一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法。


背景技术：

2.环已六醇中肌醇最被人所熟识，因存在于肌肉组织中而得名。肌醇具有广泛的用途，在饲料工业中作为生物促进剂可促进牲畜生长和防止死亡，在食品工业中作为营养强化剂可防止脂肪在人体内特别是心血管内沉积。
3.目前，中国生产肌醇的主要原料仍为农产品加工过程中的副产物，如玉米和米糠等的浸渍液。为了减少能耗和污染，利用生物法制备肌醇越来越受到研究者的重视，主要包括微生物酶催化法和微生物发酵法。发酵法主要以混合糖类为原料，以酵母菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌为主要生产菌经发酵分泌肌醇到发酵液中，再经对发酵液处理，浓缩结晶制得高纯度的肌醇。
4.大规模生产中大肠杆菌易受到噬菌体的污染，枯草芽孢杆菌难以达到较高的菌体密度，因此酵母菌是最适合工业化发酵生产肌醇的菌株。利用酵母菌生产肌醇是建立在对其肌醇代谢途径的理论研究基础之上的。1976年报道了分泌肌醇的酵母菌s.cerevisiaes(ino )的肌醇生物合成的控制。1981年发现s.cerevisiaes中至少存在3个基因位点对肌醇的生物合成关键酶的合成起着阻遏作用。1990年利用基因工程技术得到肌醇生物合成的负调节因子opi1基因缺陷并多拷贝ino1基因的酿酒酵母ys2，提供了利用基因工程制备肌醇的方法，但ys2摇瓶水平肌醇产量仅为1.021g/l。
5.巴斯德毕赤酵母是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，已经成功表达了近700种外源蛋白，48h时其菌体生物量(od
600
)可达395。因此，提供一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，进一步提高肌醇产量。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：
9.(1)以巴斯德毕赤酵母gs115为出发菌株，敲除糖酵解关键基因pgi，获得敲除pgi基因的菌株
△
pgi-gs115；
10.(2)敲除菌株
△
pgi-gs115的肌醇生物合成负调节基因pas_chr-1_0033，获得敲除pas_chr-1_0033基因的菌株
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115；
11.(3)在菌株
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115中过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，构建产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )。
12.进一步，一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：
13.(1)pcr扩增zeocin基因及pgi基因上下游400bp序列；
14.(2)利用重叠pcr将上述3个基因片段连接，获得序列zeocin-ud；
15.(3)将序列zeocin-ud通过电转化转入毕赤酵母gs115感受态细胞中，筛选获得敲除了pgi基因的工程菌
△
pgi-gs115；
16.(4)pcr扩增g418基因及肌醇生物合成负调节基因pas_chr-1_0033上下游400bp序列，并采用重叠pcr将其连接获得g418-ud；
17.(5)将g418-ud以电转化的方式转入
△
pgi-gs115感受态细胞中，筛选获得敲除了pas_chr-1_0033基因的工程菌
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115；
18.(6)将构建好的ppic9-ino1质粒通过电转化转入菌株
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115中，筛选获得
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )工程菌株。
19.进一步，所述产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌在制备含有肌醇产品中的应用。
20.本发明利用生物信息学方法寻找毕赤酵母基因组中肌醇生物合成转录抑制子基因opi1的同源蛋白，经过序列比对，发现基因pas_chr-1_0033与opi1蛋白100％同源。
21.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，通过敲除巴斯德毕赤酵母gs115中糖酵解关键基因pgi和肌醇生物合成负调节基因pas_chr-1_0033，同时过表达肌醇-3-磷酸合成酶(ino1)基因，提出了一种利用巴斯德毕赤酵母gs115表达肌醇的新方法。
22.本发明首次以巴斯德毕赤酵母为表达宿主，实现了毕赤酵母表达肌醇的实用技术，采用高密度发酵培养的方法，最终工程菌在5l发酵罐中肌醇产量可达32.3g/l。目前利用生物发酵技术生产肌醇的宿主大多采用大肠杆菌，其易受噬菌体污染且发酵周期较长。本发明构建的产肌醇巴斯德毕赤酵母工程菌，可获得较高的菌体密度，同时大大减少噬菌体污染对大规模肌醇生产的影响。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
24.图1附图为本发明pcr验证的巴斯德毕赤酵母gs115中pgi基因已敲除的核酸凝胶电泳图；
25.其中，m为dna marker；ck为野生型gs115基因组pcr产物；1为菌落pcr筛选获得的阳性克隆基因组pcr产物；
26.图2附图为本发明pcr验证的
△
pgi-gs115中pas_chr-1_0033基因已敲除的核酸凝胶电泳图；
27.其中，m为dna marker；ck为野生型gs115基因组pcr产物；1-3为抗性筛选的3个菌落基因组pcr产物，仅3为菌落pcr筛选获得的阳性克隆；
28.图3附图为本发明puc57-ino1载体图谱；
29.图4附图为本发明ppic9载体图谱；
