一种能够准确检测甘蔗ScHAK11基因表达量的引物组及试剂盒的制作方法

一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的引物组及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的引物组及试剂盒。


背景技术：

2.甘蔗属于高光效的c4类作物，具有生长周期长、生物产量高和养分需求量大的特点，因此保持充足的养分供给是实现甘蔗高产的关键。在众多植物必需的营养元素中，甘蔗对钾素的需求量最高，属于喜钾作物，钾在甘蔗的生长发育中起着重要的作用。高亲和性钾转运体基因(hak)在植物吸收、利用钾素过程中有十分重要的作用，分析甘蔗sc hak11基因的组织表达特性，对进一步解析sc hak11基因在甘蔗钾素利用和hak基因的发掘及育种利用提供实验依据。
3.hak11基因属于高亲和性钾转运体家族中的一员，是一种位于质膜上的转运蛋白，包含14个跨膜结构域和一个非信号肽结构域。甘蔗中sc hak11基因调控的报道较少，其表达模式尚不清楚。因此需要研发一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的方法，以便于其在各组织研究中的应用。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决上述技术问题，提供一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的引物组及试剂盒。
5.本发明的技术方案为：一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的引物组，包括一对特异性引物，所述引物对为sc hak11_f和sc hak11_r，其基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
6.一种能够准确检测甘蔗sc hak11基因表达量的试剂盒，包括逆转录反应液、pcr反应液，所述逆转录反应液包括5
×
hiscrip
®ⅱ
qrt supermix、模板 rna、rnase free ddh2o；所述pcr反应液包括sybr green mix、引物对、cdna，所述引物对为sc hak11_f和sc hak11_r，其基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
7.作为优选，所述逆转录反应液具体为：5
×
hiscrip
®ⅱ
qrt supermix 2ul、模板 rna 700ng，补rnase free ddh2o至15ul；所述pcr反应液具体为：sybr green mix 7ul、sc hak11_f 0.5ul、sc hak11_r 0.5ul、cdna 8ul。
8.作为优选，在pcr反应体系中引物对sc hak11_f和sc hak11_r对应的的摩尔浓度均为10umol/l。
9.作为优选，所述逆转录反应液的反应程序为25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min。
10.作为优选，所述pcr反应液的反应程序为95℃预变性10 min，1个循环；95℃变性10 sec，1个循环；退火：60℃，30sec，40个循环；95℃，15 sec，40个循环；60℃，60 sec，40个循环；溶解曲线采集：95℃，30 sec，40个循环；60℃，15 sec，1个循环。
11.由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明结合甘蔗属性且通过试验设计出引物对sc hak11_f和sc hak11_r，并通过该引物对设计出检测甘蔗sc hak11基因表达量的试剂盒，通过该试剂盒检测甘蔗的叶片、根和茎中sc hak11 的表达量，他们均有表达且表达量不同，说明甘蔗在不同的发育阶段的表达量各不相同，试验结果表明，sc hak11在甘蔗的生长发育中起重要作用。
附图说明
12.图1为25s基因扩增曲线图；图2为sc hak11基因扩增曲线图；图3为25s基因扩增溶解图；图4为sc hak11基因扩增溶解图；图5为不同样品rna电泳检测图；图6为甘蔗sc hak11基因在根部中表达量的柱图；图7为甘蔗sc hak11基因在根部中表达量的柱图；图8为甘蔗sc hak11基因在茎部中表达量的柱图；图9为甘蔗sc hak11基因在叶部中表达量的柱图；注：图5中1-3分别表示苗期根茎叶样品中rna电泳检测图；4-6分别表示伸长期根茎叶样品中rna电泳检测图；8-9分别表示成熟期根茎叶样品中rna电泳检测图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.1、实验仪器仪器名称型号生产厂家漩涡振荡器ql-861江苏省海门市麒麟医用仪器洁净工作台sw-cj-2d苏州净化设备有限公司台式高速冷冻离心机neofuge13r上海力申科学仪器有限公司pcr仪edc-810北京东胜创新生物科技有限公司移液器 eppendorfco.,germany微量分光光度计nanodrop5000thermousa电泳仪minipro300vpowermajorscience.,usa电泳槽labnetsubsystem70labnetincusa荧光定量pcr仪7900美国appliedbiosystems2、实验试剂
3、供试材料：甘蔗根、茎、叶；4、实验方法4.1 提取rna（1）供试材料经液氮研磨后，收集≤100mg 植物样品至离心管，加入 500
µ
l rcl buffer（裂解液），涡旋混匀；（2）55℃水浴 1-3 分钟，10,000
×
g 室温离心 5 min；（3）将 gdna filter 过滤柱套入 2ml 收集管中，转移上清液至 gdna filter 过滤柱，室温 14,000xg 离心 2 分钟；（4）往滤液加入等体积的 rcb buffer，涡旋混匀 20s；（5）将 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱套入 2ml 收集管中，转移一半混合液（＜700
