ANGPTL2反义寡核苷酸及其用途的制作方法

angptl2反义寡核苷酸及其用途
相关申请的交叉引用
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技术领域
3.本公开文本涉及反义寡聚化合物(aso)，其靶向细胞中的血管生成素样2(angptl2)转录物，从而导致降低的angptl2蛋白的表达。angptl2蛋白表达的降低对于多种医学障碍可能是有益的，所述医学障碍如与异常angptl2表达和/或活性相关的那些(例如，心血管相关疾病或障碍)。


背景技术：

4.血管生成素样2(angptl2)是一种属于血管生成素样家族的分泌蛋白，所述家族由总计八个成员(angptl1-8)组成。angptl2主要在心脏、脂肪组织、肺、肾和骨骼肌中表达，并且在许多生物过程中具有重要作用(例如，组织修复和血管发生)。kim,i.等人,j biol chem 274(37):26523-8(1999)。已经在某些卒中患者中报道angptl2的有益血管生成特性。buga,a.m.等人,front aging neurosci 6:44(2014)。还已经描述angptl2在造血干细胞和祖细胞的存活和扩增中，在肠上皮再生的调节中，以及在有益的先天免疫应答的促进中具有关键作用。broxmeyer,h.e.等人,blood cells mol dis 48(1):25-29(2012)；horiguchi,h.等人,embo j 36(4):409-424(2017)；yugami,m.等人,j biol chem 291(36):18843-52(2016)。
5.尽管科学取得了进步，但心脏相关疾病仍然是世界范围内男性和女性二者的主要死因。美国心脏协会估计，截至2030年，近40％的美国人口将患有某种形式的心血管疾病，并且预计直接医疗成本将高达8180亿美元。benjamin,e.j.等人,circulation 135:e146-e603(2017)。因此，非常需要显著更稳健且节省成本的新治疗选择。


技术实现要素：

6.本文提供一种反义寡核苷酸(aso)，其包含与血管生成素样2(angptl2)转录物内的核酸序列互补的长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，所述aso与angptl2转录物内的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。在某些实施方案中，所述angptl2转录物选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:196、seq id no:197、seq id no:198、seq id no:199和seq id no:207。
7.在一些实施方案中，本文公开的aso能够降低正在表达所述angptl2蛋白的人细胞(例如，sk-n-as细胞)中的angptl2蛋白表达。在某些实施方案中，与没有暴露于所述aso的
人细胞中的angptl2蛋白表达相比，所述angptl2蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
8.在一些实施方案中，所述aso能够降低正在表达所述angptl2转录物的人细胞(例如，sk-n-as细胞)中的angptl2转录物(例如，mrna)表达。在某些实施方案中，与没有暴露于所述aso的人细胞中的angptl2转录物表达相比，所述angptl2转录物表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
9.在一些实施方案中，所述aso是gapmer。
10.在一些实施方案中，所述aso包含一种或多种核苷类似物。在某些实施方案中，所述一种或多种核苷类似物包括2'-o-烷基-rna；2'-o-甲基rna(2'-ome)；2'-烷氧基-rna；2'-o-甲氧基乙基-rna(2'-moe)；2'-氨基-dna；2'-氟-rna；2'-氟-dna；阿拉伯核酸(ana)；2'-氟-ana；二环核苷类似物(lna)；或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种核苷类似物是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。在某些实施方案中，所述增强亲和力的2'糖修饰的核苷是lna。在其他实施方案中，所述lna选自约束乙基核苷(cet)、2',4'-约束2'-o-甲氧基乙基(cmoe)、α-l-lna、β-d-lna、2'-o,4'-c-乙烯桥联核酸(ena)、氨基-lna、氧基-lna、硫代-lna及其任何组合。
11.在一些实施方案中，所述aso包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
12.在一些实施方案中，所述aso能够(i)降低sk-n-as细胞中的angptl2 mrna水平；(ii)降低sk-n-as细胞中的angptl2蛋白水平；(iii)减轻、改善或治疗与异常angptl2表达和/或活性相关的疾病或障碍的一种或多种症状；或者(iv)其任何组合。在某些实施方案中，与异常angptl2表达和/或活性相关的所述疾病或障碍包括心血管疾病、肥胖症、代谢性疾病、2型糖尿病、癌症或其组合。
