微流控芯片技术检测对虾虹彩病毒的方法与流程

1.本发明涉及微流控芯片技术检测对虾虹彩病毒的方法。


背景技术：

2.虹彩病毒(iridescent virus)属虹彩病毒科，是一类二十面体有囊膜双链dna病毒，大小 为130-200nm。虹彩病毒可寄生于无脊椎动物和变温脊椎动物。虹彩病毒科现有5个病毒属： 其中虹彩病毒属(iridovirus)、绿虹彩病毒属(chloriridovirus)寄生于无脊椎动物，蛙病毒属 (ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(megalocytivirus)寄生于鱼类、 爬行类和两栖类等多种变温脊椎动物。
3.虹彩病毒是水产动物病毒中危害极为严重的病毒。感染对虾的虹彩病毒最早于由lightner 和redman发现于马达加斯加的樱虾中；2016年我国学者从养殖红鳌鳌虾(cheraxquadricarinatus)中分离到新的虹彩病毒，命名为红鳌鳌虾虹彩病毒(cherax quadricarinatusiridovirus，cqiv)；2017年黄海水产研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾发现对虾虹 彩病毒，命名为虾血细胞虹彩病毒(shrimp hemocyte iridescent virus，shiv)。根据全基因组序 列比对结果，cqiv和shiv是同一病毒的不同分离株，两者均不属于虹彩病毒科下已建立的 5个属，可能是一种新的虹彩病毒属，鉴于该病毒可同时感染对虾科的南美白对虾等、拟对虾 科的红螯螯虾和螯虾科的克氏螯虾等种类，该病毒现命名为十足目虹彩病毒(decapoda iridovirus)。
4.对虾虹彩病毒感染对虾后，可出现造血组织细胞和肝胰腺血窦、鳃丝等组织内的血细胞出 现核固缩，细胞内可见带嗜碱性细胞质包涵体。病毒感染后对虾空肠空胃、肝胰腺发白、软壳、 体色变红，濒死个体失去游动能力，沉入池塘底部而死；发病严重时，病虾可大批游至池边或 大量在池中漫游，并发生大量死亡，死亡率达50％以上。
5.目前对虾虹彩病毒主要通过pcr(聚合酶链式反应)技术和lamp(环介导等温核酸扩 增)检测。pcr技术对检测设备和操作环境有较高要求、操作较为繁琐，反应只需1对引物， 易受干扰，特异性不足；lamp技术针对靶基因设计4对反应引物，检测准确度和灵敏度更 高，但lamp技术是恒温反应，缺少类似pcr的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异 性扩增从而影响检测结果。
6.微流控芯片(microfluidics)是一种基于微流体界面精确操作的技术，是临床检测前沿最重 要的检测和分析技术。通过在10-100微米通道内进行微量流体的操控、处理和反应，达到分 子检测的目的。该方法制作成本低、设备小型化、高通量、可同时检测多种样本、检测反应的 试剂消耗微量化、分析速度快、灵敏度高，具有操作简单、自动化、集成化等特点。采用微流 控芯片可实现对待测标本多种致病核酸的高通量快速检测，对于基于分子生物学的快速诊断发 展和重大疫病的快速微量检测和疾病源头的阻断具有重大意义。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供对虾虹彩病毒检测用引物组。该引物组特异性好灵敏
度高且稳 定性高，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的前期检测，为疾病防控提供有效参考。该引物组序列 组成如下：
8.p1:5
’-
tgttagatgggcagtcatg-3’9.p2:5
’-
gcatccttgattgctgga-3’10.p3:5
’-
acgaatcgtttcccgtgagacaaatgctgacgaaatcatca-3’11.p4:5
’-
tgggctcgagatttgttccaacgcttgttgcaaatcatgtgta-3’。
12.本发明的第二目的在于提供对虾虹彩病毒检测用的微流控芯片。该微流控芯片以恒温扩增 并固定有上述的“对虾虹彩病毒检测用引物”。
13.本发明的第三目的在于提供对虾虹彩病毒检测系统，所述系统包括上述“对虾虹彩病毒检 测用引物”和微流控芯片。
