一种制备靶点特异性NK细胞的方法及其应用与流程

一种制备靶点特异性nk细胞的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于医学生物工程技术领域，涉及一种car-nk细胞的制备方法及其应用，尤其涉及一种活性增强型nk细胞的制备方法、活性增强型nk细胞用于car-nk制备方法及其制备得到的靶点特异性car-nk细胞。


背景技术：

2.自然杀伤(nk)细胞是机体重要的免疫细胞，在外周血单个核细胞组成中占10％左右，是人体抗肿瘤、抗病原体感染的第一道防线。无需预先致敏或免疫接种，nk细胞便可以对肿瘤细胞表现出强烈的细胞毒活性，并产生许多细胞因子，激活适应性免疫系统。肿瘤经常以丢失肿瘤相关抗原和/或mhc分子作为逃逸t细胞免疫监控的手段。nk细胞可以以非mhc限制的方式裂解肿瘤细胞，而且无需肿瘤细胞表达相关抗原，因此，nk细胞被认为是过继性癌症免疫治疗的理想选择。在临床上，nk细胞的免疫治疗已被推荐用于治疗改善血液恶性肿瘤和实体瘤。miller等人率先开展了nk细胞治疗癌症的临床研究，并取得了不错的疗效。nk细胞还在机体抗病毒免疫反应中也发挥着至关重要的作用，它既能直接杀伤病毒感染细胞，又具有强大的免疫调节功能，在新冠肺炎治疗中具有较大潜力。不仅如此，nk细胞可以还直接清除衰老细胞，同时活化吞噬细胞，增加它对衰老细胞的清理能力，从而达到延缓衰老、保持年轻态的目的。
3.目前，用于nk过继性细胞免疫疗法需要很高的细胞剂量和多次回输，而nk细胞免疫治疗的一个阻碍是难以生产大量功能完全的nk细胞，同时缺少体外扩增nk细胞的标准方法。与采用okt3抗体便可激活并扩增t细胞相比，nk细胞对于类似刺激的反应较为温和、无法持续增殖。因此，为了克服这个障碍，研究人员正在开发一些新的方法来获得更多、更纯的nk细胞。
4.目前常用的nk细胞的制备方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法。血液细胞分离法是获得患者体内大量的淋巴细胞，去除b细胞和t细胞后，分选cd56阳性细胞，用特定细胞因子激活nk细胞，再将其回输患者体内；该方法的缺陷是需要大量患者的淋巴细胞进行分选，成本高，数量无法满足临床上对于多次回输的需求。细胞因子或化学药品刺激法是将患者体内获得的大量的淋巴细胞与细胞因子共培养4～10周，获得nk细胞，细胞因子在调节nk细胞的活性方面具有重要作用，il-2、il-12、il-15、il-18、il-21和ifn-γ被列为可以激活nk细胞增殖和增强细胞毒能力的细胞因子，其中，il-2可以诱导nk细胞增殖并且增强其对大范围肿瘤细胞的杀伤能力；但是这种方法存在nk细胞扩增倍数低、培养周期长、nk细胞纯度较低、所需的细胞因子剂量较高等缺陷。饲养细胞是目前最有前景的体外扩增nk细胞的方法之一，该方法快速且稳定，可以在10～14天内培养出临床级别数量的nk细胞，纯度高、杀瘤活性强。据文献报道，外周血单个核细胞、脐带血中间质干细胞以及淋巴细胞来源的癌细胞系均可以作为饲养细胞；在癌细胞系中，人髓系白血病k562细胞、伯基特淋巴瘤daudi细胞以及经ebv病毒转化的淋巴母细胞系(ebv-lcl)均可以作为饲养细胞。然而，以饲养细胞为基础的nk细胞的扩增技术也存在一定缺陷。为使nk细胞
达到临床级别数量，通常需要nk细胞与饲养细胞进行一到两次的共培养。由于在短时间内nk细胞进行了大量的增殖，在第二次与饲养细胞共培养之后，nk细胞表现出一定程度的耗竭，具体表现为细胞体积缩小、第二次共培养细胞扩增幅度减小、部分细胞出现凋亡现象。如果在此类nk细胞的基础上通过进行嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的加工和改造，转染效率、细胞存活率和存活时间均会显著降低。所以，对现有的以饲养细胞为基础的nk细胞体外扩增技术进行进一步改良，以获得更加健康、功能更加完善的nk细胞变得尤为迫切。
5.nk细胞的细胞毒作用受细胞表面两类受体的平衡调控。一类受体为激活型受体，例如nkg2d；另一类受体为抑制型受体，例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptor，kir)。在肿瘤发生的早期，一些肿瘤细胞上的mhc i类分子表达下调，kir抑制信号被阻断，nk细胞被激活，从而发挥肿瘤免疫监视作用，迅速识别和杀伤恶性转化的肿瘤细胞。但是在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞会通过改变细胞表面配体或受体的机制发生进化，抑制nk细胞的激活和功能，削弱nk细胞介导的抗肿瘤作用。因此对nk细胞进行基因工程改造，使其能够重新靶向肿瘤细胞并增强nk细胞的杀瘤活性是解决该问题的主要手段之一。
6.car是经人工改造的受体，可将任意的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上。car修饰的免疫细胞是现阶段最有效的肿瘤细胞免疫治疗产品。car免疫细胞疗法通常利用患者自身的cd8 αβt细胞制造出大量的car-t细胞，然后再将改造后的t细胞注入患者体内。car基因也可以修饰其他免疫细胞，如cik细胞、nk细胞和γδt细胞。由于car-nk细胞的毒性相对较小，在异体nk细胞的免疫治疗应用上，不会产生免疫排斥作用，因此是一种比t细胞更安全的免疫治疗候选细胞。理论上，car的设计可以避开nk细胞内的抑制性信号通路，同时nk细胞自身可以表达激活型受体，还能利用抗体介导的细胞毒作用(adcc)，因此，表达car的nk细胞在肿瘤治疗以及新冠肺炎治疗等领域上更优于t细胞，有着更为广阔的应用前景。然而，对nk细胞进行基因工程改造要比改造t细胞更加困难，研究人员通常采用慢病毒转染或者mrna电穿孔的方式对nk细胞进行基因改造，但是常规方法成本较高、效率较低、存活率低。因此，有必要对改造nk细胞的基因工程方法进行优化。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的是提供一种应用mrna电穿孔的方式制备嵌合抗原受体修饰的nk细胞(car-nk)的方法。
8.为了制备能耐受电转的nk细胞，本发明首先提供了一种活性增强型nk细胞的制备方法，用于克服目前nk细胞体外培养的一些技术瓶颈，例如nk细胞的体外扩增倍数低、培养周期长、纯度低，nk细胞因大量增殖而呈现的耗竭、寿命短状态，细胞损失大，以及基因工程改造中转染效率低、存活率低。
9.在本发明提供的活性增强型nk细胞的制备方法中，饲养细胞与特定细胞因子的结合是必须的，而且本发明还发现并提出细胞因子的添加时间和添加顺序对于nk细胞的扩增效率、纯度和扩增后的细胞状态非常重要。本发明通过理论和实验研究，优化了特定细胞因子的选择、添加时间点和添加顺序等，显著提升了大规模体外培养过程中nk细胞的扩增能力、纯度和扩增后细胞状态，进而提高了car转染效率、ifnγ分泌能力和肿瘤杀伤能力，降
低了异体nk细胞的制备成本，在car杀伤肿瘤细胞领域具有广阔的应用前景。
10.第一方面，本发明提供了一种活性增强型nk细胞的制备方法，所述方法包括：
11.(1)将分离的单个核细胞与第一饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；