µ
l）至hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱上，12,000
×
g 室温离心 1min，弃掉滤液；（6）重复步骤（5），直至将所有混合液转移过柱；（7）将 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱套入同一 2ml 收集管中，往 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱加入400
µ
l rwf wash buffer ，10,000
×
g 室温离心 30s，弃掉滤液；（8）将 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱套入同一 2ml 收集管中，往 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱加入 500
µ
l rna wash buffer ii（提前使用无水乙醇稀释），10,000
×
g 室温离心 30s，弃掉滤液；重复2次；（9）将 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱套入同一 2ml 收集管中，室温 10,000xg 离心 2min，甩干 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱基质；（10）将 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱套在一个新的 1.5ml 离心管中，取 50-100
µ
l depc水，准确添加在 hibind
®ꢀ
rna mini 结合柱膜中央，常温放置 2min，10,000
×
g室温离心 1min，洗脱 rna；（11）使用超微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测 rna 纯度和完整性。
15.4.2 逆转录（1）配置第一链 cdna 合成反应液
在rnasefree离心管中配置如下混合液:rnasefreeddh2oto15ul5
×
hiscrip
®ⅱ
qrtsupermix2ul模板rnatotalrna：700ng（2）进行逆转录反应产物可立即用于rcpr反应，或在-20℃保持。
16.5、设计引物、合成和调试设计如下表中的引物引物信息本次实验筛选设计如上引物，其中引物对schak11_f和schak11_r对应的的摩尔浓度均为10umol/l，引物对25s_f和25s_r对应的的摩尔浓度均为10umol/l。qpcr（sybrgreeni）引物调试过程中，在检测基因的表达水平变化时常用25s基因来做参照物，25s基因和schak11基因扩增曲线图分别将图1和图2，25s基因和schak11基因溶解曲线图分别将图3和图4，从图1-图4中可以看出这些引物在60℃时溶解曲线单峰，表明无非特异扩增，可用于后续实验。
17.6、荧光定量pcr反应体系和程序反应体系如下：sybrgreeni（荧光染料）使用试剂：powerqpcrpremix（预混料）（generay，gk8020sybrgreen（16ul）96孔板：sybrgreenmix7ulprimer-f0.5ulprimer-r0.5ulcdna8ul反应程序如下：
7、8、实验结果与分析7.1 rna检测a、测定样品在260nm和280nm的吸收值确定rna的质量（仪器nd5000超微量紫外可见分光光度仪），不同样品od值测定结果见下表1；b、进行琼脂糖凝胶电泳，确定抽提rna的完整性和dna的污染情况，不同样品rna电泳图谱，见图5；表1甘蔗不同部位不同生长时期的rna浓度7.2 schak11基因在甘蔗根部中不同时期的表达差异性分析以不同时期甘蔗根部为材料，检测schak11基因在根系中的相对表达量，结果见图6。
18.不同生长时期根部cp值和相对表达量见表2；表2不同生长时期根部ct和相对表达量从图6和表2中可以看出，在伸长期中根部表达量最高，其次是成熟期，苗期相对表达量较低，伸长期的表达量是苗期2倍左右。
19.7.3 schak11基因在甘蔗茎部中不同时期的表达差异性分析以不同时期甘蔗茎为材料，检测schak11基因在茎中的相对表达量，结果见图7；不同生长时期根部cp值和相对表达量见表3；
表3不同生长时期茎部ct和相对表达量从图7和表3中可以看出，在成熟期中茎表达量最高，苗期与成熟期的相差不大，伸长期相对表达量较低，苗期茎的表达量是伸长期的6倍。
20.7.4 schak11基因在叶片中不同时期的表达差异性分析以不同时期甘蔗叶片为材料，检测schak11基因在叶片中的相对表达量，结果见图8；不同生长时期根部cp值和相对表达量见表4；表4不同生长时期叶ct值和相对表达量从图8和表4中可以看出，在成熟期中叶片表达量最高，其次是伸长期，苗期相对表达量较低。
21.7.5 schak11基因在甘蔗不同生长时期不同部位中表达差异性分析以甘蔗不同时期的根、茎、叶为材料，检测schak11基因在不同时期不同部位中的相对表达量，结果见图9；从图9可以看出，schak11基因在不同时期不同部位都有表达，hak基因参与植物的生长发育过程，但是hak基因在不同组织中是存在差异性。
22.综上所述，在同一个时期中，甘蔗的根、茎、叶表达量都不一样，不同组织的表达有明显的区别，表明不同部位中schak11基因的表达差异影响钾离子的吸收从而调控甘蔗生长发育。而且在不同时期，schak11基因在同一部位的表达量也不一样，说明，schak11可能在甘蔗的生长发育中起重要作用。
23.上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。