14.本发明提供的对虾虹彩病毒检测系统中还包括进行等温扩增所需的试剂和/或仪器和/或扩 增产物数据处理器，所述扩增产物数据处理器可用于区分对虾虹彩病毒检测用核酸恒温扩增引 物对待测样本进行等温扩增得到的产物中是否含有特异性扩增产物。
15.本发明上述所述的仪器可为恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，所述扩增产物数据处理器内 设所述恒温扩增微流控芯片核酸分析仪配套软件。
16.本发明在试剂包括反应液、反转录酶、抑制剂，更进一步添加内参用于判定试剂的性能并 防止实验假阴性。
17.在上述试剂中添加待测核酸(目的样本)。
18.优选的、所述的反应液：20mm tris-hcl(ph 8.8)，10mm kcl，10mm(nh4)2so4，8mm mgso4， 0.1％tween-20，1.4mm dntps；bst酶，800u/ml；50μm sybrgreen荧光染料；内参质粒 400copies/μl；金纳米颗粒4.0x10-6
mol/l，0.6u(酶单位)fen1；
19.上述浓度均为各组分在试剂中浓度。
20.本发明还提供一种制备下述1)-3)中任一产品的方法、也属于本发明的保护范围，所述方 法包括：
21.1)制备所述“对虾虹彩病毒检测用引物”中的四个引物组；
22.2)制备所述芯片，该芯片固定有“对虾虹彩病毒检测用引物”；
23.3)制备所述系统，该系统包括步骤1)“对虾虹彩病毒检测用引物”和/或步骤2)的芯片。
24.本发明还提供一种“对虾虹彩病毒检测用引物”,下述任一种应用，属于本发明的保护范围：：
25.1)在制备所述芯片中的应用；
26.2)在制备所述系统中的应用；
27.3)在制备的对虾虹彩病毒检测试剂或试剂盒的应用。
28.本发明提供的微流控芯片是恒温扩增，不需要经过pcr扩增的变性、退火和延伸等变温 过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为60min。 运行程序：低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min， 高速离心时间为30sec。
29.与现有技术相比，本发明具以下优点
30.(1)本发明提出的引物组为4条特异性引物序列，具有特异性强，稳定性高的优势。
31.(2)本发明提出的微流控芯片内含预包埋试剂，可常温保藏。
32.(3)本发明提出的微流控芯片检测系统配备大容量充电锂电池，可在无电源情况下使用， 适合现场快检。
33.(4)本发明将微流控芯片和恒温扩增技术各自优势相结合，在简化操作的同时加快反应 时间(60min出结果)，达到快速检测的目的；灵敏度有效提高(《100copies)；反应 体积仅为pcr技术的20％，大幅降低使用成本。
34.(5)对虾虹彩病毒检测现有主要技术是pcr(聚合酶链式反应)检测技术和lamp(环 介导等温核酸扩增)检测技术。pcr检测对设备要求高、操作较为繁琐，仅使用1 对引物，特异性不足；lamp技术针对靶基因设计4条反应引物，检测准确度更高， 但缺少检测的热启动过程，反应升温阶段易产生非特异性扩增，影响检测结果。本 发明基于lamp技术上进行改良，试剂中采用金纳米颗粒吸附ssdna和蛋白酶， 有效抑制了升温过程中的非特异性反应，实现了热启动扩增反应。
35.(6)本发明采用自行研制的智能可移动核酸微流控检测仪作为微流控芯片检测的解决 方案，与市面上现有的管式lamp技术相比，克服了lamp等温扩增的诸多缺陷， 实现了多靶点、同步、一体化及操作简便等检测过程和效果。
36.(7)本发明提出的微流控芯片检测系统对设备和操作人员要求较低，适用于基层单位与 养殖企业现场开展对虾虹彩病毒早期预警和隐性感染对虾的检测，方便基层检测部 门开展对虾虹彩病毒的检测。
附图说明
37.图1为本发明微流控检测对虾虹彩病毒的流程图。
38.图2为本发明实施例中对疑带有对虾虹彩病毒基因片段的对虾进行检测限实验的20个样 本的扩增结果图。
具体实施方式
39.下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明的技术过程。这些实施案例仅用于说明本发明 相关技术，并不限制本发明的操作和应用范围。本领域技术人员在充分阅读本发明技术核心内 容后，根据实际需要对本发明操作流程作相关修改，这些等价形式同样属本技术所附权利要求 书所限定的范围。
