子摇瓶，定容种子培养基100ml，32℃，ph 7.0，220rmp/min，摇床培养10h；
32.(3)5l发酵罐二级种子培养，一级种子液全部接入5l发酵罐内进行二级种子培养，培养基定容2l，34℃，ph7.0，溶氧30-50％，培养至od
600
达到40；
33.(4)5l发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3l，34℃，溶氧30-50％。
34.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，采用的种子培养基为：
葡萄糖25g/l，玉米浆干粉15g/l，豆浓15ml/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l。
35.优选的，上述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，采用的发酵培养基为：k2hpo4·
3h2o 1.8g/l，vb
1 0.1mg/l，豆浓10ml/l，玉米浆干粉4g/l，mnso4·
h2o 10mg/l，feso
4 10mg/l，znso
4 5mg/l，mgso4·
7h2o 1g/l，(nh4)2so
4 60g/l。
36.有益效果：
37.本发明构建的谷氨酸棒杆菌t-6相比原菌株tccc 11822l-谷氨酰胺产量提高了74.9％、副产物谷氨酸降低了67.4％，gs酶活大幅度提高，糖酸转化率达到37.1％；所述构建方法通过敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)基因ncgl2395和ncgl2500，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸和nh
4
，谷氨酸作为谷氨酰胺发酵过程中的主要副产物，在提取过程中较难与谷氨酰胺分离，因此降低发酵液中谷氨酸的含量，可以大大降低谷氨酰胺提取难度，降低成本，具有广泛的工业应用前景。
38.经测定，构建的谷氨酸棒杆菌t-6可以生产l-谷氨酰胺84.3g/l，副产物谷氨酸9.9g/l。
附图说明
39.图1为谷氨酰胺代谢路径示意图；
40.图2为以敲除基因ncgl0181为例的原理示意图；
41.图3为pk18mobsacb-δncgl0181图谱；
42.图4为pk18mobsacbδncgl2395图谱；
43.图5为pk18mobsacb-ncgl0182::ptufglna
bsu
图谱；
44.图6为pk18mobsacb-ncgl2500::ptufglna
lcb
图谱；
45.图7为过表达质粒pxt01-glna
bsu
的图谱。
具体实施方式
46.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
47.实施例1
48.pk18mobsacb-δncgl0181载体构建和ncgl0181(谷氨酸合酶基因)敲除操作
49.1.pk18mobsacb-δncgl0181载体构建
50.(1)以谷氨酸棒杆菌tccc 11822基因组为模板，以ncgl0181基因上游同源臂扩增引物n0up-s和n0up-a，下游同源臂扩增引物n0down-s和n0down-a作为扩增引物(其中n0up-s和n0down-a的5’端分别加入限制性内切酶xbaⅰ和hindⅲ的线性载体同源序列，n0up-a和n0down-s有25bp的重叠区域)。扩增出上下同源臂片段进行回收。
51.(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以n0up-s和n0down-a作为引物，进行重叠pcr，获得ncgl0181中间部分缺失的重叠片段δncgl0181。
52.(3)用xbaⅰ和hindⅲ将pk18mobsacb质粒双酶切，与重叠片段δncgl0181进行重组，化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。bhi培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图3所示)
53.2.谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
54.(1)将构建好的质粒pk18mobsacbδncgl0181电击转化到tccc 11822感受态细胞中，涂布于0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段，长度为重组片段δncgl0181的长度加pk18mobsacb鉴定引物m13-47(pk18mobsacb上的一段基因序列，用于鉴定同源重组是否发生)的长度为1300，为发生单交换的单菌落。
55.(2)将发生单交换的单菌落接入bhi摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μl发酵液涂布于含有15％蔗糖的bhi平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的bhi平板和0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的bhi平板生长且在0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为1600(重组片段δncgl0181的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落t-1。(ncgl0181谷氨酸合酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
56.实施例2
57.pk18mobsacb-δncgl2395载体构建和ncgl2395(谷氨酰胺酶基因)敲除操作
58.pk18mobsacb-δncgl02395载体构建和谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
59.3.pk18mobsacb-δncgl2395载体构建