13.在一些实施方案中，本文公开的aso的所述连续核苷酸序列与包含以下的核酸序列互补：(i)seq id no:1的核苷酸1-211；(ii)seq id no:1的核苷酸471-686；(iii)seq id no:1的核苷酸1,069-1,376；(iv)seq id no:1的核苷酸1,666-8,673；(v)seq id no:1的核苷酸8,975-12,415；(vi)seq id no:1的核苷酸12,739-18,116；(vii)seq id no:1的核苷酸18,422-29,875；或者(viii)seq id no:1的核苷酸30,373-35,389。在某些实施方案中，所述aso的所述连续核苷酸序列与包含以下的核酸序列互补：(i)seq id no:1的核苷酸37-161；(ii)seq id no:1的核苷酸521-636；(iii)seq id no:1的核苷酸1,119-1,326；(iv)seq id no:1的核苷酸1,716-8,623；(v)seq id no:1的核苷酸9,025-12,365；(vi)seq id no:1的核苷酸12,789-18,066；(vii)seq id no:1的核苷酸18,472-29,825；或者(viii)seq id no:1的核苷酸30,423-35,339。在其他实施方案中，所述aso的所述连续核苷酸序列与包含以下的核酸序列互补：(i)seq id no:1的核苷酸87-111；(ii)seq id no:1的核苷酸571-586；(iii)seq id no:1的核苷酸1,169-1,276；(iv)seq id no:1的核苷酸1,766-8,573；(v)seq id no:1的核苷酸9,075-12,315；(vi)seq id no:1的核苷酸12,839-18,016；(vii)seq id no:1的核苷酸18,522-29,775；或者(viii)seq id no:1的核苷酸30,473-35,289。在某些实施方案中，所述连续核苷酸序列与包含seq id no:1的核苷酸20,187-20,234的核酸互补。在其他实施方案中，所述连续核苷酸序列与包含seq id no:1的核苷酸20,202-20,
219的核酸互补。
14.在一些实施方案中，本文公开的aso的所述连续核苷酸序列包含选自图2中的序列(seq id no:4至seq id no:193)的核苷酸序列。
15.在一些实施方案中，aso的所述连续核苷酸序列包含seq id no:8、seq id no:20、seq id no:38、seq id no:46、seq id no:79、seq id no:84、seq id no:82、seq id no:88、seq id no:85、seq id no:90、seq id no:89、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:97、seq id no:101、seq id no:111、seq id no:116、seq id no:120、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:132、seq id no:142、seq id no:141、seq id no:143、seq id no:144或seq id no:146。在某些实施方案中，所述连续核苷酸序列包含seq id no:141、seq id no:122、seq id no:8、seq id no:38、seq id no:95、seq id no:88或seq id no:120。在其他实施方案中，所述连续核苷酸序列包含seq id no:116、seq id no:118、seq id no:117、seq id no:120、seq id no:119、seq id no:121、seq id no:122或其组合。
16.在一些实施方案中，本文公开的aso具有选自图2中的设计的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是dna。在一些实施方案中，所述aso的长度为15至20个核苷酸。
17.在一些实施方案中，本文公开的aso的所述连续核苷酸序列包含一个或多个修饰的核苷间连接。在某些实施方案中，所述一个或多个修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间连接被修饰。在某些实施方案中，每个所述核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。
18.本文还提供一种包含如本文所公开的aso的缀合物，其中所述aso共价附接至至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。在一些实施方案中，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其任何组合。
19.本文还提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的aso或缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。在一些实施方案中，所述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、铵盐或其任何组合。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种其他治疗剂。在某些实施方案中，所述其他治疗剂是angptl2拮抗剂。在一些实施方案中，所述angptl2拮抗剂是抗angptl2抗体或其片段。
20.本公开文本还提供一种试剂盒，其包含如本文所公开的aso、缀合物或药物组合物以及使用说明。还公开一种诊断试剂盒，其包含本公开文本的aso、缀合物或药物组合物以及使用说明。
21.本文提供一种抑制或降低细胞中的angptl2蛋白表达的方法，其包括将如本文所公开的aso、缀合物或药物组合物施用至表达angptl2蛋白的细胞，其中所述细胞中的angptl2蛋白表达在所述施用后被抑制或降低。在一些方面，本公开文本涉及一种抑制或降低细胞中的angptl2蛋白表达的体外方法，其包括使如本文所公开的aso、缀合物或药物组合物与表达angptl2蛋白的细胞接触，其中所述细胞中的angptl2蛋白表达在所述接触后被抑制或降低。
22.在一些实施方案中，在所述施用后或在所述接触后，所述aso抑制或降低所述细胞中的angptl2转录物(例如，mrna)的表达。在某些实施方案中，与没有暴露于所述aso的细胞相比，在所述施用后，angptl2转录物(例如，mrna)的所述表达降低至少约20％、至少约