30.图5附图为本发明重组质粒ppic9-ino1的酶切鉴定结果；
31.其中，m为dna marker；1-6分别为重组质粒ppic9-ino1的双酶切产物；
32.图6附图为本发明重组质粒ppic9-ino1载体图谱；
33.图7附图为本发明5l发酵罐中肌醇的产量，其中肌醇出峰时间为12.265min。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1巴斯德毕赤酵母gs115中糖酵解关键基因pgi的敲除
36.分别以gs115基因组和ppizα为模板，设计合成引物ap-f/r、cp-f/r、zeocin-f/r。具体引物序列如下：
37.ap-f：5
’-
acttagaaacgttgctttgacgtaataggtcacctgtg-3’；seq id no.1；
38.ap-r：5
’-
ggcactggtcaacttggccattttatcaattggttggagtt-3’；seq id no.2；
39.cp-f：5
’-
cgaggagcaggactgaggcgttctagttatagagat-3’；seq id no.3；
40.cp-r：5
’-
ctaaacatcccaaagttcaaaaactcattgctggct-3’；seq id no.4；
41.zeocin-f：5
’-
aactccaaccaattgataaaatggccaagttgaccagtgcc-3’；seq id no.5；
42.zeocin-r：5
’-
atctctataactagaacgcctcagtcctgctcctcg-3’；seq id no.6。
43.以gs115基因组为模板，ap-f/r和cp-f/r为引物，分别pcr扩增dna片段ap和cp，两者pcr反应体系和反应程序一致。pcr反应体系：2x phanta max buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
44.以ppizα为模板，zeocin-f/r为引物，pcr扩增dna片段zeocin；pcr反应体系：2x phantamax buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；100x模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
45.然后使用引物ap-f和cp-r进行重叠pcr将片段ap、cp和zeocin连接，获得序列zeocin-ud。pcr反应体系：2x phanta max buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；三种片段模板各1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性10min；95℃变性45s，57.5℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。以电转化的方式转入gs115感受态细胞中，利用同源重组的方法敲除pgi基因(pgi基因的核苷酸序列见seq id no.7)。以博来霉素(zeocin，300μg/ml)进行抗性筛选，通过菌落pcr筛选阳性克隆，并提取基因组进行pcr验证，引物分别为ap-f和cp-r，pcr反应体系：2x phantamax buffer 10μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至20μl。反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。pcr验证结果见图1，pgi基因若
未敲除条带大小在1.5k-3k之间；若已敲除则条带大小应为1.2k左右。所构建的敲除pgi基因的新菌株命名为
△
pgi-gs115。
46.实施例2
△
pgi-gs115中肌醇生物合成负调节基因pas_chr-1_0033的敲除
47.分别以gs115和pug6为模板，设计合成引物az-f/r、cz-f/r、g418-f/r。
48.具体引物序列如下：
49.az-f：5
’-
cgttagccaatagtgtccctgcattctggttcctcc-3’；seq id no.8；
50.az-r：5
’-
gtattctgggcctccatgtctgtttggcagattctgtgtc-3’；seq id no.9；
51.cz-f：5
’-
tgaatgctggtcgctatactgattattctatagatttagga-3’；seq id no.10；
52.cz-r：5
’-
tttggctcgttcgactgccatggtcgtcaa-3’；seq id no.11；
53.g418-f：5
’-
gacacagaatctgccaaacagacatggaggcccagaatac-3’；seq id no.12；
54.g418-r：5
’-
tcctaaatctatagaataatcagtatagcgaccagcattca-3’；seq id no.13。
55.以gs115基因组为模板，az-f/r和cz-f/r为引物，分别pcr扩增dna片段az和cz；两者pcr反应体系和反应程序一致。pcr反应体系：2x phanta max buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
56.以pug6为模板，g418-f/r为引物，pcr扩增dna片段g418；pcr反应体系：2x phanta max buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；100x模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
57.然后使用引物az-f和cz-r进行重叠pcr将片段az、cz和g418连接，反应体系：2x phantamax buffer 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；三种片段模板各1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至50μl。pcr反应程序：95℃预变性10min；95℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温，获得g418-ud。以电转化的方式转入