60.(1)以谷氨酸棒杆菌tccc 11822基因组为模板，以ncgl2395基因上游同源臂扩增引物n2up-s和n2up-a，下游同源臂扩增引物n2down-s和n2down-a作为扩增引物(其中n2up-s和n2down-a的5’端分别加入限制性内切酶xbaⅰ和hindⅲ的线性载体同源序列，n2up-a和n2down-s有25bp的重叠区域)。扩增出上下同源臂片段进行回收。
61.(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以n2up-s和n2down-a作为引物，进行重叠pcr，获得ncgl2395中间部分缺失的重叠片段δncgl2395。
62.(3)用xbaⅰ和hindⅲ将pk18mobsacb质粒双酶切，与重叠片段δncgl2395进行重组，化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。bhi培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图4所示)
63.4.谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
64.(1)将构建好的质粒pk18mobsacbδncgl2395电击转化到tccc 11822感受态细胞中，涂布于0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段，长度为重组片段δncgl2395的长度加pk18mobsacb鉴定引物m13-47(pk18mobsacb上的一段基因序列，用于鉴定同源重组是否发生，序列见表1)的长度为850，为发生单交换的单菌落。
65.(2)将发生单交换的单菌落接入bhi摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μl发酵液涂布于含有15％蔗糖的bhi平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的bhi平板和0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的bhi平板生长且在0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为1000(重组片段δncgl2395的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落t-2。(ncgl2395谷氨酰胺酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
66.实施例3
67.使用实施例1中构建得到的菌株t-1，进行实施例2的操作得到菌株t-3。
68.实施例4
69.在基因组ncgl0182(谷氨酸合酶基因)位点整合一拷贝glna
bsu
的菌株构建
70.(1)pk18mobsacb-ncgl0182::ptufglna
bsu
载体构建
71.以谷氨酸棒杆菌tccc 11822基因组为模板，以ncgl0182基因上游同源臂扩增引物n0182up-s和n0182up-a，下游同源臂扩增引物n0182down-s和n0182down-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂片段进行回收。以质粒pxt01-glna
bsu
(构建方法见实施例5，序列见表4)为模板，以n0182tuf-s和n0182glna-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子的glna
bsu
基因片段并回收。
72.用扩增出的上下游同源臂和带有tuf启动子的glna
bsu
基因片段(tuf启动子序列见表4)作为模板，以n0182up-s和n0182down-s作为引物，进行重叠pcr，获得重叠片段ncgl0182::ptufglna
bsu
。
73.用xbaⅰ和hindⅲ将pk18mobsacb质粒双酶切，与重叠片段ncgl0182::ptufglna
bsu
进行重组，化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。bhi培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图5所示)
74.(2)在ncgl0182位点整合一拷贝glna
bsu
菌株构建
75.将构建好的质粒pk18mobsacb-ncgl0182::ptufglna
bsu
电击转化到t-3的感受态细胞中，涂布于0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段，长度为重组片段ncgl0182::ptufglna
bsu
长度加pk18mobsacb鉴定引物m13-47长度为2500，为发生单交换的单菌落。
76.将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μl发酵液涂布于含有15％蔗糖的bhi平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的bhi平板和0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的bhi平板生长且在0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为2650(重组片段ncgl0182::ptufglna
bsu
的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落t-4。(ncgl0182谷氨酸合酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
77.实施例5
78.在基因组ncgl2500(谷氨酰胺酶基因)位点整合一拷贝glna
lcb
的菌株构建
79.(1)pk18mobsacb-ncgl2500::ptufglna
lcb
载体构建