30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在其他实施方案中，与没有暴露于所述aso的细胞相比，在所述施用后，angptl2蛋白的所述表达降低至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。在一些实施方案中，所述细胞是脑细胞，例如，成神经细胞(例如，sk-n-as细胞)。
23.本文还提供一种减轻、改善或治疗有需要的受试者的与异常angptl2表达和/或活性相关的疾病或障碍的一种或多种症状的方法，其包括将有效量的如本文所公开的aso、缀合物或药物组合物施用至所述受试者。本公开文本还提供本文公开的aso、缀合物或药物组合物用于制造药物的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗有需要的受试者的与异常angptl2表达和/或活性相关的疾病或障碍。在一些实施方案中，本公开文本的aso、缀合物或药物组合物用于疗法中。在一些实施方案中，本文公开的aso、缀合物或药物组合物用于有需要的受试者的与异常angptl2表达和/或活性相关的疾病或障碍的疗法中。
24.在一些实施方案中，与异常angptl2表达和/或活性相关的所述疾病或障碍包括心血管疾病、肥胖症、代谢性疾病、2型糖尿病、癌症或其组合。在某些实施方案中，所述心血管疾病或障碍包括动脉粥样硬化、冠心病、卒中、心力衰竭、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病心炎、主动脉瘤、外周动脉病、血栓栓塞性疾病、静脉血栓形成或其任何组合。在一些实施方案中，所述心血管疾病或障碍是心力衰竭。在某些实施方案中，所述心力衰竭包括左侧心力衰竭、右侧心力衰竭、充血性心力衰竭、射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、中范围射血分数的心力衰竭(hfmref)、肥厚型心肌病(hcm)、高血压心脏病(hhd)或高血压肥厚型心肌病。
25.在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，本公开文本的aso、缀合物或药物组合物是心内、口服、肠胃外、鞘内、脑室内、经肺、局部或心室内施用。
附图说明
26.图1a表示人angptl2基因组序列(对应于具有登录号nc_000009.12的ncbi参考序列的残基127,087,349至127,122,765的反向互补体)。seq id no:1与angptl2前体mrna序列相同，不同的是seq id no:1中的核苷酸“t”在前体mrna中被尿嘧啶“u”替代。图1b显示人angptl2mrna序列(登录号nm_012098.2)，不同的是seq id no:2中的核苷酸“t”在mrna中被尿嘧啶“u”替代。图1c显示人camk2d蛋白序列(登录号np_036230.1)(seq id no:3)。图1d显示可以通过选择性剪接生成的两种异构体。angptl2亚型x1的序列(登录号xp_006717093.1，seq id no:194)与图1c中的规范序列的不同之处如下：274-274：p
→
l；以及275-493：缺失。angptl2亚型2的序列(登录号q9uku9-2，seq id no:195)与图1c中的规范序列的不同之处如下：1-302：缺失。
27.图2显示靶向angptl2前体mrna的示例性aso。图2的每列显示针对仅aso的序列指定的seq id号、angptl2前体mrna序列上的靶标起始和结束位置、设计编号(des号)、具有设计的aso序列、aso编号(aso号)以及具有化学结构的aso序列。对于aso设计，大写字母指示核苷类似物并且小写字母指示dna。
28.图3显示在如实施例2中所述与各种aso一起体外培养后，sk-n-as细胞中angptl2 mrna表达的降低百分比。用25μm或5μm的aso处理细胞。将angptl2 mrna表达(针对肌动蛋白
归一化)的降低显示为对照的百分比。
29.图4显示各种aso在体外降低sk-n-as细胞中的angptl2 mrna表达方面的效力(ic50)。如实施例2中所述，将sk-n-as细胞与10点滴定的所测试的不同aso一起体外培养，并且将aso的效力(ic50)显示为angptl2表达与肌动蛋白表达的比率(m)。
30.图5显示示例性aso在降低小鼠的体内angptl2 mrna表达方面的功效。所述功效显示为与给予盐水的对照小鼠中的相应表达相比，angptl2 mrna表达(针对gapdh归一化)的降低百分比。
具体实施方式
i.定义
31.应注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种所述实体：例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”以及“至少一个/一种”在本文中可以互换使用。
32.此外，本文使用的“和/或”被视为两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一特征或组分一起的特定公开。因此，如在本文中的短语如“a和/或b”中使用的术语“和/或”意图包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独的)以及“b”(单独的)。同样，如在短语如“a、b和/或c”中使用的术语“和/或”意图包括以下方面中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独的)；b(单独的)；以及c(单独的)。
33.应理解，在本文中无论何处用语言“包含(comprising)”描述方面，也提供以“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”的措辞描述的其他类似的方面。
