乙烯形成酶基因VdEFE在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用的制作方法

乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用
技术领域
1.本发明属于功能基因技术领域，具体涉及乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用。


背景技术：

2.1984年，首次报道大丽轮枝菌(verticillium dahliae kleb)在生长发育及与寄主互作的过程中具有产生乙烯的能力(fukuda et al.,1984)。2016年，张婷等发现大丽轮枝菌强、弱致病力菌株都能产生乙烯，且强致病力菌株产生的乙烯含量明显高于弱致病力菌株(张婷等，2016)。在基因功能研究的过程中，也发现有些基因与乙烯的产生存在联系。大丽轮枝菌中vgb和vdpkac1的基因缺失突变体不仅能导致病原菌致病力降低，微菌核减少，还导致乙烯生物合成量的减少(tzima et al.,2012；tzima et al.,2010)。2017年，zhang ting等发现大丽轮枝菌黑色素合成相关基因vdpks1，该基因敲除后，大丽轮枝菌致病力下降，不产生黑色素，并且降低了vgb和vdpkac1的基因表达，进一步实验发现vdpks1敲除后降低乙烯生物量合成(zhang et al.,2017)。2012年，郭惠珊课题组发现vdnlp家族基因编码坏死和乙烯诱导蛋白，其中vdnlp1和vdnlp2编码的蛋白也具有激发子活性，可以激活乙烯生物合成途径和依赖sa、ja的防御信号通路(santhanam et al.,2013；zhou et al.,2012)。2019年，tsolakidou发现vdaccd基因，该基因编码acc转氨酶(acc deaminase)，可以通过该酶将乙烯合成前体acc进行消化，该基因缺失突变体中acc含量增加，毒力降低，而乙烯的产生量差异不明显，提出acc充当信号分子，参与大丽轮枝菌与植物的互作(tsolakidou et al.,2019)。然而目前并未明确大丽轮枝菌中乙烯形成酶基因vdefe与乙烯合成途径之间是否有关。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乙烯形成酶基因vdefe的新应用，具体vdefe在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用。
4.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生物合成中的应用。
5.优选的，所述生物合成包括乙烯合成和琥珀酸合成。
6.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe下调大丽轮枝菌乙烯形成相关基因表达量中的应用。
7.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在维持大丽轮枝菌的生长发育中的应用。
8.优选的，所述生长发育包括生长速度和繁殖体产量。
9.优选的，所述繁殖体包括微菌核和分生孢子。
10.优选的，所述乙烯形成酶基因vdefe的核苷酸序列如seq id no:1所示。
11.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生物合成中的应用。为了明确vdefe基因敲除是否影响大丽轮枝菌产生乙烯的能力，以野生型v592为对照，对vdefe基因
敲除突变体进行了乙烯含量的测定，结果表明，敲除体δvdefe产生的乙烯明显低于野生型v592，仅为v592的49.01％。互补体ec-vdefe的乙烯含量恢复与v592无明显差异，而过表达突变体oe-vdefe产生的乙烯明显高于野生型v592和敲除体δvdefe，乙烯含量分别是v592和vdefe的1.73倍和3.53倍。通过在培养基中添加了efe通路的唯一底物2-氧化戊二酸(oxo)，结果表明oxo能使所有菌株产生更多的乙烯，并且在oxo诱导下，野生型v592的乙烯含量显著高于敲除体δvdefe的乙烯含量。说明vdefe基因与乙烯形成相关，并且是efe途径中的关键基因。敲除体δvdefe的琥珀酸含量与野生型v592和互补体ec-vdefe无明显差异，而过表达体oe-vdefe的琥珀酸含量明显高于野生型v592和其他突变体，约为野生型v592的1.5倍，这说明vdefe基因与大丽轮枝菌琥珀酸形成相关，vdefe基因是乙烯形成酶基因。
