抗大豆花叶病毒的转基因植物构建方法与流程

1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种抗大豆花叶病毒的转基因植物构建方法。


背景技术：

2.转基因技术能够极大地缩短抗病植物品种的选育进程，目前将转基因技术和基因沉默技术相结合已成为培育抗病毒转基因大豆的热门方法。目前已有报道称在大豆内转入产生含有特异片段的发卡结构(hairpin structure)的基因，通过发卡结构被植物内源rna酶dicer切割产生可以靶向大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,smv)hcpro或cp的编码区的小干扰rna(sirna)，或者是靶向与smv蛋白互作的植物內源基因的mrna的sirna，实现对smv的抗性。
3.理论上，使用人工microrna(artificial microrna,amirna)比发卡结构更有优势。首先microrna更特异，产生脱靶的可能性更小，由于microrna很短而且唯一。而发卡结构产生的sirna很多，较容易脱靶，影响内源基因的表达。此外microrna在植物体内更稳定，且适应在低温下发挥作用。
4.2006年，美国洛克斐勒大学niu等以拟南芥(arabidopsis thaliana,at)pre
‑
mir159a基因为骨架，通过转基因的方法，在拟南芥中表达了靶向芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,tumv)基因组rna的amirna，使转基因拟南芥可以抵抗tumv的侵染。
5.2008年，中国科学院微生物研究所段成国等发现在拟南芥中转基因表达靶向黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,cmv)基因组rna的3’非翻译区(untranslated regions,utr)的非trna结构区的amirna能够抗黄瓜花叶病毒侵染。这说明靶向病毒基因组rna不同部位的amirna可以具有不同的抗病毒活性。因此需要对靶向病毒基因组rna的amirna的抗病毒活性进行筛选。
6.2016年澳大利亚昆士兰大学mitter等设计靶向tswv的n基因和nss基因的amirna，通过在烟草中转基因表达，发现靶向n基因的amirna介导了对tswv的抗性。
7.目前未见利用转基因表达可以靶向smv基因组rna的amirna进行抗smv侵染的相关报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种抗大豆花叶病毒的转基因植物构建方法。
9.本发明构思如下：通过转基因技术表达可以靶向smv基因组的microrna，从而达到抗smv的目的。
10.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种mirna，其是靶向smv的p1编码区的amirna，序列为5
’‑
ugguuaaagaugaucgcucau
‑3’
(seq id no:4)。
11.第二方面，本发明提供编码所述mirna核酸分子。
12.第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限
于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
13.第四方面，本发明提供一种抗大豆花叶病毒的制剂，其有效成分为所述mirna或编码所述mirna核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。
14.第五方面，本发明提供所述mirna或编码所述mirna核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
15.1)用于制备转基因植物；
16.2)用于提高植物抗大豆花叶病毒的能力；
17.3)用于制备抗大豆花叶病毒的制剂或试剂盒。
18.第六方面，本发明提供一种抗大豆花叶病毒的转基因植物构建方法，所述方法包括：构建含有编码所述mirna的dna序列(seq id no:1)的植物表达载体，转化植物，筛选阳性转基因植株。
19.所述表达载体可以是植物双元表达载体，如pcambia1301、pcambia3301。
20.优选地，采用农杆菌介导法转化植物。
21.所述植物包括但不限于本氏烟、大豆。
22.本发明采用表达与大豆花叶病毒同源的短片段amirna来抗smv，具有如下优点：首先microrna特异性强，产生脱靶的可能性更小，由此microrna很短而且唯一。而发卡结构产生的sirna很多，较容易脱靶，影响内源基因的表达。此外microrna在植物体内更稳定，且可在低温下发挥作用。
附图说明
23.图1为本发明较佳实施例中靶向大豆花叶病毒p1编码区的amirna序列设计位点。
24.图2为本发明较佳实施例中将靶向p1编码区的amirna与靶向cp编码区的amirna在本氏烟中进行瞬时表达并染毒后smv的cp蛋白的积累情况。
25.图3为本发明较佳实施例中das
‑
elisa检测接种smv后本氏烟转基因家系1和家系2中的smv含量(**p<0.01,n＝5,单侧t检验)。
26.图4为本发明较佳实施例中das
‑
elisa检测接种smv后本氏烟转基因家系a和家系b中的smv含量(**p<0.01,n＝5,单侧t检验)。
具体实施方式
27.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1靶向smv的amirna的优化设计
28.本发明利用拟南芥mir319a的基因序列为骨架(plant cell 2006may；18(5):1121
‑
33)，选取大豆花叶病毒4278
‑
1分离物(genbank accession#:kt285170.1)、4469
‑
4分离物(genbank accession#:hm590055.1)、byx006分离物(genbank accession#:kp710861.1)、gxqz001分离物(genbank accession#:kx834322.1)、sc001分离物(genbank accession#:kx834320.1)、ne
‑
n1分离物(genbank accession#:kp710869.1)、6202
‑
2分离物(genbank accession#:jf833014.1)、sc3分离物(genbank accession#:jf833013.1)、