12.(2)将所述经第一次共培养的细胞群体与第二饲养细胞、细胞因子组合物进行第二次共培养，得到活性增强型nk细胞；
13.所述细胞因子组合物包括il-12、il-15和il-18；
14.所述细胞因子组合物在第二次共培养起始时添加。
15.本发明对比了单独采用饲养细胞法、单独采用细胞因子(il-2、il-12、il-15和il-18)刺激法、或在其他时间点添加细胞因子培养nk细胞的效果，这些因素对nk细胞的培养扩增均会产生显著影响；本发明采用饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合的方式，并限定添加的细胞因子类型为il-12、il-15和il-18，添加时间点为第二次共培养起始时，nk细胞的扩增效果最佳。
16.本发明中，所述单个核细胞分离自外周血和/或脐带血。
17.本发明中，所述第一饲养细胞和所述第二饲养细胞可以相同或不同，并且可以各自独立地选自人髓系白血病k562细胞、伯基特淋巴瘤daudi细胞或ebv转化的b淋巴母细胞样细胞(ebv-lcl细胞)。
18.优选地，所述饲养细胞可以是经过γ射线处理的，γ射线处理采用本领域的常规方式进行，例如采用100gy的γ射线对细胞进行辐射。
19.优选地，所述饲养细胞可以是未经基因工程改造或经基因工程改造的，也可以是市售的经过基因工程改造的；例如，k562细胞可以经过基因工程改造而在细胞表面表达4-1bbl和与膜结合的白介素(例如il-15和/或il-21)。
20.本发明进一步优化了制备方法中各步骤的条件，在步骤(1)中，所述单个核细胞与所述第一饲养细胞的细胞数比例为1:(0.5～10)，例如可以是1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:(0.5～5)。
21.优选地，步骤(1)所述第一次共培养的时间为6～14天，例如可以是6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，优选为8～10天。
22.本发明中，第一次共培养和第二次共培养通常采用液体培养基进行，所述液体培养基可以是本领域常用的细胞培养基，例如可以是aim v
tm
(gibco)、x-vivo
tm 15(lonza)、scgm
tm
(cellgenix)、rpmi、nk macs
tm
(miltenyi)、optmizer
tm
(gibco)或stemspan
tm
(stemcell)。
23.优选地，步骤(1)所述第一次共培养的过程中添加细胞因子il-2，优选为在所述第一次共培养起始时添加il-2，之后每隔24～48h添加il-2，以第一次共培养的液体总体积计，每次添加细胞因子il-2的浓度为10～1000iu/ml，例如可以是10iu/ml、100iu/ml、200iu/ml、300iu/ml、400iu/ml、500iu/ml、600iu/ml、700iu/ml、800iu/ml、900iu/ml或1000iu/ml，优选为10～300iu/ml。
24.优选地，步骤(2)所述经第一次共培养的细胞群体与所述第二饲养细胞的细胞数比例为1:(0.5～10)，例如可以是1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:(0.5～5)。
25.优选地，以第二次共培养的液体总体积计，细胞因子il-12的浓度为1～100ng/ml，例如可以是1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml，优选为5～50ng/ml，进一步优选为5～15ng/ml。
26.优选地，以第二次共培养的液体总体积计，细胞因子il-15的浓度为1～100ng/ml，例如可以是1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml，优选为20～80ng/ml，进一步优选为40～60ng/ml。
27.优选地，以第二次共培养的液体总体积计，细胞因子il-18的浓度为1～100ng/ml，例如可以是1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml或100ng/ml，优选为20～80ng/ml，进一步优选为40～60ng/ml。
28.优选地，在步骤(2)中，在第二次共培养起始后的第12～72小时(优选第12～24小时)，去除细胞因子il-12、il-15和il-18，从而避免nk细胞被细胞因子持续刺激、过度激活，而造成的nk细胞功能衰减或细胞凋亡。
29.优选地，步骤(2)所述第二次共培养的时间为3～14天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，优选为5～7天。
30.优选地，步骤(2)所述第二次共培养的过程中添加细胞因子il-2，优选为在第二次共培养起始后的第12～72小时添加il-2，之后每隔24～48小时添加il-2，进一步优选为在去除il-12、il-15和il-18后立即添加il-2，之后每隔24～48小时添加il-2，以第二次共培养的液体总体积计，每次添加细胞因子il-2的浓度为10～1000iu/ml，例如可以是10iu/ml、100iu/ml、200iu/ml、300iu/ml、400iu/ml、500iu/ml、600iu/ml、700iu/ml、800iu/ml、900iu/ml或1000iu/ml，优选为10～300iu/ml。
31.作为优选技术方案，本发明提供了一种活性增强型nk细胞的制备方法，所述方法包括：
32.(1)将分离的外周血和/或脐带血单个核细胞与经γ射线处理的饲养细胞进行第一次共培养9～10天，在第一次共培养起始时加入il-2，并且在培养过程中，每隔1～2天按全液体积补充il-2；
33.(2)将经第一次共培养的细胞群体与经γ射线处理的饲养细胞进行第二次共培养，第二次共培养起始时添加il-15、il-18和il-12，对nk细胞进行12～24小时刺激，随后去除含有细胞因子il-12、il-15和il-18的细胞培养液，更换新的细胞培养液并加入il-2，之后每隔1～2天按全液体积补充il-2，继续培养5～6天获得活性增强型nk细胞；
34.其中，所述细胞培养液添加有≥1％(v/v)的人血清或血浆或≥5％(v/v)的胎牛血清。
35.更重要的，本发明的提供了一种嵌合抗原受体修饰的靶点特异性nk细胞的制备方法，所述方法包括：
36.采用嵌合抗原受体修饰第一方面所述的方法制备得到的活性增强型nk细胞，得到嵌合抗原受体修饰的靶点特异性nk细胞。
37.由于本发明第一方面所述的制备方法能够使制备的nk细胞保持良好的状态，且具有电转效率高的特点，由此可实现高效的外源基因表达，降低了对nk细胞进行基因工程改造的难度，增强了体外扩增的nk细胞作为car效应细胞的潜力；此外，采用本发明第一方面所述的制备方法制备得到的nk细胞具有强烈的肿瘤杀伤能力和ifnγ分泌能力，采用编码
car(例如靶向nkg2d配体)的mrna转染后，其肿瘤杀伤能力和ifnγ分泌能力进一步增强。
38.优选地，采用嵌合抗原受体修饰靶点特异性nk细胞的步骤包括：