12.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在维持大丽轮枝菌的生长发育中的应用。试验证明，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2的生长速率较野生型明显下降。互补体ec-vdefe-1和ec-vdefe-2的生长速率有所恢复，与野生型差异不明显，这说明vdefe基因的敲除影响大丽轮枝菌的生长速率。微菌核产量测定，野生型v592可以产生大量的黑色微菌核，而敲除体δvdefe-1和δvdefe-2形成的黑色微菌核明显少于野生型v592；互补体ecvdefe-1和ecvdefe-2与野生型v592形成的微菌核数量得到明显恢复，这说明vdefe基因对大丽轮枝菌微菌核的形成有一定影响。产分生孢子量测定结果表明，与野生型v592和互补菌株ecvdefe-1、ecvdefe-2相比，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2的产孢量显著减少，这说明vdefe基因与大丽轮枝菌产孢能力密切相关。
附图说明
13.图1为vdefe与其它微生物基于乙烯形成酶氨基酸序列构建的系统进化树；
14.图2为vdefe基因敲除体、互补体和过表达体的验证；图2a：vdefe敲除载体构建策略示意图；图2b：基因组水平检测vdefe基因的敲除；dl2000为marker，ck为阴性对照；图2c：利用rt-qpcr对vdefe基因的转录水平进行验证；**表示经duncan检验与v592相比差异显著(p《0.01)；图2d：利用rt-qpcr对vdefe基因的过表达体转录水平进行确定，不同小写字母表示经duncan检验差异显著(p《0.05)；
15.图3为vdefe突变体在非诱导条件和底物oxo诱导条件下乙烯含量的测定；其中，不同小写字母表示在查氏培养基处理中按tukey检验差异显著(p《0.05)。不同大写字母表示在添加oxo的查氏培养基处理中经tukey检验差异显著(p《0.05)；**表示添加oxo处理与非添加处理在0.01概率水平上具有显著性差异(p《0.01)；误差线表示3次重复计算的标准误差；
16.图4为vdefe基因突变体琥珀酸含量的检测；不同小写字母表示按tukey检验差异显著(p《0.05)；
17.图5为乙烯形成相关基因在野生型菌株v592和vdefe基因敲除体中的转录水平；其中，*和**分别在0.05(p《0.05)、0.01(p《0.01)概率水平上显著高于于野生型菌株v592；
18.图6为野生型v592，vdefe敲除体菌株和互补体菌株的表型特征；
19.图7为vdefe基因敲除体的微菌核形成；其中图7a：所有菌株在非营养条件下的微菌核形成；图7b：所有菌株产生的微菌核湿重和干重，采用dunnett法进行显著性检验；**在0.01(p《0.01)概率水平上显著低于野生型菌株v592；
20.图8为vdefe基因突变体的孢子产生及萌发；其中图8a：vdefe基因突变体孢子萌发率测定；图8b：vdefe基因敲除体菌株产孢量测定，*和**分别在0.05(p《0.05)、0.01(p《0.01)概率水平上显著低于于野生型菌株v592；图8c：vdefe基因突变体的产孢梗形态观察；
21.图9为vdefe基因敲除体、互补体及过表达对大丽轮枝菌致病力的影响；其中图9a为野生型菌株v592、vdefe基因敲除体、互补体及过表达体接种棉花后的症状；图9b：棉花在非诱导条件下发病后的病情指数。
具体实施方式
22.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生物合成中的应用。
23.在本发明中，所述生物合成优选包括乙烯合成和琥珀酸合成。试验证明，乙烯形成酶基因vdefe不仅参与乙烯合成，而且会对乙烯合成相关基因的表达有影响。乙烯形成酶基因vdefe的缺失可上调大丽轮枝菌乙烯形成相关基因表达量，可见乙烯形成酶基因vdefe与其他乙烯形成相关基因的表达关系存在拮抗作用。乙烯形成相关基因优选包括vdnlp2、vdpks1、vdpkac1和vgb基因。
24.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe在维持大丽轮枝菌的生长发育中的应用。
25.在本发明中，所述生长发育优选包括生长速度和繁殖体产量。试验证明，乙烯形成酶基因vdefe的缺失降低大丽轮枝菌生长速度，说明vdefe具有调控大丽轮枝菌生长速度的作用；而vdefe基因敲除不影响大丽轮枝菌在pda培养基上的菌落形态。所述繁殖体优选包括微菌核和分生孢子。试验证明，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2形成的黑色微菌核明显少于野生型v592。互补体ec-vdefe-1和ec-vdefe-2与野生型v592形成的微菌核数量得到明显恢复；vdefe基因敲除具有降低微菌核形成的作用。产孢量方面，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2的产孢量仅为野生型v592的75.01％和74.56％，互补菌株ec-vdefe-1，ec-vdefe-2恢复至野生型水平，分别是v592产孢量的98.67％和102.68％，这说明vdefe基因与大丽轮枝菌产孢密切相关。同时敲除突变体的分生孢子梗明显减少，几乎不产生轮状分枝，互补体菌株分生孢子梗形态与野生型无明显差异，这说明vdefe基因敲除突变体产孢量下降可能与其产孢梗减少有关。此外，与野生型v592和互补体ec-vdefe相比，敲除体δvdefe分生孢子萌发率有显著提高，而过表达体oe-vdefe的萌发率在所有菌株中最低，这说明vdefe基因与大丽轮枝菌孢子萌发有关。