80.以谷氨酸棒杆菌tccc 11822基因组为模板，以ncgl2500基因上游同源臂扩增引物n2500up-s和n2500up-a，下游同源臂扩增引物n2500down-s和n2500down-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂片段进行回收。以质粒pxt01-glna
lcb
(构建方法见实施例五，序列见表4)为模板，以n2500tuf-s和n2500glna-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子的glna
lcb
基因片段并回收。
81.用扩增出的上下游同源臂和带有tuf启动子的glna
lcb
基因片段(tuf启动子序列见表4)作为模板，以n2500up-s和n2500down-s作为引物，进行重叠pcr，获得重叠片段ncgl2500::ptufglna
lcb
。
82.用xbaⅰ和hindⅲ将pk18mobsacb质粒双酶切，与重叠片段ncgl2500::ptufglna
lcb
进行重组，化转至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。bhi培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图
6所示)
83.(2)在ncgl2500位点整合一拷贝glna
lcb
菌株构建
84.将构建好的质粒pk18mobsacb-ncgl2500::ptufglna
lcb
电击转化到t-4的感受态细胞中，涂布于0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段，长度为重组片段ncgl2500::ptufglna
lcb
长度加pk18mobsacb鉴定引物m13-47长度为2460，为发生单交换的单菌落。
85.将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μl发酵液涂布于含有15％蔗糖的bhi平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的bhi平板和0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的bhi平板生长且在0.01mg/ml浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落pcr，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为2600(重组片段ncgl2500::ptufglna
lcb
的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即整合成功的单菌落。(ncgl2500谷氨酰胺酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
86.实施例6
87.glna
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(来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因)过表达菌株的构建
88.(1)pxt01-glna
bsu
重组质粒构建
89.以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis subsp.subtilis 168，购自天津科技大学代谢工程实验室)基因组为模板，以枯草芽孢杆菌中的谷氨酰胺合成酶基因的上游引物bsu-glna-s和下游引物bsu-glna-a为扩增引物(上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性内切酶bamh1和ecor1的线性载体同源序列)，pcr扩增出长度为1335的glna
bsu
基因片段。
90.将pxt01质粒进行bamh1和ecor1双酶切，与glna
bsu
基因片段进行重组，化转至大肠杆菌dh5α感受态中，涂布于0.0005mg/ml浓度的氯霉素抗性平板，进行pcr菌落验证，筛选出携带质粒的单菌落。32℃摇管培养12h，并提出质粒。(质粒图谱如图7所示)
91.(2)glna
bsu
过表达菌株构建
92.将pxt01-glna
bsu
质粒电击转化到t-5的感受态细胞中，涂布于0.0005mg/ml浓度的氯霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检验pcr片段长度是1335为成功导入质粒的单菌落，得到菌株t-6。
93.本发明构建的高产谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌的基因型为tccc 11822δncgl0181δncgl2395 ncgl0182::ptuf-glna
bsu
ncgl2500::ptuf-glna
lcb
/pxt01-glna
bsu
，将其命名为t-6(对应实施例6)。
94.该高产菌株经5l发酵罐发酵实验验证(具体实验步骤见发明内容中的具体发酵生产方法)，谷氨酰胺产量可达到84.3g/l，比原菌tccc 11822提高了74.9％，糖酸转化率从32.5％提高到37.1％，副产物谷氨酸的含量9.9g/l，比原菌tccc 11822降低了67.4％。此菌株具有良好的生产能力和较高的转化率，为l-谷氨酰胺的产业化生产奠定了基础。
95.上述实施例中构建菌株所用引物序列见表1。
96.上述实施例中所述菌株和质粒见表2。
97.上述实施例中各所述菌株发酵生产谷氨酰胺结果见表3。
98.表1构建菌株所用引物序列
99.[0100][0101]
表2菌株和质粒
[0102]
[0103][0104]
表3各菌株发酵生产谷氨酰胺结果
[0105]
[0106][0107]
上述实施例中基因改造涉及的基因表4如下：
[0108]
表4本发明涉及的基因序列
[0109][0110]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，均在保护范围内。本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。