一种具有NTCP过表达的细胞模型的方法与流程

一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法。


背景技术：

2.肝脏疾病是一种严重危害人类健康的疾病，乙型肝炎病毒(hbv)感染是肝病的主要致病原因之一，目前约有3.5亿人慢性感染hbv，每年有100万人死于hbv相关的肝硬化和肝细胞癌，目前，常规治疗hbv的方法包括干扰素和核苷酸类似物，可以降低宿主的病毒载量，但由于hbv的生理周期的特点，hbv在体内很难被完全清楚，导致不能被完全治愈的最根本原因在于对hbv感染的分子和临床特征的不完全了解。
3.hbv自然感染过程对宿主有一定的范围，目前发现的能够自然感染hbv的物种包括人类和黑猩猩，但黑猩猩作为动物模型受到严重的限制，hbv转基因小鼠也提供了一种hbv体内研究的模型，但小鼠对hbv并不自然敏感，无法满足研究的全部需求，树鼩在进化上与灵长类动物相关，可慢性感染hbv，目前树鼩是唯一对人类hbv敏感的非灵长类动物。
4.经研究发现ntcp蛋白是乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒感染肝细胞的功能性受体，主要功能是通过结合细胞表面受体分子来实现对宿主细胞的感染。在研究hbv感染的过程中，使树鼩的肝细胞表达人源化ntcp，这将更加有助于研究hbv在自然感染过程，为研究hbv感染人肝细胞提供良好的模型，然而体外实验环境更具有可控性，在某些机制的阐述上也更具优势，所以急需一种体外研究的细胞模型，本专利涉及的内容就是在永生化树鼩肝细胞(ith6.1)的基础上高表达人源ntcp，构建人源化树鼩肝细胞，供体外hbv感染研究，为揭示hbv自然感染过程及机制提供良好的细胞模型，所以构建具有ntcp过表达的细胞模型对乙肝的治疗及对ntcp的功能的进一步阐述具有重大意义。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法，实现人源hbv易感性体外建立细胞模型。
6.本发明的技术方案是这样实现的：一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1)、树鼩肝细胞的培养和传代；
8.s2)、肝细胞的细胞铺板：
9.算出步骤s1的细胞数目，取出一块无菌24孔板，以每孔1x104个细胞加入24孔板中，加入1ml 10％fbs的dmem培养基至每孔，混匀，在含5％co2的细胞培养箱中培养；
10.s3)、肝细胞慢病毒hntcp感染；加入含有病毒的培养基，进行病毒培养；
11.s4)、肝细胞感染hntcp单克隆；
12.筛除未感染的肝细胞，筛选完成后，细胞计数，铺96孔板，每孔1个细胞，每2天换液一次，持续约2周后细胞密度至80％～90％，每孔对应传代至24孔板，细胞密度至80％～
90％。传代至6孔板，细胞密度至80％～90％，流式细胞学检测hntcp在ith6.1细胞中的含量；
13.s5)、肝细胞感染hntcp的检测：
14.细胞单克隆后，进行以下检测，经流式细胞学检测，hntcp表达量；q
‑
pcr检测肝细胞hntcp表达量，核酸电泳
‑
凝胶成像hntcp表达量；western blot验证hntcp表达量。
15.所述步骤s1中，包括以下步骤：
16.a)肝细胞复苏：
17.将冻存有树鼩肝细胞的冻存管从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动快速融化，移至15ml离心管中，加入5ml预热的含10％fbs的dmem培养基，吸管轻轻吹匀，离心处理；弃上清液，加入1ml10％fbs的dmem培养基，重悬，接种细胞于t
25
细胞培养瓶，在细胞培养箱中培养；
18.b)肝细胞传代；