39.1)设计编码嵌合抗原受体的dna，所述dna的编码链的5’端具有poly t结构；
40.2)将步骤1)所述的dna转录为mrna；
41.3)将步骤2)所述mrna电转入活性增强型nk细胞中。
42.优选地，步骤1)所述poly t结构具有60～170个t碱基。
43.优选地，步骤1)所述dna采用交错式热不对称pcr(thermal asymmetric interlaced pcr，tail-pcr)获得，所述dna作为体外转录合成mrna的模板，优选为作为体外转录合成mrna的线性模板。
44.优选地，步骤1)所述dna采用酚氯仿抽提进行纯化，以去除rna酶(rnase)。
45.优选地，步骤2)所述转录采用mmessage mmachine t7转录试剂盒(thermo fisher)进行体外转录合成和纯化mrna，或采用其他方法制备抗-反向帽类似物(anti-reverse cap analog，arca)修饰的mrna。
46.优选地，步骤3)所述电转的缓冲液为opti-mem
tm
，优选为不含酚红的opti-mem
tm
。
47.优选地，电转时，将0.1
×
107～5
×
107个活性增强型nk细胞与100～200μl缓冲液混合进行电转。
48.优选地，在步骤3)所述电转之前还包括将缓冲液进行预冷的步骤。
49.优选地，所述电转的参数为：对于2mm电击杯，电压为200～300v，时间为1～4ms。
50.优选地，所述培养基中添加有10-300iu/ml il-2。
51.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
52.(1)本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，按照特定的时间点和顺序添加特定的细胞因子组合物，显著提高了nk细胞的体外扩增能力、扩增的nk细胞纯度(例如纯度达到80％以上)、扩增后细胞的状态，进而提高了car转染效率、ifnγ分泌能力和肿瘤杀伤能力，降低了异体nk细胞的制备成本，使nk细胞在car杀伤肿瘤细胞领域具有广阔的应用前景；
53.(2)采用本发明的方法制备的nk细胞具有电转染效率高的特性，增强了nk细胞对外源基因表达能力，降低了对nk细胞进行基因工程改造的难度，增强了体外扩增的nk细胞作为car效应细胞的潜力；
54.(3)采用本发明的方法制备的nk细胞具有优良的肿瘤杀伤能力和ifnγ分泌能力，这从功能上增强了它们作为car效应细胞的潜力；
55.(4)采用本发明的方法制备的nk细胞进行电转染编码car的mrna后，肿瘤杀伤能力和ifnγ分泌能力进一步显著增强，这不仅仅是活性增强型nk细胞和嵌合抗原受体的简单叠加，由于本发明的方法制备的nk细胞具有更高的电转染效率，因此可以进一步促进car的表达，从而进一步增强nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；
56.(5)本发明进一步优化了使用rna car技术制备car-nk细胞的条件，在构建编码car的mrna方面，优化了3’utr和5’utr结构，应用tail-pcr大剂量合成带有polyt的dna模板进行体外rna合成，减少了dna模板的不稳定性；
57.(6)本发明高效地通过基因电穿孔法最高可修饰90％的nk细胞，制备的nk细胞存活率最高达100％。
附图说明
58.图1为本发明的试验例1中，单纯饲养细胞方法与制备例1的方法制备的nk细胞的数目倍数变化，每个点代表一个捐献者样本，横坐标表示不同组别，纵坐标表示细胞总数的扩增倍数；
59.图2为本发明的试验例1中，单纯饲养细胞方法与制备例1的方法制备的nk细胞的纯度变化，每个点代表一个捐献者样本，横坐标表示不同组别，纵坐标表示nk细胞(cd3-cd56

)的纯度百分比；
60.图3a为在第一次共培养起始时不同处理组对nk细胞扩增的影响，图3b在第一次共培养起始时不同处理组对nk细胞纯度的影响，图3c在第二次共培养起始时不同处理组对nk细胞扩增的影响，图3d在第二次共培养起始时不同处理组对nk细胞纯度的影响；
61.图4为在本发明的试验例3中，不同长度和不同添加方式的polya对电转后转基因表达的影响，图中自左侧数第一个峰表示未电转mrna的enk细胞的gfp表达强度曲线(enk)，第二个峰表示采用试剂盒加a的mrna电转enk细胞的gfp表达强度曲线(enk-mgfp car kit)，第三个峰表示采用模板本身带有170t的mrna电转enk细胞的gfp表达强度曲线(nk-mgfp car-170a)，第四个峰表示采用模板本身带有150t的mrna电转enk细胞的gfp表达强度曲线(nk-mgfp car-150a)，图中横坐标表示gfp荧光强度，纵坐标表示相对细胞数；
62.图5为在本发明的试验例3中，电转缓冲液opti-mem和cytoportration对电转效率的影响，图中自左侧数第一个峰表示未电转mrna的enk细胞的gfp表达强度曲线(enk)，第二个峰表示采用cytoportration作为电转缓冲液电转mrna后的enk细胞的gfp表达强度曲线(enk-mgfp car cytoportration)，第三个峰表示采用opti-mem作为电转缓冲液电转mrna后的enk细胞的gfp表达强度曲线(enk-mgfp car opti-mem)，图中横坐标表示gfp荧光强度，纵坐标表示相对细胞数；
63.图6为在本发明的实施例1中，采用编码mgfp car的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，cnkmgfp-car和enk mgfp-car表达gfp的百分比，每个点代表一个捐献者样本，横坐标表示不同组别，纵坐标表示gfp表达的百分比；
64.图7为在本发明的实施例1中，采用编码mgfp car的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，cnk mgfp-car和enk mgfp-car表达gfp的强度，每个点代表一个捐献者样本，横坐标表示不同组别，纵坐标表示gfp的平均荧光强度；
65.图8为在本发明的实施例2中，采用编码nkg2d car 2的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，cnk nkg2d car 2和enk nkg2d car 2表达nkg2d的强度，每个点代表一个捐献者样本，横坐标表示不同组别，纵坐标表示表示被抗体染色的nkg2d的平均荧光强度；
66.图9a为在本发明的实施例3中，采用编码mgfp car的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，获得的cnk mgfp car和enk mgfp car对人卵巢癌细胞系skov3的杀伤能力，图9b为cnk mgfp car和enk mgfp car对人头颈癌细胞系fadu的杀伤能力，图9c为cnk mgfp car和enk mgfp car对人髓系白血病细胞系kg1的杀伤能力，图9d为在本发明的实施例3中，采用编码nkg2d car2的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，获得的cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人卵巢癌细胞系skov3的杀伤能力，图9e为cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人