sc6分离物(genbank accession#:hm590054.1)、sc15分离物(genbank accession#:mh919386.1)、sx
‑
z分离物(genbank accession#:kp710870.1)、xfq020分离物(genbank accession#:kp710878.1)、xfq008分离物(genbank accession#:kp710873.1)的p1序列的同源区段，设计了靶向smv的p1编码区的amirna，该amirna可以靶向多种smv流行毒株的基因组rna序列(图1)。amirna的序列为5
’‑
ugguuaaagaugaucgcucau
‑3’
。编码该amirna的基因序列如seq id no:1所示。
29.进一步地，smv编码的蛋白还包括外壳蛋白cp。将靶向p1编码区的amirna与靶向cp编码区的amirna(序列为5
’‑
uaucucucaaauuccucagua
‑3’
)在本氏烟(nicotiana benthamiana)叶片中通过农杆菌注射的方式进行瞬时表达，同时接种大豆花叶病毒4278
‑
1分离物的病叶的汁液，6天后对接种叶片中病毒含量进行western blot分析，其中用抗smv病毒cp的多克隆抗体来检测病毒含量。sds
‑
page电泳及考马斯亮蓝染色的植物总蛋白为蛋白上样量对照。图2结果显示，在本氏烟叶片中瞬时表达靶向p1的amirna可以有效抑制smv的复制，而瞬时表达靶向cp的amirna则不能抑制smv的复制。由此表明p1是一个有效的可以抑制smv复制的靶点。
30.实施例2抗大豆花叶病毒的转基因植物的构建
31.将编码所述amirna的dna序列(seq id no:1)克隆到用于转基因的植物双元表达载体中，得到用于本氏烟转化的pcambia1301
‑
smv
‑
p1
‑
amirna和用于大豆转化的pcambia3301
‑
smv
‑
p1
‑
amirna，序列分别如seq id no:2和3所示。
32.1、抗大豆花叶病毒的转基因本氏烟的制备
33.以prs300载体(https://www.addgene.org/22846/)(plant cell 2006may；18(5):1121
‑
33.)为模板，利用引物对mir/a和mir/p1/iv扩增片段1，引物对mir/p1/ii和mir/p1/iii扩增片段2，引物对mir/p1/i和mir/b扩增片段3，将片段1、2、3的pcr片段回收后等比例混合，以引物对mir/a/ncoi/f和mir/b/bsteii/r进行重叠pcr(overlapping pcr)，获得拼接了片段1、2、3的片段，此片段含有序列p1
‑
amirna。利用ncoi和bsteii酶切载体pcambia1301(https://www.snapgene.com/resources/plasmid
‑
files/？set＝plant_vectors&plasmid＝pca mbia1301)得到用于本氏烟转化的pcambia1301
‑
smv
‑
p1
‑
amirna，序列见附件。
34.利用农杆菌介导的遗传转化，获得稳定表达p1
‑
amirna的本氏烟植株，筛选稳定遗传的后代家系。
35.利用摩擦接种法，对本氏烟植株接种感染了大豆花叶病毒4278
‑
1分离物的病叶的汁液，2周后采上位叶片，经das
‑
elisa法检测，转基因本氏烟植株(本氏烟转基因家系1和家系2)的上位叶片中的smv含量显著低于非转基因本氏烟植株(图3)。
36.2、抗大豆花叶病毒的转基因大豆的制备
37.以prs300载体(https://www.addgene.org/22846/)(plant cell 2006may；18(5):1121
‑
33.)为模板，利用引物对mir/a和mir/p1/iv扩增片段1，引物对mir/p1/ii和mir/p1/iii扩增片段2，引物对mir/p1/i和mir/b扩增片段3，将片段1、2、3的pcr片段回收后等比例混合，以引物对mir/a/ncoi/f和mir/b/bsteii/r进行重叠pcr(overlapping pcr)，获得拼接了片段1、2、3的片段，此片段含有序列p1
‑
amirna。利用ncoi和bsteii酶切载体pcambia3301(https://www.snapgene.com/resources/plasmid
‑
files/？set＝plant_
vectors&plasmid＝pca mbia3301)，得到用于大豆转化的pcambia3301
‑
smv
‑
p1
‑
amirna，序列见附件。
38.利用农杆菌介导的遗传转化，获得稳定表达p1
‑
amirna的大豆植株，筛选稳定遗传的后代家系。
39.利用摩擦接种法，对大豆植株接种感染了大豆花叶病毒4278
‑
1分离物的病叶的汁液，2周后采上位叶片，经das
‑
elisa法检测，转基因大豆植株的上位叶片中的smv含量显著低于非转基因大豆植株(图4)。
40.本实施例中使用的引物序列如下(5
′‑3′
)：
41.mir/a：ctgcaaggcgattaagttgggtaac
42.mir/b：gcggataacaatttcacacaggaaacag
43.mir/p1/i：gatggttaaagatgatcgctcattctctcttttgtattcc
44.mir/p1/ii：gaatgagcgatcatctttaaccatcaaagagaatcaatga
45.mir/p1/iii：gaatcagcgatcatcattaaccttcacaggtcgtgatatg
46.mir/p1/iv：gaaggttaatgatgatcgctgattctacatatatattcct
47.mir/a/ncoi/f：ctgcaaggcgattaagttgggtaac
48.mir/b/bsteii/r：gcggataacaatttcacacaggaaacag
49.此前关于amirna的研究证明靶向植物病毒基因组的不同位点的amirna可能会起到抗病毒的效果，但也有证据显示某些位点可能不会抗病毒。本发明优选了靶向smv的p1编码区的amirna，在转化了此载体的烟草和大豆中可以达到抗病毒的效果。与以往表达发卡结构沉默病毒基因或寄主基因的策略不同，本发明采取了表达amirna的策略进行转基因抗病毒。
50.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。