19.细胞密度达到80％～90％时，弃培养基，5ml pbs清洗2次。加入1ml含0.25％edta的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min；加人2ml含10％fbs的dmem培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，离心处理；弃上清液，加入1ml10％fbs的dmem培养基，细胞重悬，各0.5ml重悬液分别接种细胞于t
25
细胞培养瓶2瓶，在细胞培养箱中培养；
20.c)细胞计数；
21.同步骤b，重悬完成后，取出细胞计数板，将盖玻片盖在细胞计数槽上。用移液器吸取2ul重悬细胞液，加入至200ulep管中，同时吸取18ul台盼蓝染液加入至ep管中，混匀，制成悬液；吸取10ul已混匀悬液滴入细胞计数板，计算4角4个大方格活细胞数目。
22.所述步骤s3中，肝细胞慢病毒感染包括以下步骤：
23.d)待细胞密度培养至70％
‑
80％时，吸去24孔板中的培养基，将病毒原液取出4度冰箱溶解；
24.e)预混病毒感染培养基：取2300ul完全培养基加入200ul病毒原液和7.5ulpolybrene，病毒滴度为108tcid
50
/100μl,混匀，混合好的液体接种至24孔板250ul/孔,并放入培养箱中培养；
25.f)4h后每孔加入250ul无血清培养基，混匀；
26.g)24h后吸去含有病毒的培养基，加入新鲜的培养基500ul/孔；
27.h)配制筛选培养基：100ml培养基加入100ul嘌呤霉素；
28.i)感染48h后加入筛选培养基500ul/孔；
29.j)每两天换液一次，持续筛选2周，两周后嘌呤霉素浓度减半，继续筛选培养。
30.所述步骤a和b中，离心转速为1000rpm，离心时间3～7min，细胞培养箱中的培养温度为37℃，co2体积浓度为5％。
31.所述的树鼩肝细胞规格为永生化肝细胞ith6.1。
32.本发明解决了背景技术中存在的缺陷,具有以下有益效果：本发明提供一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法，利用树鼩肝永生化细胞建立病毒感染细胞模型的方法，使ith6.1表达人源ntcp，为揭示hbv自然感染过程及机制提供良好的细胞模型，对后续探究hbv病毒感染及相关疾病研究等具有重要意义。此外本发明构建具有ntcp过表达的细胞模型的方法对乙肝的治疗、探讨、评价药物对病毒抑制提供了一个经济省时、表现均一的感染
细胞模型途径。
附图说明：
33.图1树鼩肝原代细胞系ith6.1生长状态图；
34.图2为慢病毒感染后，单克隆细胞在荧光显示镜下图；
35.图3为q
‑
pcr ntcp表达量结果；
36.图4为琼脂糖凝胶电泳结果；
37.图5流式细胞学检测ntcp感染细胞纯度图。
具体实施方式
38.实施例
39.一种具有ntcp过表达的细胞模型的方法，包括以下步骤：
40.s1)树鼩永生化肝细胞(ith6.1，以下用细胞名称)培养；树鼩永生化肝细胞ith6.1，是现有技术。在申请号106939300的专利中有叙述，是一种已经由专利程序保藏机构保藏的细胞，保藏号为cctcc no:c201740。目前可在市场购买得到该生物材料。
41.a)ith6.1细胞复苏：
42.将冻存有ith6.1细胞的冻存管从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动快速融化，移至15ml离心管中，加入5ml预热的含10％fbs的dmem培养基，吸管轻轻吹匀，离心，1000rpm x5min，弃上清液，加入1ml10％fbs的dmem培养基，重悬。接种细胞于t
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细胞培养瓶，在含5％co2的细胞培养箱中培养。
43.b)ith6.1细胞传代：
44.细胞密度达到80％～90％时，弃培养基，5ml pbs清洗2次。加入1ml含0.25％edta的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人2ml含10％fbs的dmem培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，离心，1000rpm x5min，弃上清液，加入1ml10％fbs的dmem培养基，细胞重悬，各0.5ml重悬液分别接种细胞于t