头颈癌细胞系fadu的杀伤能力，图9f为cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人髓系白血病细胞系kg1的杀伤能力，图中横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例，纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例；
67.图10a为在本发明的实施例3中，采用编码mgfp car的mrna和编码nkg2d car2的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，获得的cnk mgfp car、enk mgfp car、cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人卵巢癌细胞系skov3的杀伤能力，图10b为cnk mgfp car、enk mgfp car、cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人头颈癌细胞系fadu的杀伤能力，图10c为cnk mgfp car、enk mgfp car、cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2对人髓系白血病细胞系kg1的杀伤能力，图中横坐标表示不同组别，纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例；
68.图11a为在本发明的实施例4中，采用编码mgfp car的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，或采用编码nkg2d car2的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，获得的cnk mgfp car、enk mgfp car、cnk nkg2d car2、enk nkg2d car2针对人卵巢癌细胞系skov3分泌ifnγ的elispot点的照片，图11b为分泌ifnγ的细胞数目的统计柱状图，横坐标表示不同组别，纵坐标表示1
×
104个nk细胞中可以分泌ifnγ的细胞数目；
69.图12a为在本发明的实施例4中，采用编码mgfp car的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，或采用编码nkg2d car2的mrna分别电转单纯饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞后，获得的cnk mgfp car、enk mgfp car、cnk nkg2d car2、enk nkg2d car2针对人头颈癌细胞系fadu分泌ifnγ的elispot点的照片，图12b为分泌ifnγ的细胞数目的统计柱状图，横坐标表示不同组别，纵坐标表示1
×
104个nk细胞中可以分泌ifnγ的细胞数目；
70.图13a为mgfp car2和apdl1 car的结构设计，图13b为在本发明的实施例5中，cnk apdl1 car和enk apdl1 car的apdl1 car的表达情况，其中左上图为cnk mgfp car2的apdl1 car的表达，右上图为cnk apdl1car的apdl1 car的表达，左下图为enk mgfp car2的apdl1 car的表达，右下图为enk apdl1 car的apdl1 car的表达，图中的峰表示apdl1 car的荧光强度曲线，横坐标表示gfp的荧光强度，纵坐标表示相对细胞数，图13c为四种被修饰的nk细胞针对人头颈癌细胞系fadu的肿瘤杀伤能力的柱状统计图，横坐标表示不同组别，纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例，e:t效靶比为20:1；
71.图14a为mgfp car和abcma car的结构设计，图14b为在本发明的实施例6中，enk mgfp car的mgfp car的表达情况，和enk abcma car的abcma car的表达情况，其中左图为mgfp car的表达，左边的峰代表enk abcma car的gfp的荧光表达曲线，右边的峰代表enk mgfp car的gfp的荧光表达曲线，右图为apdl1 car的表达，左边的峰代表enk mgfp car的apdl1 car的荧光表达曲线，右边的峰代表enk abcma car的apdl1 car的荧光表达曲线，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示相对细胞数，图14c为2种被修饰的nk细胞针对人急性髓系白血病系ksm11的肿瘤杀伤能力，横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例，纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例。
具体实施方式
72.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
73.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
74.除非特别说明，否则细胞培养在37℃、5％co2、潮化(相对湿度为95％)的条件下。
75.实施例中采用的实验材料如下：
76.pbmc提取自健康捐献者的外周血；
77.野生型k562细胞购自atcc；
78.制备例1中采用的k562-nk1细胞为经γ射线处理(用100gy的γ射线对细胞辐射半小时)的基因工程改造的编码膜固定的人il-15(mbil15)和膜固定的人il-21(mbil21)的k562细胞，膜固定的人il-15由gm-csf信号肽(uniprotkb p15509第1-22位氨基酸)、人il-15(uniprotkb p40933第30-162位氨基酸)和人cd8的铰链跨膜区(uniprotkb p01732第128-213位氨基酸)融合在一起。膜固定的人il-21是由gm-csf信号肽(uniprotkb p15509第1-22位氨基酸)、人il-21(uniprotkb q9hbe4第25-162位氨基酸)、人ighg4的铰链恒定区(uniprotkb p01861第99-327位氨基酸)、人cd4的跨膜区(uniprotkb p01730第397-418位氨基酸)融合在一起，所述k562-nk1的构建采用常规方法进行；
79.人重组il-2(hril2)购自北京双鹭公司，人重组il-12(hril12)、人重组il-15(hril15)、人重组il-18(hril18)购自近岸蛋白公司；
80.nk细胞培养液：aim培养基(life technologies公司) 1％人类ab血清(gemini公司)；