34.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei-show,第2版,2002,crc press；the dictionary of cell and molecular biology,第3版,1999,academic press；以及oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,修订版,2000,oxford university press为技术人员提供了本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。
35.单位、前缀和符号均以其国际单位制(si)可接受的形式表示。数值范围包括限定所述范围的数字。除非另外指示，核苷酸序列从左至右按5'至3'方向书写。氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过以其整体参考说明书，更全面地定义以下紧接着定义的术语。
36.术语“约”在本文中用于表示大约、大致、大概或在
……
左右。当术语“约”与数值范围一起使用时，它通过扩展所述数值的上下边界来修改该范围。通常，术语“约”可以将数值修饰为高于和低于所述值某个差值(例如，10％)上或下(更高或更低)。例如，如果声明“在施用aso后aso使细胞中angptl2蛋白的表达降低至少约60％”，则表明angptl2蛋白水平降低50％至70％的范围。
37.术语“核酸”或“核苷酸”旨在涵盖多个核酸。在一些实施方案中，术语“核酸”或“核苷酸”是指体内或体外的靶序列，例如前体mrna、mrna或dna。当所述术语是指靶序列中的核
酸或核苷酸时，所述核酸或核苷酸可以是细胞内的天然存在的序列。在其他实施方案中，“核酸”或“核苷酸”是指本公开文本的aso中的序列。当所述术语是指aso中的序列时，所述核酸或核苷酸不是天然存在的，即化学合成的、酶促产生的、重组产生的或其任何组合。在一个实施方案中，aso中的核酸或核苷酸是合成或重组产生的，但是不是天然存在的序列或其片段。在另一个实施方案中，aso中的核酸或核苷酸不是天然存在的，因为它们含有至少一个在自然界中非天然存在的核苷酸类似物。术语“核酸”或“核苷”是指存在于多核苷酸中的单核酸区段，例如dna、rna或其类似物。“核酸”或“核苷”包括天然存在的核酸或非天然存在的核酸。在一些实施方案中，术语“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。应理解，当提及核苷酸或单体的序列时，所提及的是碱基的序列，所述碱基如a、t、g、c或u及其类似物。
38.如本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接基团(连接基团，如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团)的糖苷，并且涵盖天然存在的核苷酸(如dna或rna)和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸(其在本文中还被称为“核苷酸类似物”)。在本文中，单一核苷酸(单元)还可以被称为单体或核酸单元。在某些实施方案中，术语“核苷酸类似物”是指具有修饰的糖部分的核苷酸。具有修饰的糖部分的核苷酸(例如，lna)的非限制性例子公开与本文中的其他地方。在其他实施方案中，术语“核苷酸类似物”是指具有修饰的核碱基部分的核苷酸。具有修饰的核碱基部分的核苷酸包括但不限于5-甲基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
39.术语“核碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。如本文所用，术语“核碱基”也涵盖修饰的核碱基，其可能与天然存在的核碱基不同，但是在核酸杂交期间发挥功能。在此情况下，“核碱基”是指天然存在的核碱基(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤)，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于以下文献中：hirao等人,(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页和bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry增刊371.4.1。核碱基部分可以由每个相应的核碱基的字母代码表示，例如，a、t、g、c或u，其中每个字母可以任选地包括具有等效功能的修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5-甲基嘧啶。
40.如本文所用，术语“核苷”用于指代包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且因此可以在提及核苷酸单元时使用，所述核苷酸单元通过aso的核苷酸之间的核苷酸间连接共价连接。在生物技术的领域中，术语“核苷酸”经常用于指代核酸单体或单元。在aso的情况下，术语“核苷酸”可以是指单独的碱基，即包含胞嘧啶(dna和rna)、鸟嘌呤(dna和rna)、腺嘌呤(dna和rna)、胸腺嘧啶(dna)和尿嘧啶(rna)的核碱基序列，其中糖骨架和核苷酸间连接的存在是不直接言明的。同样，特别是在其中核苷酸间连接基团中的一个或多个被修饰的寡核苷酸的情况下，术语“核苷酸”可以是指“核苷”。例如，即使在指明核苷之间连接的存在或性质时，也可以使用术语“核苷酸”。
41.如本文所用术语“反义寡核苷酸”(aso)定义为能够通过与靶核酸、特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，并且因此不是sirna或shrna。在某些实施方案中，本文公开的反义寡核苷酸是单链的。应理解，本文公开的单链寡核苷酸可以形成发夹结构或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两
(n-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸及其组合。合适的sirna在反义链的5'端包含5'-磷酸酯基团或5'-磷酸酯模拟物。在一些实施方案中，反义链的5'端是rna核苷。