40.实施例1：凡纳对虾养殖场发病塘的虹彩病毒检测
41.1.引物设计
42.通过ncbi genbank寻找对虾虹彩病毒基因序列，根据序列设计4对引物，将其固定在 微流控芯片中相应位置，对微流控芯片进行封装。所设计引物序列为本发明对虾虹彩病毒检测 用引物。
43.2.对虾样品的采集和dna提取
44.某对虾兹殖场共有10口对虾兹殖塘，6月中旬有2口对虾池塘开始发病并陆续死亡，发 病虾出现体色发红、游泳足发黑、空肠空胃、肝胰腺萎缩等症状，从发病塘抽取对虾各5尾， 另从未发病塘抽取对虾5尾，每尾虾取鳃丝、肝胰腺组织，合并后用水生动物组织dna提取 试剂盒提取总dna，作为扩增模板，加入到封装好检测试剂的微流控芯片中，另取
虹彩病毒 感染阳性核酸，作为阳性对照；用双蒸水作为阴性对照。
45.3.模板扩增
46.将上述提取dna加入到带离心功能、恒温功能及加有对虾虹彩病毒检测试剂的微流控芯 片检测仪中，密封后开始恒温扩增，1600r/min离心10秒，使样品核酸进入微流控芯片反应孔； 再4600r/min高速离心30秒，确保样品dna进入反应检测孔。
47.(1)反应体系和试剂见表1：
48.表1.微流控芯片检测体系中18μl反应液的组成
[0049][0050]
表1中，反应液为：20mm tris-hcl(ph 8.8)，10mm kcl，10mm(nh4)2so 4
，8mm mgso4， 0.1％tween-20，1.4mm dntps；bst酶，800u/ml；50μm sybr green荧光染料；内参质粒为 400copies/μl或者0；金纳米颗粒4.0
×
10-6
mol/l；40u/μl；0.6u fen1；
[0051]
(2)对虾虹彩病毒的微流控芯片扩增和检测：
[0052]
采用恒温扩增，不需经pcr扩增过程中变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒 温条件下完成，扩增温度设定为63.5℃，反应时间设定为60min。
[0053]
(3)微流控芯片结果判断：
[0054]
阈值线和内参设定：虹彩病毒检测时，微流控芯片检测仪阈值线设置为800(一般以非典型 s型扩增曲线成ct值为30时的最高点作为阈值线)，(注：在恒温扩增中，ct值意义不同于与 荧光定量pcr的ct值不同，与扩增反应时间有关)。
[0055]
内参可评判试剂有效性，防止实验中假阴性的出现，采用含虹彩病毒目的基因片段的阳性 质粒作为内参。内参应在ct值《30时，出现扩增曲线，表明实验结果有效。
[0056]
微流控芯片检测结果判定：实验结果满足以下条件：1)阳性对照：ct《30，阳性对照反应 孔具明显典型s型扩增曲线；2)阴性对照：ct《30，阴性对照反应孔无扩增曲线。
[0057]
判定标准：1)阳性反应孔ct《30，有明显扩增曲线，判定为阳性；2)阴性：反应孔出现 ct《30，无扩增曲线，判定为阴性。
[0058]
样品在微流控芯片检测仪进行恒温扩增时，仪器会自动实时检测荧光，形成根据荧光检测 的扩增曲线，当某个样品含有虹彩病毒时，相应的检测孔可形成标准s型扩增曲线，该孔即可 判断为阳性；没有扩增曲线的孔为判断为阴性，即表明该样本不含有对虾虹彩病毒核酸。
[0059]
4、发病虾塘的虹彩病毒检测结果
[0060]
本例3个对虾养殖塘、阳性对照和阴性对照的扩增结果如表2。
[0061]
表2某对虾养殖场3个养殖塘的虹彩病毒检测结果
[0062][0063]
注：塘1#和塘2#已发生疾病，塘3#与塘2#相邻，未见发病。
[0064]
从上述检测案例来看，塘1#和塘2#均发生虹彩病毒感染疑似症状，经测定为5尾虾均为 虹彩病毒阳性；塘3#与塘2#紧邻，未发现疾病，但5尾虾中已有2尾可检出虹彩病毒，表明 即将发生疾病。
[0065]
本例表明，采用本发明建立的对虾虹彩病毒系统，可有效确诊养殖对虾塘发生的虹彩病毒 病，并对相邻未发生疾病塘有提早的疾病预警作用，可为疾病的发生提供及时预报。
[0066]
实施例2:凡纳对虾苗种场苗种的虹彩病毒检测
[0067]
1.样本采集
[0068]