81.人卵巢癌细胞系skov3、人头颈癌细胞系fadu、人急性白血病细胞系kg1、人急性髓系白血病细胞系ksm11购自atcc；
82.流式细胞仪购自bd公司，型号为c6 sampler；
83.apc-结合的抗人nkg2d抗体、apc-结合的抗人cd3抗体、apc-结合的抗人cd56抗体购自bd公司；
84.biotin-sp-affinipure f(ab')2fragment goat anti-mouse igg，f(ab')2fragment购自jackson公司(以下简称biotin-anti-fab)；
85.apc-streptavidin购自bd公司；
86.mgfp car为：mgfp-cd8-cd3ζ，抗原结合结构域来自gfp(genbank编号yp_002302326.1)、铰链跨膜区来自cd8α(genbank编号np_001139345.1)的第128～210位氨基酸，胞内结构域来自cd3ζ(genbank编号np_932170.1)的第52～164位氨基酸；
87.mgfp car2为(如图13a)：mgfp-cd8-cd28-cd3ζ，将mgfp car的胞内结构域由cd3ζ(genbank编号np_932170.1)的第52～164位氨基酸替换为cd28(genbank编号np_006130)的第180～220位氨基酸和cd3ζ(genbank编号np_932170)的第52～164位氨基酸；
88.nkg2d car2为：nkg2d-cd28-4-1bb-cd3ζ，抗原结合结构域来自nkg2d(uniprotkb
–
p26718)的第83～216位氨基酸、铰链区来自igg4(uniprotkb
–
p01861)的第99～110位氨基
酸、跨膜区来自cd28(uniprotkb
–
p10747)的第153～179位氨基酸，胞内结构域来自4-1bb(uniprotkb-q07011)的第209-255位氨基己酸和cd3ζ(uniprotkb-p20963)的第52～164位氨基酸；
89.apdl1 car为(如图13a)：anti-pdl1 scfv-cd8-cd28-cd3ζ，抗原结合结构域来自anti-pdl1 antibody 3g10的scfv、间隔跨膜区来自cd8α(genbank编号np_001139345.1)的第128～210位氨基酸，胞内结构域来自cd28(genbank编号np_006130)的第180～220位氨基酸和cd3ζ(genbank编号np_932170.1)的第52～164位氨基酸；
90.abcma car为(如图14a)：anti-bcma scfv-cd8-dap12，抗原结合结构域来自anti-bcma antibody c11d5.3的scfv、间隔跨膜区来自cd8α(genbank编号np_001139345.1)的第128～210位氨基酸，胞内结构域来自dap12(genbank编号np_003323.1)的第62～113位氨基酸。
91.制备例1
92.将2
×
106个pbmc细胞和2
×
106个k562饲养细胞均匀混合于10ml nk细胞培养液中，接种于t75细胞培养瓶(nunc公司)内，按液体总体积计，加入50iu/ml hril2，置于37℃潮化细胞培养箱(thermo公司)中，每隔一天补充hril2(按液体总体积计补充浓度为50iu/ml)，共培养10天，收集细胞计数；
93.计数完毕后，取出收集细胞中的2
×
106个细胞与另外的2
×
106个k562饲养细胞混合于10ml新鲜的nk细胞培养液中，按液体总体积计，添加10ng/ml hril-12、50ng/ml hril-15和50ng/ml hril-18，接种于t75细胞培养瓶内，置于37℃潮化细胞培养箱中培养过夜；
94.从第二次共培养开始的12～24小时后，将细胞悬液于300
×
g离心10min，弃上清，用10ml新鲜的nk细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加50iu/mlhril-2，之后每隔一天添加50iu/ml hril-2，继续培养6天；
95.第17天(从第一次共培养的第1天开始计算)收集细胞进行细胞计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(抗cd3和抗cd56抗体)。
96.由上述方法制备的nk细胞的纯度达90％，总细胞数扩增倍数达2000倍。
97.制备例2
98.将2
×
106个pbmc细胞和10
×
106个k562饲养细胞均匀混合于20ml nk细胞培养液中，接种于t75细胞培养瓶(nunc公司)内，按液体总体积计，加入10iu/ml hril2，置于37℃潮化细胞培养箱(thermo公司)中，每隔一天补充hril2(按液体总体积计补充浓度为10iu/ml)，共培养14天，收集细胞计数；
99.计数完毕后，取出收集细胞中的2
×
106个细胞与另外的10
×
106个k562饲养细胞混合于20ml新鲜的nk细胞培养液中，按液体总体积计，添加5ng/ml hril-12、10ng/ml hril-15和10ng/ml hril-18，接种于t75细胞培养瓶内，置于37℃潮化细胞培养箱中培养过夜；
100.从第二次共培养开始的72小时后，将细胞悬液于300
×
g离心10min，弃上清，用20ml新鲜的nk细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加10iu/ml hril-2，之后每隔一天添加10iu/ml hril-2，继续培养11天；
101.第28天(从第一次共培养的第1天开始计算)收集细胞进行细胞计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(抗cd3和抗cd56抗体)。
102.由上述方法制备的nk细胞的纯度达90％，总细胞数扩增倍数达2000倍。
103.制备例3
104.将2
×
106个pbmc细胞和1
×
106个k562饲养细胞均匀混合于10ml nk细胞培养液中，接种于t75细胞培养瓶(nunc公司)内，按液体总体积计，加入1000iu/ml hril2，置于37℃潮化细胞培养箱(thermo公司)中，每隔48h补充hril2(按液体总体积计补充浓度为1000iu/ml)，共培养6天，收集细胞计数；
105.计数完毕后，取出收集细胞中的2
×
106个细胞与另外的1
×
106个k562饲养细胞混合于10ml新鲜的nk细胞培养液中，按液体总体积计，添加50ng/ml hril-12、100ng/ml hril-15和100ng/ml hril-18，接种于t75细胞培养瓶内，置于37℃潮化细胞培养箱中培养过夜；
106.从第二次共培养开始的12～24小时后，将细胞悬液于300
×
g离心10min，弃上清，用10ml新鲜的nk细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加1000iu/ml hril-2，之后每隔48h添加1000iu/ml hril-2，继续培养5天；
107.第12天(从第一次共培养的第1天开始计算)收集细胞进行细胞计数，取2
×