47.在一个实施方案中，dsrna药剂还包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接。
48.硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接可以位于一条或两条链(例如，反义链；或有义链)的3'末端；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接可以位于一条或两条链(例如，反义链；或有义链)的5'末端；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接可以位于一条或两条链(例如，反义链；或有义链)的5'末端和3'末端两处。在一些实施方案中，其余核苷间连接是磷酸二酯连接。
49.dsrna药剂还可以包含配体。在一些实施方案中，所述配体缀合至有义链的3'端。
50.对于生物分布，例如，sirna可以缀合至靶向配体，和/或被配制到脂质纳米颗粒中。
51.本公开文本的其他方面涉及包含这些dsrna(如适合于治疗用途的sirna分子)的药物组合物，以及通过施用本公开文本的dsrna分子(如sirna)来抑制靶基因表达的方法，例如，其用于治疗如本文所公开的各种疾病状况。
52.术语“修饰的寡核苷酸”描述包含一种或多种糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语“嵌合寡核苷酸”是在文献中用于描述包含糖修饰的核苷和非糖修饰的核苷二者的寡核苷酸的术语。在一些实施方案中，反义寡核苷酸是合成制备的寡核苷酸，并且可以呈分离或纯化的形式。
53.术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸中与靶核酸互补的区域。所述术语在本文中可与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，如f-g-f'gapmer区域，并且可以任选地包含一种或多种其他核苷酸，例如核苷酸接头区域，其可用于将官能团附接至连续核苷酸序列。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不互补。应理解，寡核苷酸的连续核苷酸序列不能长于所述寡核苷酸本身，并且寡核苷酸不能短于所述连续核苷酸序列。
54.如本文所用术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指如与等效dna或rna核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰来修饰的核苷。在某些实施方案中，实施方案修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中也可以与术语“核苷类似物”或者修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰dna或rna糖部分的核苷在本文中称为dna或rna核苷。在dna或rna核苷的碱基区域中具有修饰的核苷仍通称为dna或rna，条件是它们允许沃森-克里克碱基配对。
55.术语“修饰的核苷间连接”如技术人员通常所理解，定义为除了磷酸二酯(po)连接外的将两个核苷共价偶联在一起的连接。在某些实施方案中，修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
56.如本文所用术语“核苷酸长度”意指给定序列(如核苷序列、反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列)中的核苷酸(单体)总数。例如，tacatattatattactcctc的序列(seq id no:158)具有20个核苷酸；因此所述序列的核苷酸长度为20。因此，术语“核苷酸长度”在本文中可与“核苷酸数量”互换使用。
57.如本领域普通技术人员将理解的，寡核苷酸的5'末端核苷酸不包含5'核苷酸间连接基团，但是它可以包含5'末端基团。
58.如本文所用，单独的或组合的术语“烷基”表示具有1至8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，并且更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链c1-c8烷基的例子是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的具体例子是甲基。烷基的另外例子是单、二或三氟甲基、乙基或丙基，如环丙基(cpr)，或者单、二或三氟环丙基。
59.单独的或组合的术语“烷氧基”表示式烷基-o-的基团，其中术语“烷基”具有先前给定的意义，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。特定地，“烷氧基”是甲氧基。
60.单独的或组合的术语“保护基团”表示一种基团，其选择性地阻断多官能化合物中的反应性位点，使得化学反应可以选择性地在另一个非保护反应性位点处进行。保护基团可以被去除。示例性保护基团是氨基保护基团、羧基保护基团或羟基保护基团。
61.如果本公开文本的起始材料或化合物中的一种含有在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或具有反应性的一个或多个官能团，则可以应用本领域中熟知的方法在关键步骤之前引入适当的保护基团(如例如在以下文献中所述：“protective groups in organic chemistry”，t.w.greene和p.g.m.wuts,第3版,1999,wiley,纽约)。可以使用文献中描述的标准方法在合成的后期去除此类保护基团。保护基团的例子是叔丁氧基羰基(boc)、9-芴甲氧羰酰胺(fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(teoc)、苄氧羰基(cbz)和对甲氧基苄氧基羰基(moz)。