26.本发明提供了乙烯形成酶基因vdefe或乙烯在大丽轮枝菌致病力中的应用。试验证明，接种野生型、敲除体、互补体的棉苗发病情况更加严重，甚至出现整株坏死的现象，病情指数均达到95以上，而接种过表达体的棉苗引起的病害症状明显减轻，病情指数仅为55.21，表明vdefe基因过表达导致大丽轮枝菌致病力下降。这说明vdefe基因参与大丽轮枝菌的致病过程，并且推测低浓度乙烯可以增强大丽轮枝菌的致病力，高浓度的乙烯抑制大丽轮枝菌的致病力。
27.下面结合实施例对本发明提供的乙烯形成酶基因vdefe在大丽轮枝菌生长发育、致病力和乙烯合成中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
28.材料试剂来源说明
29.1供试材料和引物
30.大丽轮枝菌强致病落叶型菌株v592(参见f gao,zhou b j,li gy,et al.a glutamic acid-rich protein identified in verticillium dahliae from an insertional mutagenesis affects microsclerotial formation and pathogenicity[j].plos one,2010,5.0.)由本实验室分离自新疆棉花，经过单孢纯化后于-80℃超低温冰箱进行保存。供试棉花品种为军棉一号(gossypium hirsutum linn.cv.junmianno.1)。t载体为pmd19-t载体(takara)；敲除载体pgko-hpt(sheng w,xing h,hua c,et al.an improved single-step cloning strategy simplifies the agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(atmt)-based gene disruption method inverticillium dahliae[j].phytopathology,2016,106(6):645.)为中科院微生物所郭慧珊研究员惠赠；互补载体及过表达载体p1300-neo-olic-cas9-ttrpc，该载体存在kan的抗性基因作为筛选标记，包含真菌启动子olic和终止子ttrpc。大肠杆菌dh5α，农杆菌eha-105由本实验室保存。
[0031]
本章所用引物设计使用primerpremier 6.0和snapgene进行，由通用生物工程(安徽)股份有限公司合成。
[0032]
2常规试剂、所用试剂盒及生物信息学使用软件
[0033]
dna提取采用试剂盒(bioflux)；凝胶回收试剂盒(omega)；普通pcr使用2
×
taq pcr mastermix购自北京天根生物公司；同源臂扩增利用i-5
tm2×
high-fidelity master mix高保真dna聚合酶购自于北京擎科tsingke新业生物技术有限公司；in-fusion克隆用到的clonexpress ii one step cloning kit和clonexpress multis one step cloning kit购自vazyme公司；实验所用限制性内切酶：pac i，xba i，bamhi及缓冲液购自于takara公司。常规试剂都是国产分析纯。
[0034]
测序结果利用danman和snapgene做比对分析。利用mega 5.0对氨基酸序列进行进化树分析。利用interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)对保守结构域进行预测。
[0035]
3培养基和试剂配制
[0036]
大丽轮枝菌v592和vdefe基因突变体的分离及生物学特性测定的培养基利用patato dextroseagar(pda)固体培养基；收集大丽轮枝菌孢子悬浮液和菌丝利用czapek液体培养基，细菌扩繁利用luria-bertani(lb)液体培养基，atmt转化大丽轮枝菌分生孢子使用imas液体培养基：imas培养基中添加40mm的乙酰丁香酮。
[0037]
实验用到抗生素及浓度如下：
[0038]
头孢霉素(cef)的使用浓度为200μg/ml，羧苄青霉素(car)的使用浓度为200μg/ml，潮霉素(hyg b)的使用浓度为100μg/ml，5-氟脱氧尿苷(f2du)的使用浓度是20μg/ml，遗传霉素(g418)的使用浓度是50μg/ml，特美汀(tim)的使用浓度是200μg/ml，氨苄青霉素(amp)的使用浓度为50μg/ml，卡那霉素(kan)的使用浓度为100μg/ml，利福平(rif)的使用浓度为50μg/ml，mes(2-n-玛琳乙磺酸)的使用浓度为40mmol/l，as(乙酰丁香酮)的使用浓度为200mmol/l。以上抗生素类的试剂均购自上海生物工程技术服务有限公司。
[0039]
实施例1
[0040]
1.过表达载体、敲除载体和互补载体的构建方法