106个细胞进行流式细胞表型分析(抗cd3和抗cd56抗体)。
108.由上述方法制备的nk细胞的纯度达80％，总细胞数扩增倍数达1000倍。
109.由此看出，制备例1可以获得最好的nk细胞扩增效果。
110.试验例1单纯饲养细胞方法和本发明方法的比较
111.本试验例比较了分别采用饲养细胞方法(cnk)和本发明的方法(enk)制备的nk细胞总数和细胞纯度，本发明的方法按照制备例1的方法进行，单纯饲养细胞方法与制备例1的方法的不同之处在于，在第二次共培养时不添加hril-12、hril-15和hril-18，但在第二次培养起始时添加50iu/ml hril-2，之后每隔一天按全液体积添加50iu/ml hril-2，共培养7天后收集nk细胞。
112.采用两种方法从19个正常捐献者样本(每个样本分别进行两种方法)中制备nk细胞，对获得的细胞总数扩增倍数进行比较，结果如图1所示，制备例1的方法得到的细胞总数扩增倍数显著高于单纯饲养细胞方法得到的细胞总数扩增倍数(p《0.0001)；进一步分析发现，有17个样本在采用制备例1的方法扩增后，细胞总数扩增倍数得到显著提高，提高幅度从50倍到1800倍(提高幅度指本发明方法的细胞总数扩增倍数减去单纯饲养细胞方法的细胞总数扩增倍数)不等，通过本发明的方法制备的enk细胞，细胞扩增倍数最高可达6300倍。
113.此外，对两种方法获得的nk细胞纯度(cd3-cd56

)进行比较，结果如图2所示，制备例1扩增得到的nk细胞的纯度显著高于单纯饲养细胞方法(p《0.005)；进一步分析发现，所有样本在采用制备例1的方法扩增后，nk细胞的纯度得到提高，提高幅度从2％到51％不等；其中有三个样本采用单纯饲养细胞方法扩增后，nk细胞纯度只有63％、41％和31％，但是采用制备例1的方法扩增后，nk细胞纯度分别提高至81.2％、80.8％和82％；不仅如此，如果采用单纯饲养细胞方法培养nk细胞后，纯度已达90％以上，制备例1的方法仍可将其纯度提高几个百分点，例如有一个样本，其纯度从95.4％(单纯饲养细胞)提高至98.5％(制备例1)。
114.试验例2细胞因子加入时间点的比较
115.本试验例比较了在nk细胞扩增过程的不同时间点加入细胞因子组合物(hril-12、hril-15、hril-18)和饲养细胞对细胞总数和细胞纯度的影响。
116.(1)比较了在第一次共培养起始时加入细胞因子组合物(pbmc c组)、饲养细胞
(pbmc f组)或细胞因子组合物和饲养细胞的组合(pbmc c f组)对nk细胞生长的影响。
117.pbmc c组(3个样本)：将2
×
106个pbmc置于10ml nk细胞培养液中，培养第0天按液体总体积加入10ng/ml hril-12、50ng/ml hril-15和50ng/ml hril-18，过夜处理(约12～24小时)，随后按照制备例1的方法将nk细胞洗净，立即按液体总体积添加50iu/ml hril-2，之后每隔一天按液体总体积添加50iu/ml hril-2，并继续培养9天。如图3a和图3b所示，该处理组获得的总细胞扩增倍数和细胞纯度都很低。
118.pbmc f组(6个样本)：在pbmc培养第0天，按照pbmc:k562的细胞数比例为1:1加入饲养细胞，但不加入hril-12、hril-15和hril-18，其他操作同pbmc c组。如图3a和图3b所示，该处理组的总细胞扩增倍数和nk纯度都较高。
119.pbmc c f组(2个样本)：在pbmc培养第0天，同时加入k562饲养细胞和细胞因子组合物(hril-12、hril-15、hril-18)，细胞比例同pbmc f组，细胞因子浓度同pbmc c组，其他操作同pbmc c组。如图3a和图3b所示，该处理组的总细胞扩增倍数虽然较高，但是nk细胞的纯度却降低且不稳定。
120.因此，在第一次共培养中，仅添加饲养细胞是nk细胞的最好生长条件。
121.(2)比较了在第二次共培养起始时加入细胞因子组合物(nk c组)、饲养细胞(nk f组)或细胞因子组合物和饲养细胞的组合(nk c f组)对nk细胞生长的影响，并设置对照组(仅hril-2组)。
122.第一次共培养按照pbmc f组进行，收集细胞群体计数，计数完毕取出2
×
106个细胞混合于10ml新鲜的nk细胞培养液中进行第二次共培养；
123.仅hril-2组(7个样本)：在第二次共培养第0天，按液体总体积计添加50iu/ml hril-2，之后每隔一天按液体总体积添加50iu/ml hril-2，继续培养7天。如图3c和图3d所示，nk纯度很高，但是细胞总数最多扩增2倍。
124.nk c组(2个样本)：在第二次共培养第0天，按液体总体积计加入10ng/ml hril-12、50ng/ml hril-15和50ng/ml hril-18，过夜处理(约12～24小时)，随后按照制备例1的方法将nk细胞洗净，立即按液体总体积添加50iu/ml hril-2，之后每隔一天按液体总体积添加50iu/ml hril-2，并继续培养6天。如图3c和图3d所示，nk纯度略有升高，但是细胞总数的扩增较低。
125.nk f组(7个样本)：在第二次共培养第0天，按照pbmc:k562的细胞数比例为1:1加入饲养细胞，但不加入hril-12、hril-15和hril-18，其他操作同nk c组。如图3c和图3d所示，细胞总数扩增倍数得到提高，但nk纯度与仅hril-2组类似；
126.nk c f组(7个样本)：在第二次共培养第0天，同时加入k562饲养细胞和细胞因子组合物(hril-12、hril-15、hril-18)，细胞比例同nk f组，细胞因子浓度同nk c组，其他操作同nk c组。如图3c和图3d所示，总细胞扩增倍数得到显著提高，nk细胞纯度也略有升高。
127.因此，在第二次共培养中，同时添加饲养细胞和hril-12、hril-15以及hril-18会获得更好的nk细胞扩增结果。
128.试验例3电转条件的比较
129.(1)本试验例比较了向mrna添加不同长度的polya(150a和170a)以及添加polya的方式(dna模板本身带有polyt和用试剂盒加a)对电转后转基因表达的影响。
130.模板为编码mgfp car(gfp代替第一代nkg2d car中的胞外抗原结合结构域，因gfp
表达在膜表面，m代表membrane，这是car的阴性对照)的mrna，模板本身带有polyt(dna采用tail-pcr大剂量合成并带有polyt尾)，或者按照mmessage mmachine t7 ultra转录试剂盒(ambion公司)的操作说明在mrna的3’端加a。
131.将制备例1制备的1
×
107个活性增强型nk细胞与4μg mgfp car mrna混合于100μl opti-mem(gibco公司)中，置于2mm电击杯(bio-rad公司)中，冰浴5min；使用btx电转仪(agilepulse max large volume transfection system，购自btx公司)，在260v电压、4ms脉冲时间的条件下进行电转；电转后，将细胞取出置于2ml nk细胞培养液中，加入终浓度为50iu/ml的hril-2，置于37℃、5％co2培养箱中恢复过夜；24小时后收集细胞，使用流式细胞仪(accuri c6，购自bd公司)对电转细胞进行鉴定。