来自凡纳对虾规模化养殖场苗种池，共采集3个对虾车间共30个苗种培育池，每池采集 对虾幼体各50尾,作为一个检测单元，共获得30份样本。
[0069]
2.核酸的提取(磁珠法)
[0070]
2.1核酸磁珠法试剂盒组成：裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、核酸共沉剂、洗液
①
、洗液
ꢀ②
、洗液
③
、核酸洗脱液。
[0071]
2.2取苗种池对虾幼体50尾(约0.1-0.15g)，匀浆研磨，加对虾组织裂解液400μl，蛋白 酶混合液20μl，涡旋震荡；
[0072]
2.3 56℃孵育10min，加300μl核酸共沉剂和磁珠2μl，上下颠倒10次，静置10min；
[0073]
2.4 8000g/min离心1min，用移液器吸取管内液体；加入500μl洗液
①
，旋涡振荡10s； 8000g/min离心1min，
[0074]
2.5吸去管内液体；加入500μl洗液
②
，旋涡振荡10s，8000g/min离心1min，吸去管内 液体；
[0075]
2.6加入500μl洗液
③
，旋涡振荡10s，8000g/min离心1min，吸去管内液体；
[0076]
2.7加入50μl洗脱液，56℃孵育3min，10000g/min离心1min，收集核酸溶液。
[0077]
核酸的磁珠提取总时间为30min左右。
[0078]
2.8微流控芯片的模板加入：取提取好的待测样本dna作为扩增模板，加入到微流控芯 片中，对虾虹彩病毒检测用引物和试剂预置于微流控芯片中，密封微流控芯片。
[0079]
2.9离心使样品dna进入扩增孔：1600r/min低速离心10秒，4600r/min高速离心30秒， 确保样品进入相应扩增孔中。
[0080]
2.10扩增：63.5℃，反应60min。
[0081]
3对虾苗种虹彩病毒的套式pcr检测
[0082]
3.1 dna制备：取上述2.1-2.7制备的对虾苗种核酸，用于套式pcr扩增。
[0083]
3.2引物选择：
[0084]
外套引物：ivf145：5'-ggagcattgaagttggatac-3'；
[0085]
ivr961：5'-gaaggatggatacaacaaca-3'；
[0086]
内套引物：ivf300:5'-agtaatcggcagtcatcac-3'；
[0087]
ivr646：5'-ggtgaa tggtggtcttatcc-3'。
[0088]
3.3外套引物的扩增和分析
[0089]
外套引物的扩增条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃55s循环30次；最 后72℃5min；
[0090]
取pcr产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果，阳性样品和阳性对照可 见816bp产品片段，阴性样品和空白对照无扩增片段。
[0091]
3.4内套引物的扩增
[0092]
内套引物的扩增条件为：95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s循环30次；最 后72℃5min；
[0093]
取pcr产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察电泳结果，阳性样品和阳性对照可 见346bp产品片段，阴性样品和空白对照无扩增片段。
[0094]
表3微流控芯片检测系统与套式pcr和普遍pcr的检出率和耗时比较
[0095][0096]
4.检测结果分析
[0097]
本发明的对虾虹彩病毒检测系统对南美白虾苗检测从30份样品中检测13份阳性，检出率 为43.33％，套式pcr从30份样品中检出11份阳性，对虾虹彩病毒检出率为36.67％，采用外 套引物可检出7份样品，检出率为23.33％。
[0098]
从样品检出率看出，本发明的对虾虹彩病毒检测系统在复杂样品中的灵敏性和病原特异性 比套式pcr高1.18倍，比外套引物一次扩增pcr高1.86倍。
[0099]
从检测所耗时间来看，30个对虾苗种样品，从核酸提取到检测完成，耗时1小时50分钟； 采用外套pcr耗时为3小时40分钟；套式pcr耗时5小时50分钟。如不考虑核酸提取时 间，本发明检测耗时为1小时10分钟。