高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用与流程

技术特征：
1.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-1，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶基因ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株t-1。2.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-2，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建出菌株t-2。3.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-3，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，同时敲除ncgl0181和ncgl2395基因，构建出菌株t-3。4.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-4，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-3的基础上，在基因组ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
，构建出菌株t-4。5.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-5，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-4的基础上，在基因组ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
lcb
，构建出菌株t-5。6.一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株t-6，是通过菌株cgmcc no.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株t-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pxt01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
插入pxt01质粒，构建质粒pxt01-glna
bsu
，并将pxt01-glna
bsu
电转化进入菌株t-5，构建出菌株t-6。7.权利要求1-6所述高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶基因ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株t-1；(2)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建菌株t-2；(3)以谷氨酸棒杆菌cgmcc no.1.16145为出发菌株，同时敲除ncgl0181和ncgl2395基因，构建菌株t-3，通过发酵实验分析敲除ncgl0181和ncgl2395基因对谷氨酰胺发酵的影响；(4)在菌株t-3的基础上，在基因组ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
，构建菌株t-4；在菌株t-4的基础上，在基因组ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
lcb
，构建菌株t-5；(5)在菌株t-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pxt01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glna
bsu
插入pxt01质粒，构建质粒pxt01-glna
bsu
，并将pxt01-glna
bsu
电转化进入菌株t-5，构建出菌株t-6。8.权利要求1-6所述谷氨酸棒杆菌菌株生产l-谷氨酰胺的应用，其特征在于：具体发酵
生产方法如下：(1)将谷氨酸棒杆菌菌株t-1～t-6中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；(2)一级种子摇瓶定容种子培养基100ml，32℃，ph 7.0，220rmp/min，摇床培养10h；(3)发酵罐二级种子培养，一级种子液全部接入5l发酵罐内进行二级种子培养，培养基定容2l，34℃，ph7.0，溶氧30-50％，培养至od
600
达到40；(4)发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3l，34℃，溶氧30-50％。9.根据权利要求8所述的高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，其特征在于：采用的种子培养基为：葡萄糖25g/l，玉米浆干粉15g/l，豆浓15ml/l，k2hpo4·
3h2o 1g/l，mgso4·
7h2o 1g/l。10.根据权利要求8所述的高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，其特征在于：采用的发酵培养基为：k2hpo4·
3h2o 1.8g/l，vb
1 0.1mg/l，豆浓10ml/l，玉米浆干粉4g/l，mnso4·
h2o 10mg/l，feso
4 10mg/l，znso45mg/l，mgso4·
7h2o 1g/l，(nh4)2so
4 60g/l。

技术总结
本发明提供了一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用，所述谷氨酸棒杆菌通过菌株TCCC 11822经过五步改造获得，相比原菌株TCCC 11822L-谷氨酰胺产量提高了74.9％、副产物谷氨酸降低了67.4％，GS酶活大幅度提高，糖酸转化率达到37.1％；所述构建方法通过敲除谷氨酰胺酶基因Ncgl2395和Ncgl2500，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸和NH


技术研发人员：徐庆阳 刘云鹏
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2022/1/10