132.如图4所示，相比于使用试剂盒向mrna加a(细胞群体中gfp阳性细胞占总细胞群体的比例为61.6％，mfi(平均荧光强度)＝4131)的方式，dna模板本身带有polyt的方式，使得mrna的电转效率更高，分别为：150a：82.8％，mfi＝9664；170a：85.9％，mfi＝8159。模板中本身带有150t和170t对电转效率没有显著区别。结果数据如表1所示。
133.表1
[0134][0135][0136]
根据以上试验结果，后续实验中采用模板中本身带有150个polya的方法来合成mrna。
[0137]
(2)本试验例还比较了不同电转缓冲液opti-mem(gibco公司)和cytoportration缓冲液(btx公司)对电转效率和细胞存活率的影响。如图5所示，采用opti-mem(不含酚红)作为电转缓冲液时，电转效率(mfi＝9664)和存活率(58.5％)(存活率：电转组的细胞数目除以阴性对照、没有电转组的细胞数目)比采用cytoportration作为电转缓冲液时的电转效率(mfi＝4671)和存活率(11％)高。结果数据如表2所示。
[0138]
表2
[0139]
样品mfi存活率nk597100％nk-mgfpz cytoportration467111％
nk-mgfpz opti-mem966458.5％
[0140]
本试验例总结了采用上述优选条件进行电转后的nk细胞存活率和电转效率，如表3所示。电转的细胞数目为(5～50)
×
106个，缓冲液体积为100～200μl，用2mm电击杯。电转的存活率为60％，电转效率(gfp阳性细胞占总细胞群体约82％)为82％。
[0141]
表3
[0142][0143][0144]
实施例1编码mgfp car的mrna电转nk细胞
[0145]
本实施例比较了单纯饲养细胞方法(图中示为cnk)和本发明的方法(图中示为enk)制备的活性增强型nk细胞在rna电转过程中的不同。
[0146]
分别将试验例1制备的两种nk细胞(1
×
107个)与4μg mgfp car mrna混合于100μl opti-mem(gibco公司)中，置于2mm电击杯(bio-rad公司)中，冰浴5min；使用btx电转仪(agilepulse max large volume transfection system，购自btx公司)，在260v电压、4ms脉冲时间的条件下进行电转；电转后，将细胞取出置于2ml nk细胞培养液中，加入终浓度为50iu/ml的hril-2，置于37℃、5％co2培养箱中恢复过夜；24小时后收集细胞，使用流式细胞仪(accuri c6，购自bd公司)对电转细胞进行鉴定。
[0147]
结果如图6所示，enk mgfp-car表达gfp的百分比显著高于cnk mgfp-car表达gfp的百分比(p＝0.001)；进一步发现，采用本发明的方法从绝大多数样本中制备的nk细胞，电转后第二天gfp表达的百分比都比采用单纯饲养细胞方法制备得到的nk细胞有所提高，尤其是有一个样本，采用单纯饲养细胞方法制备的nk细胞，其gfp表达的百分比为67.8％，而采用本发明的方法制备的nk细胞，其gfp表达的百分比高达91.7％。
[0148]
不仅如此，如图7所示，enk mgfp-car的gfp表达强度显著高于cnk mgfp-car的gfp表达强度(p《0.0001)；进一步而言，采用本发明的方法从所有样本中制备的nk细胞，电转后第二天gfp表达的强度都比采用单纯饲养细胞方法制备得到的nk细胞有所提高，其中有6个样本分别提高一倍左右。
[0149]
实施例2编码nkg2d car的mrna电转nk细胞
[0150]
本实施例检测了向nk细胞电转编码nkg2d car2的mrna的效率。
[0151]
分别将试验例1制备的两种nk细胞cnk和enk(1
×
107个)与4μg nkg2d car2 mrna混合于100μl opti-mem(gibco公司)中，置于2mm电击杯(bio-rad公司)中，冰浴5min；使用btx电转仪(agilepulse max large volume transfection system，购自btx公司)，在260v电压、4ms脉冲时间的条件下进行电转；电转后，将细胞取出置于2ml nk细胞培养液中，加入
终浓度为50iu/ml的hril-2，置于37℃、5％co2培养箱中恢复过夜；24小时后收集细胞，使用流式细胞仪(accuri c6，购自bd公司)对电转细胞进行鉴定。
[0152]
由于nk细胞本身表达nkg2d，本实施例采用apc结合的抗人nkg2d抗体对电转细胞进行细胞染色，分析nkg2d的平均荧光强度(mfi)。结果如图8所示，enk nkg2d car 2表达的nkg2d的平均荧光强度显著高于cnk nkg2d car 2表达的nkg2d的平均荧光强度(p《0.005)；进一步而言，采用本发明的方法从所有样本中制备的nk细胞，电转后第二天nkg2d的平均荧光强度都比采用单纯饲养细胞方法有所提高，其中有5个样本的nkg2d平均荧光强度呈现显著的提高。
[0153]
因此，从实施例1和实施例2可以看出，本发明的方法制备的nk细胞具有更强的外源基因接受能力，电转后基因表达的强度和百分比都有所提高，为进行car表达提供了方便。
[0154]
实施例3活性增强型nk细胞和car修饰的活性增强型nk细胞的杀瘤能力
[0155]
本实施例比较了单纯饲养细胞方法(图中示为cnk)和本发明的方法(图中示为enk)制备的活性增强型nk细胞的天然杀瘤能力(电转编码mgfp car的mrna)，以及电转编码nkg2d car2的mrna后的杀瘤能力，检测了nk细胞对人卵巢癌细胞系skov3、人头颈癌细胞系fadu和人髓系白血病细胞系kg1的杀伤能力。
[0156]
将实施例1电转mgfp car的不同nk细胞(cnk mgfp car和enk mgfp car)或实施例2电转nkg2d-car2的不同nk细胞(cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2)分别与5
×
103个人卵巢癌细胞系skov3、人头颈癌细胞系fadu和人髓系白血病细胞系kg1共培养于u型96孔板(nunc公司)，上述nk细胞与靶标细胞的个数比例(e:t)为2.5:1～10:1或5:1～20:1，每组3个复孔；经过2小时的共培养后，采用delfia eutda细胞毒性试剂盒(美国perkinelmer公司)检测表达mgfp car的nk细胞和表达nkg2d car的nk细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果的公式计算为：
[0157]
％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-自然释放(读数))/(最大释放(读数)-自然释放(读数)))
×
100
[0158]