[0041]
1.1大丽轮枝菌的培养及基因组核酸的提取
[0042]
大丽轮枝菌v592的培养：将-80℃保存的大丽轮枝菌分生孢子悬浮液，用移液器吸
取200ml的菌液，均匀打在含有kan的pda固体培养基上，22℃，黑暗培养5d，将新长出的菌丝体在转到新的pda(包含kan)平板上，22℃，黑暗培养5d。
[0043]
dna提取：参考宋雯等(2019)的方法(宋雯等，2019)，利用低温研磨的方式将v592的组织和细胞彻底破碎。参照dna提取试剂盒说明书提取基因组dna。
[0044]
rna提取：使用无酶的离心管和吸头，研钵和研棒需用depc水处理后，在121℃高压灭菌锅中灭菌2次，并烘干其残留的水分，使用前所需工具需用少量液氮或置于4℃冰箱预冷。实验中所用的trizol reagent、三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇和75％乙醇应在4℃冰箱中预冷后使用。利用trizol(qiagen)法提取大丽轮枝菌v592的总rna。按照反转录试剂盒(takara)说明书步骤将大丽轮枝菌v592的总rna反转录成cdna。
[0045]
1.2vdefe基因的克隆
[0046]
以强致病力落叶型菌株v592基因组dna为模板，利用引物对vdefe-f/vdefe-r扩增vdefe基因全长。具体操作如下：pcr反应体系(20μl体系)：向pcr管中加入10μl 2
×
taq pcr mastermix，0.5μl vdefe-f，0.5μl vdefe-r，1μl模板dna，用ddh2o补足20μl，按照如下pcr反应程序进行扩增：94℃预变性3min(1个循环)，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸90s，变性至延伸阶段循环30次，72℃恒温10min，20℃保持2min反应终止。
[0047]
取3～5mlpcr产物在加入goldenview的1％琼脂糖凝胶电泳中进行凝胶电泳检测，于紫外凝胶成像仪下观察并拍照。选用正确条带的pcr产物按照omega生物公司凝胶回收试剂盒进行pcr产物纯化，将pcr纯化产物连接至测序载体pmd 19-t上。通过热激转化，将重组载体导入大肠杆菌dh5α中，利用麦康凯培养基筛选出阳性克隆，通过碱裂解法获得阳性克隆的质粒，以m13f/m13r为引物进行测序，获得vdefe基因全长序列。
[0048]
pcr产物纯化：参照omega生物公司凝胶回收说明书，稍作修改：
①
加入与pcr产物等量的binding buffer；
②
混匀后加入吸附柱中，每次700ml；
③
将吸附柱置于离心机中8,000r/min，常温离心30s-60s；
④
弃废液，加入650ml spw washbuffer，8,000r/min，常温离心30s-60s；
⑤
重复步骤
④
，12,000r/min常温离心2min；
⑥
取出吸附柱，室温放置2min，移至新的无菌1.5ml离心管中；
⑦
向吸附柱中加入30ml的elution buffer，静置10min；
⑧
12,000r/min常温离心2min；
⑨
纯化产物浓度测定。
[0049]
热激转化：
①
取出-80℃保存的dh5α感受态细胞冰上解冻10min；
②
向感受态细胞中加入1ml的连接产物，轻柔混匀，冰浴20min；
③
42℃水浴1min热激；
④
热激后迅速置于冰上，冰浴3～5min；
⑤
向离心管中加入500ml的lb液体培养基；
⑥
置于摇床中，37℃，200r/min，震荡培养1h；
⑦
取100～200ml的菌液，均匀打在含有抗生素的平板上；
⑧
放入37℃，黑暗培养12～16h。
[0050]
碱裂解法：
①
取1.5ml菌液，装于1.5ml离心管中，12,000r/min常温离心2min，弃上清；
②
加入200ml的p1，重悬沉淀；
③
加入200ml的p2，上下颠倒混匀；
④
加入200ml的p3，上下颠倒，出现絮状沉淀；
⑤
置于冰上，冰浴10min，12,000r/min常温离心10min；
⑥
取600ml上清液至新的1.5ml离心管中，加入500ml异丙醇，上下颠倒混匀，12,000r/min常温离心10min，弃上清；
⑦
加入650ml的75％乙醇，洗涤沉淀，12,000r/min常温离心2～5min，除去所有液体；
⑧
加入50ml的ddh2o，-20℃保存。
[0051]
1.3敲除载体的获得
[0052]
1.3.1vdefe基因上下同源臂扩增
[0053]
利用ncbi公布的大丽轮枝菌全基因组序列，以vdefe基因上下游各1,000bp左右的片段为同源臂，各设计2对引物(引物序列见表1)。以大丽轮枝菌强制病菌株v592的基因组dna为模板。利用i-5
tm2×
high-fidelity mastermix高保真dna聚合酶扩增vdefe基因的上下游同源臂，利用引物vdefe-up-f/vdefe-up-r扩增vdefe基因的上游同源臂约1249bp，利用引物vdefe-dn-f/vdefe-dn-r扩增vdefe基因的下游同源臂约990bp。将pcr产物按照1.2中pcr产物纯化的步骤纯化目的基因片段并测定浓度。