25
细胞培养瓶2瓶，在含5％co2的细胞培养箱中培养。如图1所示，树鼩肝原代细胞系ith6.1生长状态良好。
45.c)细胞计数：
46.同步骤b，重悬完成后，取出细胞计数板，将盖玻片盖在细胞计数槽上。用移液器吸取2ul重悬细胞液，加入至200ulep管中，同时吸取18ul台盼蓝染液(可区分死细胞)加入至ep管中，混匀，制成悬液。吸取约10ul已混匀悬液滴入细胞计数板，计数4角4个大方格活细胞数目。计算：细胞悬液细胞数(ml)＝(4个大方格细胞数/4)x10x 104。
47.s2)ith6.1细胞铺板
48.根据步骤c计算出的细胞数目，取出一块无菌24孔板，以每孔1x104个细胞加入24孔板中，加入1ml10％fbs的dmem培养基至每孔，混匀，在含5％co2的细胞培养箱中培养。
49.s3)ith6.1细胞慢病毒(hntcp)感染：
50.d)待细胞密度培养至70％～80％，吸去24孔板中的培养基，将病毒原液取出4度冰箱溶解；
51.e)预混病毒感染培养基：取2300ul完全培养基加入200ul病毒原液和7.5ulpolybrene，病毒滴度为108tcid
50
/100μl,混匀，混合好的液体接种至24孔板250ul/
孔,并放入培养箱中培养；
52.f)4h后每孔加入250ul无血清培养基，混匀；
53.g)24h后吸去含有病毒的培养基，加入新鲜的培养基500ul/孔；
54.h)配制筛选培养基：100ml培养基加入100ul嘌呤霉素；
55.i)感染48h后加入筛选培养基500ul/孔；
56.j)每两天换液一次，持续筛选2周，两周后嘌呤霉素浓度减半，继续筛选培养。如图2所示，慢病毒感染后，挑取单克隆细胞，荧光显微镜下观察有绿色荧光，说明已获取稳定转染细胞系。
57.s4)ith6.1感染hntcp单克隆：
58.筛选完成后，细胞计数，铺96孔板，每孔1个细胞，每2天换液一次，持续约2周后细胞密度(单细胞成团)至80％
‑
90％。每孔对应传代至24孔板，细胞密度至80％
‑
90％。传代至6孔板，细胞密度至80％
‑
90％，流式细胞学检测hntcp在ith6.1细胞中的含量。经流式细胞学检测，hntcp达到100％,ith6.1感染实验成功。
59.s5)ith6.1感染hntcp检测：
60.细胞单克后，经流式细胞学检测，其结果如图5所示，流式结果显示感染后ith6.1细胞表面高表达ntcp蛋白纯度，虚线部分为阴性对照，其中hntcp达到99.9％,ith6.1细胞慢病毒感染实验成功，可进行后续培养繁殖。q
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pcr检测ith6.1细胞hntcp表达量，hntcp高表达。结果如图3所示，结果显示稳定感染细胞系中ntcp高表达，其次为人肝细胞，未感染ith6.1细胞低表达或不表达。ntcp核酸电泳
‑
凝胶成像hntcp高表达，其结果如图4所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示，感染后ith6.1高表达ntcp且表达条带与目的条带大小相符。
61.western blot验证hntcp表达量，hntcp高表达。
62.本发明提供一种具有ntcp过表达的细胞模型，利用树鼩肝永生化细胞建立病毒感染细胞模型的方法，通过对肝细胞的培养、肝细胞慢病毒hntcp感染，筛选掉未感染的肝细胞，进行感染肝细胞的单克隆和培养繁殖一系列步骤。ith6.1细胞经以上检测，hntcp表达率到99.9％，证明已成功感染，使ith6.1表达人源ntcp，为揭示hbv自然感染过程及机制提供良好的细胞模型，对后续探究hbv病毒感染及相关疾病研究等具有重要意义。
63.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。