△
pgi-gs115感受态细胞中，利用同源重组的方法敲除pas_chr-1_0033基因(pas_chr-1_0033基因的核苷酸序列见seq id no.14)。以g418(500μg/ml)进行抗性筛选，通过菌落pcr筛选阳性克隆，并提取基因组进行pcr验证，引物分别为az-f和cz-r，pcr反应体系：2x phantamax buffer 10μl；dntp mix(10mm each)1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 0.6μl；模板1μl；上下游引物(100μm)各0.1μl；ddh2o补足至20μl。pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。pcr验证结果见图2，若扩增出pas_chr-1_0033基因则条带位于1k-2k之间，若pas_chr-1_0033基因已敲除则条带位于750bp-1000bp之间，仅泳道3为菌落pcr筛选获得的阳性克隆。所构建新菌株命名为
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115。
58.实施例3
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )工程菌的构建
59.结合毕赤酵母密码子偏好性对ino1基因(ino1基因的核苷酸序列见seq id no.15)进行全合成，并在该基因的5’和3’端分别引入ecor i和xhoi限制性酶切位点，合成好的基因连接到puc57载体上，命名为puc57-ino1，载体图谱见图3。
60.将质粒puc57-ino1和ppic9(图谱见图4)分别进行ecor i和xho i双酶切处理；双酶切反应条件为37℃水浴2-3h。将双酶切产物分别进行胶回收，得到两端分别带有ecor i和xho i酶切位点的ino1片段和ppic9载体，t4 dna连接酶4℃连接过夜。连接产物转化大肠感受态细胞dh5α，以氨苄青霉素(50μg/ml)筛选阳性克隆，提取质粒并进行酶切验证，结果见图5，其中泳道2和泳道6的质粒酶切鉴定正确。所构建的含有ino1基因的重组表达质粒命名为ppic9-ino1，图谱见图6。
61.将构建好的ppic9-ino1质粒通过电转化转入菌株
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115中，筛选获得
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )工程菌株。
62.实施例4不同菌株摇瓶培养及肌醇表达量的检测
63.上述验证正确的菌株活化后，挑取平板上的单菌落，与野生型gs115分别接种到5ml ypd液体培养基中，30℃、220r/min下培养18h。然后按1％的接种量接种至含有50ml无肌醇发酵培养基(磷酸氢二钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，氯化铵8g/l，硫酸镁3g/l，蔗糖10g/l，甘油20g/l，组氨酸10mg/l)的摇瓶中进行二级扩大培养。将二级种子液按接种后菌体od
600
为0.2的量接种至含有100ml无肌醇发酵培养基的250ml三角瓶中培养。
64.不同菌株接种于发酵培养基中(磷酸氢二钠6g/l，磷酸二氢钾6g/l，氯化铵8g/l，硫酸镁3g/l，蔗糖10g/l，甘油20g/l，组氨酸10mg/l)，30℃、220r/min培养50h后，将上述发酵液的一部分进行离心(10000r/min，3min)，上清液过0.45μm过滤器于样品瓶内，使用岛津气相色谱仪gc-2010plus检测肌醇含量。色谱柱为rtx-1701(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，程序设定：进样口温度：280℃；检测器温度：300℃；载气氮气：1.06ml/min；氢气流速：40ml/min；空气：400ml/min；不分流；进样量：1μl；程序升温：120℃0min、190℃20min、220℃10min。不同菌株肌醇产量见表1。
65.表1不同菌株的肌醇产量
66.菌株名称肌醇产量(g/l)gs1150
△
pgi-gs1150
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs1151.015
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )3.202
67.实施例5
△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )工程菌5l发酵罐培养
68.△
pas_chr-1_0033
△
pgi-gs115(ino )工程菌转化子于ypg培养基培养至光密度值》20，将上述ypg培养物作为发酵罐的种子菌，按1:20的比例将上述种子菌加入到含3l基本盐培养基(磷酸氢二钾10g/l，磷酸氢二钾3g/l，氯化钠0.2g/l，氯化铵1g/l，硫酸镁0.4g/l，柠檬酸1.4g/l，20％的甘油)的5l发酵罐中，30℃，设定发酵罐的溶氧为30％，溶氧的调节与发酵罐的搅拌子串联调控。当基本盐培养基中的甘油耗尽时，补加体积百分比为70％的甘油(700ml甘油、288ml水、12ml ptm1微量元素溶液)，补加甘油的方法是：0-8h补加8ml/h、9-16h补加16ml/h、17h之后按24ml/h补加，当菌体od
600
达到350时停止甘油的补加。发酵结束后将发酵液的一部分进行离心(10000r/min，5min)，上清液过0.45μm过滤器于样品瓶内，使用岛津液相色谱仪lc 2010plus检测肌醇含量为32.3g/l，结果见图7。
69.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。