[0054]
1.3.2敲除载体线性化
[0055]
使用paci限制性内切酶进行单酶切。具体步骤如下：取1μlpaci，10μlpgko-hpt的质粒，5μl cutsmart，用ddh2o补足50μl，于37℃水浴锅中酶切12～16h，凝胶电泳检测，按照1.5中pcr产物纯化的步骤纯化目的基因片段并测定浓度。
[0056]
1.3.3in-fusion克隆
[0057]
将纯化后的同源臂片段和线性化载体按照以下体系连接：取0.5μl的上游同源臂片段，0.5μl的下游同源臂片段，5μl线性化载体，1μl exnase multi，2μl ce multi buffer，用ddh2o补足10μl，于37℃水浴锅中连接30min，将连接产物与dh5α感受态热激转化，在lb kan的平板上筛选，选择阳性克隆，提取质粒，获得敲除载体pgko-hpt::vdefe。
[0058]
1.4互补载体和过表达载体的获得
[0059]
方法如1.2，以强致病力落叶型菌株v592基因组dna为模板，利用i-5
tm2×
high-fidelity master mix高保真dna聚合酶和引物vdefecds-f/vdefecds-r扩增vdefe基因全长(引物序列见表2-1)，利用纯化试剂盒纯化pcr产物；使用限制性内切酶xba i、bamhi对互补载体进行双酶切，利用clonexpress ii one step cloning kit将纯化后的同源臂片段和线性化载体连接，将连接产物与dh5α感受态热激转化，在lb kan的平板上筛选，选择阳性克隆，提取质粒，获得互补载体和过表达载体p1300-neo-olic-vdefe-ttrpc。
[0060]
表1供试引物
[0061][0062]
1.5电击转化农杆菌
[0063]
①
取出-80℃保存的农杆菌eha-105感受态细胞冰上解冻10min；
②
加入1μl重组质
粒，冰浴20min，同时将电击杯置于冰上预冷；
③
将混合物加入到预冷的电击杯中，擦拭电击杯外壁，1800v电击5ms；
④
向电击杯中加入500ml的lb无抗液体培养基，混匀后移至新的1.5ml的离心管中；
⑤
28℃，150～200r/min，振荡培养1h；
⑥
吸取菌液200mμl，涂布于固体lb kan rif平板上；
⑦
放入28℃，黑暗培养培养2～3d；
⑧
筛选出的阳性转化子加入5μllb kan rif液体培养基，于28℃、150r/min摇培16h。
[0064]
1.6农杆菌介导的大丽轮枝菌分生孢子的遗传转化
[0065]
1.6.1大丽轮枝菌分生孢子的收集
[0066]
取数块直径为5mm的新鲜菌块(接种菌株的pda培养基)接种于czapek-dox液体培养基中，26℃，200r/min，黑暗培养3d。将菌液用4层灭菌纱布过滤至50ml离心管中，8000r/min，4℃离心10min，弃上清，再用20ml超纯水重新悬浮3次，离心弃去上清；用10％的甘油重新悬浮起孢子，并将孢子浓度调至1
×
108cfu/ml，分装在2ml的ep管中，用液氮速冻后，置于-80℃冰箱中保存。
[0067]
1.6.2农杆菌介导的大丽轮枝菌分生孢子的遗传转化(atmt转化)
[0068]
①
取200μl的电击后农杆菌菌液接种于10ml imas液体培养基中；
②
28℃，150r/min，振荡培养12h，至od
600
值约为0.5；
③
提前将收集好的大丽轮枝菌分生孢子放在冰上解冻，将大丽轮枝菌的分生孢子和农杆菌按照1:1的比例混合均匀；
④
将混合好的菌液于28℃，200r/min，振荡培养10min；
⑤
取200μl的菌液均匀涂布在带滤纸的imas固体培养基上，22℃，黑暗培养2d；
⑥
揭下滤纸，平铺于pda car cef 5f2u hyb固体培养基上(敲除载体)或pda car cef timetin g418固体培养基上(互补载体)，置于22℃，黑暗培养7d；
⑦
挑取平板上白色斑点，在pda car cef 5f2u hyb固体培养基(敲除载体)或pda car cef g418固体培养基上(互补载体)划线，置于22℃，黑暗培养7d；
⑧
挑取转化子的菌丝或微菌核，在pda kan的固体培养基上划线，置于22℃，黑暗培养7d；
⑨
对获得的转化子进行筛选。
[0069]
1.7vdefe敲除体的筛选及过表达体的获得
[0070]
根据1.2的方法提取各转化子的dna，并用引物vdefe-f和vdefe-r扩增转化子中目标基因(引物序列见表1)，检测其是否被成功敲除或互补；同时用引物hph-f和hph-r扩增潮霉素抗性基因，检测敲除转化子中潮霉素抗性基因是否替换了目的基因。根据1.1所述方法提取野生型v592及突变体菌株的总rna并反转录为cdna，用引物vdefe-q-f和vdefe-q-r对目标基因进行实时荧光定量pcr分析，检测目标基因在转录水平的表达，所用内参基因为β-tubulin(dq266153)基因。相对定量采用2
‑△△
ct
方法，用spss进行数据统计分析。
[0071]
2.结果
[0072]