结果如图9a、图9b和图9c所示，cnk mgfp car细胞对skov3、fadu和kg1的天然杀伤能力分别为12.3％、31.3％、16.3％，enk mgfp car细胞对skov3、fadu和kg1的天然杀伤能力分别为32％、43.4％、22.6％，分别显著增强了约20个百分点(p《0.001)、12个百分点(p《0.01)和6个百分点(p《0.01)(e:t＝5:1)；在电转并表达nkg2d car2后，如图9d、图9e和图9f所示，cnk nkg2d car2细胞对skov3、fadu和kg1的杀伤能力分别为29.5％、55％、28.8％，enk nkg2d car2细胞对skov3、fadu和kg1的杀伤能力分别为50.4％、67.9％、43.8％，分别显著增强了约21个百分点(p《0.001)、13个百分点(p《0.01)和15个百分点(p《0.05)(e:t＝5:1)；特别地，在对skov3的杀伤中，enk mgfp car细胞的天然杀伤能力已经与cnk nkg2d car2细胞的杀伤能力相当，这体现了本发明制备的nk细胞为活性增强型nk细胞，其在肿瘤杀伤能力中具有明显的优势。
[0159]
不仅如此，如图10a、图10b和图10c所示，在e:t＝5:1的条件下，与cnk mgfp car相比，本发明制备的enk mgfp car对skov3、fadu和kg1的天然杀瘤活性分别增强了2％、-2％、6％；nkg2d car2修饰后，与cnk mgfp car相比，cnk nkg2d car2对skov3、fadu和kg1的杀瘤活性分别增强了24％、8％、12％，enk nkg2d car2对skov3、fadu和kg1的杀瘤活性分别增强
了32％、36％、27％。
[0160]
上述结果进一步证实，本发明制备的nk细胞修饰car分子后，肿瘤杀伤功能的增强结果显著高于采用enk的肿瘤杀伤功能的增强结果和修饰嵌合抗原受体的肿瘤杀伤功能的增强结果两者的简单叠加，这意味着产生了协同效果，可以推测这是由于嵌合抗原受体的电转染效率在采用本发明制备的活性增强型nk细胞进行嵌合抗原受体修饰时出乎意料地得到了进一步的增加，由此体现了本发明的方法制备的nk细胞在抗肿瘤能力中的优势。
[0161]
实施例4 nk细胞的ifnγ分泌能力
[0162]
nk细胞不仅具有直接的肿瘤杀伤能力，还可以分泌一些细胞因子，如ifnγ，来增强抗肿瘤能力。本实施例比较了单纯饲养细胞方法(图中示为cnk)和本发明的方法(图中示为enk)制备的活性增强型nk细胞的ifnγ分泌能力，以及电转编码nkg2d car2的mrna后的ifnγ分泌能力，检测了nk细胞与人卵巢癌细胞系skov3或人头颈癌细胞系fadu共培养过夜后，ifnγ的分泌能力。
[0163]
将实施例1电转mgfp car的不同nk细胞(cnk mgfp car和enk mgfp car)或实施例2电转nkg2d-car2的不同nk细胞(cnk nkg2d car2和enk nkg2d car2)分别与5000个人卵巢癌细胞系skov3、人头颈癌细胞系fadu共培养于ifnγelispot检测板(mabtech公司)上，上述nk细胞与靶标细胞的数量比例(e:t)为2:1，每组3个复孔；经过24小时的共培养后，显影并使用软件immunospot进行elispot点计数。
[0164]
结果如图11a、图11b、图12a和图12b所示，在电转并表达mgfp car后，cnk mgfp car与skov3或fadu共培养过夜后，几乎没有细胞分泌ifnγ(平均值分别为1.6个/1
×
104个和10个/1
×
104个)；而enk mgfp car与skov3或fadu共培养过夜后，可分泌ifnγ的nk细胞数的平均值分别为31个/1
×
104个和133个/1
×
104个，显著增加约29个/1
×
104个(p《0.05)和123个/1
×
104个(p《0.05)；在电转并表达nkg2d car后，靶向skov3和fadu细胞可分泌ifnγ的cnk nkg2d car2细胞数的平均值分别为184个/1
×
104个和384个/1
×
104个，靶向skov3和fadu细胞可分泌ifnγ的enk nkg2d car2细胞数的平均值分别为345个/1
×
104和526个/1
×
104，显著提高了约160个/1
×
104个(p《0.001)和140个/1
×
104个(p《0.01)。由此可知，本发明的方法制备的活性增强型nk细胞针对skov3和fadu的ifnγ分泌能力显著提高。
[0165]
不仅如此，如图11a和图11b所示，在对skov3的ifnγ分泌中，当e:t为2:1时，与单纯饲养细胞方法制备的nk细胞相比，本发明制备的活性增强型nk细胞中可以分泌ifnγ的nk细胞数平均值提高了29个/1
×
104个；nkg2d car修饰后，与单纯饲养细胞方法制备的nk细胞相比，单纯饲养细胞方法制备nk中可以分泌ifnγ的nk细胞数平均值增高了183个/1
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104个，本发明制备的活性增强型nk细胞中可以分泌ifnγ的nk细胞数平均值增高了344个/1
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104个。
[0166]
skov3的结果进一步证实，本发明制备的nk细胞修饰car分子后，ifnγ分泌能力的增强结果显著高于采用本发明的方法制备的活性增强型nk细胞的天然ifnγ分泌能力的增强结果和进行嵌合抗原受体修饰带来的ifnγ分泌能力的增强结果两者的简单叠加，这意味着产生了协同效果，可以推测这是由于嵌合抗原受体的电转染效率在采用本发明制备的活性增强型nk细胞进行嵌合抗原受体修饰时出乎意料地得到了进一步的增加，进一步体现了由本发明的方法制备的nk细胞在抗肿瘤能力中的优势。
[0167]
实施例5 anti-pdl1 car修饰后的cnk和enk的比较
car的表达百分比为90.9％，平均荧光强度为18018。
[0178]
将本实施例电转mgfp car2的enk细胞(enk mgfp car)或电转abcma car的enk细胞(enk abcma car)分别与5
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103个人急性髓性白血病细胞系ksm11共培养于u型96孔板(nunc公司)，上述nk细胞与靶标细胞的个数比例(e:t)为10:1、5:1、2.5:1、1.25:1，每组3个复孔；经过2小时的共培养后，采用delfia eutda细胞毒性试剂盒(美国perkinelmer公司)检测表达mgfp car2的nk细胞和表达abcma car的nk细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果的公式计算为：
[0179]
％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-自然释放(读数))/(最大释放(读数)-自然释放(读数)))
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100
[0180]
结果如图14c所示，enk细胞在电转abcma car后，对ksm11的杀伤能力比电转mgfp2 car后显著的增强(p《0.001)。
[0181]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。