2.1大丽轮枝菌vdefe基因的克隆及序列分析
[0073]
以大丽轮枝菌强致病力菌株v592为模板，用引物对vdefe-f/vdefe-r扩增获得vdefe基因全长为1337bp，序列分析表明，vdefe基因含有4个外显子和3个内含子。对vdefe基因保守结构域进行预测，vdefe基因编码的氨基酸在37-364位，存在一个属于pcbc超家族中的异青霉素n合酶及双加氧酶结构域(isopenicillinn synthase andrelated dioxygenases，ipns)；在46-156位存在一个diox_n结构域，该结构域是2-氧戊二酸/铁(ii)依赖双加氧酶活性蛋白的高度保守的n端区域(hagel and facchini,2010)；在199-313位存在一个氧戊二酸/铁依赖型双加氧酶结构域(oxoglutarate/iron-dependent dioxygenase，fe(ii)2og dioxygenase)。在植物基因功能研究中发现，diox_n结构域和fe
(ii)2og dioxygenase结构域是acc氧化酶(aco)合成乙烯的关键结构域(houben andvan de poel,2019)。因此上述结果表明，vdefe基因可能与乙烯形成相关。
[0074]
对vdefe基因编码的氨基酸序列进行比对分析，vdefe氨基酸序列与大丽轮枝菌vdls.17(v.dahliae vdls.17)中的同源蛋白vdefe的氨基酸序列相似性为99.47％，与其他真菌和细菌中同源蛋白也具有较高的氨基酸序列相似性，如与黑白轮枝菌(v.alfalfaevams.102)具有92.99％相似性，与尖孢镰刀菌(f.oxysporum)具有70.20％相似性，与禾生炭疽菌(colletotrichum graminicola)具有60.19％的相似性，与指状青霉(p.digitatumpd1)具有62.34％的相似性，与棒曲霉(aspergillus clavatus)具有61.54％的相似性，与链格孢菌(alternaria alternata)具有52.46％的相似性，与丁香假单胞(pseudomonassyringae)具有44.90％的相似性。
[0075]
基于efe蛋白氨基酸序列构建系统进化树，结果如图1所示，真菌和细菌分别形成2个大的进化分支，真菌又进一步分为4个分支，链格孢真菌形成一个进化分支，青霉属真菌形成一个进化分支，炭疽菌和稻瘟菌等其他一些真菌形成一个进化分支，轮枝菌属和镰孢菌属等土传真菌形成一个进化分支，表明vdefe在进化上与土传真菌亲缘关系最近。
[0076]
2.2vdefe敲除体及过表达体的获得及鉴定
[0077]
利用同源重组原理(图2a)，将敲除载体与野生型v592通过atmt遗传转化得到的2个敲除体菌株δvdefe-1和δvdefe-2，提取基因组dna，进行同源重组转化子的鉴定。从dna水平进行测定，分别利用2对引物vdefe-f/vdefe-r和hph-f/hph-r对突变体dna进行pcr扩增，与野生型菌株相比，敲除突变体只扩增出600bp大小的hph基因片段，而不能扩增出1337bp大小的vdefe基因，说明该基因成功被hph基因替换(图2b)。互补体菌株ec-vdefe-1和ec-vdefe-2，可以扩增出1337bp大小的vdefe基因，说明该基因互补成功(图2b)。对敲除突变体和互补体进行转录水平测定，rt-qpcr结果显示，敲除突变体δvdefe-1和δvdefe-2的转录水平几乎为0，互补突变体ecvdefe-1和ecvdefe-2的转录水平恢复至v592的95.30％和95.95％(图2c)。将过表达载体与野生型v592通过atmt遗传转化得到过表达体，通过rt-qpcr分析(图2d)，选择表达量较高的2个过表达突变体，命名为oevdefe-1和oevdefe-2。上述结果说明，vdefe基因成功被敲除，获得敲除突变体δvdefe-1和δvdefe-2，对vdefe基因进行互补和过表达，获得互补体ecvdefe-1和ecvdefe-2，过表达体oevdefe-1和oevdefe-2。
[0078]
实施例2
[0079]
乙烯含量测定
[0080]
为了测定vdefe基因突变体和野生型v592的乙烯产量，将浓度为1.0
×
108cfu/ml的分生孢子悬液1ml打在含有100ml查氏液体培养基的250ml注射玻璃瓶中，26℃，200r/min，黑暗摇培9d。乙烯测定前，在超净工作台中将注射玻璃瓶胶塞打开5min，以除去产生的乙烯，然后用橡胶塞密封；底物诱导实验中，在超净工作台中将注射玻璃瓶胶塞打开5min，加入20mm的oxo，然后用橡胶塞密封。培养3～4h后，用注射器收集顶空空气。
[0081]
乙烯标准气体购自上海伟创标准气体分析有限公司。使用7890b安捷伦气相色谱仪测量10ml空气样品中的乙烯量，该气相色谱仪配备火焰电离检测器和色谱柱hp-plot/q(30m
×
0.53mm
×
40mm)，氮气作为载气，进样口温度120℃，气体分流比4:1，柱箱温度保持100℃，检测器温度保持160℃，总运行时间10min，在6-7min检测到乙烯峰。试验重复3次。
[0082]
vdefe突变体乙烯测产量测定结果
[0083]
为了明确vdefe基因敲除是否影响大丽轮枝菌产生乙烯的能力，以野生型v592为对照，对vdefe基因敲除突变体进行了乙烯含量的测定，结果表明，敲除体δvdefe产生的乙烯明显低于野生型v592，仅为v592的49.01％。互补体ec-vdefe的乙烯含量恢复与v592无明显差异，而过表达突变体oe-vdefe产生的乙烯明显高于野生型v592和敲除体δvdefe，乙烯含量分别是v592和δvdefe的1.73倍和3.53倍。为了进一步证明vdefe基因是efe通路上的关键酶基因，在培养基中添加了efe通路的唯一底物2-氧化戊二酸(oxo)。结果发现，oxo能使所有菌株产生更多的乙烯，并且在oxo诱导下，野生型v592的乙烯含量显著高于敲除体δvdefe的乙烯含量(图3)。说明vdefe基因与乙烯形成相关，并且是efe途径中的关键基因。
[0084]
实施例3
[0085]
琥珀酸含量测定
[0086]
琥珀酸检测参照国标法gb/t 5009.157-2003，略作一些修改。将浓度为1.0
×
108cfu/ml的分生孢子悬液1ml打在含有100ml查氏液体培养基的250ml注射玻璃瓶中，26℃，200r/min，黑暗摇培9d。按照上述方法收集孢子，利用超声波细胞破碎仪将收集到的孢子破碎，取细胞液进行测量。
[0087]
琥珀酸含量测定结果
[0088]
乙烯形成酶是一种多功能酶，同时催化2个反应，在催化乙烯形成的同时，还催化琥珀酸的产生(fukuda et al.,1992)。为进一步明确vdefe基因是否是乙烯形成酶基因，利用hplc对野生型v592和所有突变体的琥珀酸进行检测。结果发现，敲除体vdefe的琥珀酸含量与野生型v592和互补体ec-vdefe无明显差异，而过表达体oe-vdefe的琥珀酸含量明显高于野生型v592和其他突变体，约为野生型v592的1.5倍(图4)。说明vdefe基因与大丽轮枝菌琥珀酸形成相关，vdefe基因是乙烯形成酶基因。
[0089]
实施例4
[0090]
突变体中乙烯形成相关基因的表达分析
[0091]
按照实施例1记载的方法，提取所有突变体的总rna，并反转录为cdna。使用表2的引物进行qpcr检测，所用内参基因为β-tubulin基因，表达量测定所用到的乙烯相关基因包括：vdnlp2(vdag_01995.1)，vdpks1(vdag_00190)，vdpkac 1(vdag_06474.1)，vgb(jq665433.1)，vdnlp 1(vdag_04701.1)，vdacs(vdag_05021.1)，vdaccd(vdag_10392)。
[0092]
表2供试引物
[0093][0094]
vdefe基因敲除体中乙烯形成相关基因表达量结果
[0095]
为了进一步明确vdefe基因敲除是否影响其他乙烯形成相关基因的表达。利用rt-qpcr检测野生型菌株v592、vdefe敲除突变体和互补体中乙烯形成相关基因的转录水平。结果发现，2个缺失突变体中vdnlp2、vdpks1、vdpkac1和vgb基因的相对表达量均显著高于野生型v592，分别为14.1倍、4.5倍、1.5倍和1.9倍。2个缺失突变体中vdnlp1基因的相对表达量与野生型v592无显著差异(图5)。说明vdefe基因影响vdnlp2、vdpks1、vdpkac1和vgb基因的表达。
[0096]
实施例5
[0097]
1vdefe突变体生物学性状测定
[0098]
参照王春巧(2019)等真菌表型特征的测定方法(王春巧等，2019)，对vdefe基因突变体的菌落生长速率，表型特征，产孢量，微菌核含量进行测定。除上述生物学性状测量外，还对vdefe基因突变体产孢梗形态，孢子萌发率进行测定。
[0099]
1.1产孢梗形态观察
[0100]
在pda kan的固体培养基上，45
°
斜插5个无菌盖玻片，用无菌牙签挑取菌株的菌丝，划在玻片与培养基交界处，22℃，黑暗培养5d。从第3d起，每天取1-2个玻片，利用电子显微镜(奥林巴斯)观察野生型及突变体的孢子梗形态。
[0101]
1.2孢子萌发率测定
[0102]
向40ml的查氏液体培养基中加入400μl浓度为1
×
108cfu/ml孢子，26℃，200r/min，振荡培养12h，每隔2h测量一次。利用光学显微镜计数100个孢子中萌发孢子的个数，测定孢子萌发率。
[0103]
1.3致病性测定
[0104]
参照高峰等(2010)的方法(gao et al.,2010)，选用高感病棉花品种“军棉1号”，采用无伤浸根法来检测致病情况。将消过毒的棉籽均匀铺在无菌蛭石中，用无菌水浸湿蛭石，待培养成棉苗。
[0105]
将棉苗移至水培盒中，加入霍格兰氏培养液培养，待棉苗第三片真叶长出时接种，用浓度为1
×
106cfu/ml的分生孢子悬浮液，每盆接种菌液为200ml，接种时间2h。24h后用十分之一的霍格兰氏培养液培养棉苗。接种后，每天观察棉苗的病害发生情况，棉苗发病情况参考宋雯等(2019)的分级标准。病情指数按照公式i计算。
[0106]
病情指数＝[σ各级病株数
×
级数/(总株数
×
最高病级)]
×
100
[0107]
每个菌株重复3次，病情指数为3次平均值。
[0108]
为测定乙烯在大丽轮枝菌与棉花互作中的作用，对棉苗进行药剂处理，向水培盒中加入200ml浓度为200mm的acc或cda，浸根8h，后换清水，24h后进行接种实验。
[0109]
结果
[0110]
2 vdefe基因敲除体生物学性状
[0111]
2.1 vdefe基因敲除体菌株的生长表型及生长速率观察
[0112]
为了明确vdefe基因敲除是否影响大丽轮枝菌菌落生长表型及生长速率，以野生型v592菌株为对照，将2个敲除体菌株与v592分别接种于pda培养基上培养，观察其菌落形态(图6)。在pda培养基上培养14d，敲除突变体vdefeδvdefe-1和vdefeδvdefe-2的菌落形态与野生型v592的菌落形态无明显差异，结果表明vdefe基因敲除不影响大丽轮枝菌在pda培养基上的菌落形态。
[0113]
对pda上的菌落生长速率进行测定，结果显示，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2的生长速率较野生型明显下降。互补体ec-vdefe-1和ec-vdefe-2的生长速率有所恢复，与野生型差异不明显(如表3)。说明vdefe基因的敲除影响大丽轮枝菌的生长速率。
[0114]
表3 vdefe基因敲除突变体的菌落生长速率
[0115][0116]
2.2 vdefe基因敲除体菌株的微菌核测定
[0117]
为了明确vdefe基因是否与大丽轮枝菌微菌核产生有关，将野生型v592、敲除突变体、互补体等量的分生孢子在铺有玻璃纸的pda固体培养基上培养。在14d时，野生型v592可以产生大量的黑色微菌核，而敲除体δvdefe-1和δvdefe-2形成的黑色微菌核明显少于野生型v592。互补体ec-vdefe-1和ec-vdefe-2与野生型v592形成的微菌核数量得到明显恢复(图1-7)。说明vdefe基因对大丽轮枝菌微菌核的形成有一定影响。
[0118]
2.3 vdefe基因敲除体菌株的产孢量测定
[0119]
为了明确vdefe基因敲除是否影响大丽轮枝菌的产孢量，产孢量测定结果表明，与
野生型v592和互补菌株ec-vdefe-1、ec-vdefe-2相比，敲除体vdefeδvdefe-1和vdefeδvdefe-2的产孢量显著减少。所有菌株的产孢量在接种后前5d增长较快。第6d时，所有菌株的产孢开始变得缓慢。第8d时，敲除体δvdefe-1和δvdefe-2的产孢量仅为野生型v592的75.01％和74.56％，互补菌株ec-vdefe-1，ec-vdefe-2恢复至野生型水平，分别是v592产孢量的98.67％和102.68％(图8b)。说明vdefe基因与大丽轮枝菌产孢密切相关。
[0120]
对各菌株的产孢梗进行显微观察，结果发现，与v592菌株相比，敲除突变体的分生孢子梗明显减少，几乎不产生轮状分枝，互补体菌株分生孢子梗形态与野生型无明显差异(图8c)。说明vdefe基因敲除突变体产孢量下降可能与其产孢梗减少有关。
[0121]
2.4 vdefe基因敲除体菌株的孢子萌发率测定
[0122]
观察各菌株分生孢子的萌发率，结果显示，所有菌株的分生孢子在查氏液体培养基中摇培2h开始萌发，10h达到最高水平。在摇培6h后，敲除体δvdefe分生孢子萌发率为42％，而野生型v592和互补体ec-vdefe分生孢子萌发率分别为24％、28％。10h后，敲除体δvdefe的萌发率为56％，野生型v592的萌发率为54％，互补体ec-vdefe的萌发率为58％。而过表达体oe-vdefee的萌发率在所有菌株中最低，在查氏液体培养基中培养6h后，萌发率仅有14％。10h后，oe-vdefe的萌发率为25％(图8a)。说明vdefe基因与大丽轮枝菌孢子萌发有关。
[0123]
2.5 vdefe敲除突变体致病性鉴定
[0124]
为了测定vdefe基因在大丽轮枝菌致病力中的作用，以野生型v592为对照，对vdefe基因敲除体对“军棉1号”的致病性进行测定。如图1-7所示：接种10d后，接种野生型、敲除体和互补体的棉苗开始出现叶片黄化、萎蔫症状，接种过表达体的症状表现不明显；过表达体接种16d时开始出现叶片黄化、萎蔫症状。表明vdefe基因过表达对棉花黄萎病的发病有延迟作用；接种20d后，接种野生型，敲除体，互补体的棉苗发病情况更加严重，甚至出现整株坏死的现象，病情指数均达到95以上，而接种过表达体的棉苗引起的病害症状明显减轻，病情指数仅为55.21(图9a)，表明vdefe基因过表达导致大丽轮枝菌致病力下降。从病情指数观察发现，接种12d时，敲除体的病情指数达到65.27，而野生型和互补体的病情指数分别为43.51和24.17，过表达体病情指数最低仅到达7.85(图9b)，表明vdefe基因敲除加速大丽轮枝菌的致病。说明vdefe基因参与大丽轮枝菌的致病过程。低浓度乙烯可以增强大丽轮枝菌的致病力，高浓度的乙烯抑制大丽轮枝菌的致病力。
[0125]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。