62.本文所述的化合物可以含有几个不对称中心，并且可以以下形式存在：光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物(如例如外消旋体)、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体的混合物。
63.如本文所用，术语“二环糖”是指包含4至7元环的修饰的糖部分，所述环包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环，从而产生二环结构的桥。在一些实施方案中，所述桥连接核苷的核糖环的c2'和c4'(即，2'-4'桥)，如在lna核苷中所观察到的。
64.如本文所用，“编码区”或“编码序列”是由可翻译成氨基酸的密码子组成的多核苷酸的部分。虽然“终止密码子”(tag、tga或taa)通常不翻译为氨基酸，但是它可以被认为是编码区的一部分，但是任何侧接序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“utr”)等不是编码区的一部分。编码区的边界通常通过编码所得多肽的氨基末端的5'末端处的起始密码子和编码所得多肽的羧基末端的3'末端处的翻译终止密码子确定。
65.如本文所用的术语“非编码区”意指不是编码区的核苷酸序列。非编码区的例子包括但不限于启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“utr”)、非编码外显子等。一些外显子可以是每个转录物的5'非翻译区(5'utr)和3'非翻译区(3'utr)的全部或一部分。非翻译区对于转录物的有效翻译和控制翻译速率和转录物的半衰期是重要的。
66.当在核苷酸序列的情况下使用时，术语“区域”是指该序列的一部分。例如，短语“核苷酸序列内的区域”或“核苷酸序列的互补体内的区域”分别是指比所述核苷酸序列短
但是比位于特定核苷酸序列或核苷酸序列的互补体内的至少10个核苷酸长的序列。术语“子序列(sub-sequence)”或“子序列(subsequence)”还可以是指核苷酸序列的区域。
67.在提及核苷酸序列时，术语“下游”意指位于参考核苷酸序列的3'的核酸或核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列是指在转录起点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
68.术语“上游”是指位于参考核苷酸序列的5'的核苷酸序列。
69.如本文所用，术语“调节区”是指位于编码区的上游(5'非编码序列)、编码区内或编码区的下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码区的转录、rna加工、稳定性或翻译。调节区可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、rna加工位点、效应子结合位点、utr和茎环结构。如果预期编码区在真核细胞中表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3'。
70.如本文所用，术语“转录物”可以是指通过dna的转录合成并且在加工之后变成信使rna(mrna)的初级转录物，即前体信使rna(前体mrna)，以及加工的mrna本身。术语“转录物”可以与“前体mrna”和“mrna”可互换使用。dna链转录成初级转录物之后，以几种方式修饰新合成的初级转录物，以转化为其成熟的功能形式，从而产生不同的蛋白质和rna(如mrna、trna、rrna、lncrna、mirna等)。因此，术语“转录物”可以包括外显子、内含子、5'utr和3'utr。
71.如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物(例如，rna或多肽)的过程。其包括但不限于将多核苷酸转录为信使rna(mrna)以及将mrna翻译为多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如，通过基因转录产生的信使rna)或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化或剪接)的核酸，或者具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质添加、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白质水解切割)的多肽。
72.如本文所用术语“同一性”是指核酸分子(例如，寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中如下核苷酸的比例(以百分比表示)：其在所述连续核苷酸序列中与参考序列(例如，序列基序)相同。因此通过以下方式来计算同一性百分比：计数两个序列之间(在本公开文本的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同的所比对核碱基(匹配)的数量，用该数量除以寡核苷酸中的核苷酸总数，并乘以100。因此，同一性百分比＝(匹配x100)/所比对区域(例如连续核苷酸序列)的长度。在连续核苷酸序列的同一性百分比的计算中不允许插入和缺失。将理解，在确定同一性时，不顾及核碱基的化学修饰，只要保留核碱基形成沃森-克里克碱基配对的功能性能力即可(例如，出于计算同一性％的目的，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
73.与多核苷酸参考序列比对的单个多核苷酸靶序列内的不同区域可以各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，将序列同一性百分比值舍入至小数点后一位。例如，将80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。还需注意，长度值将总是整数。
74.如本文所用，术语“同源的”和“同源性”可与术语“同一性”和“相同的”互换。
75.术语“其天然存在的变体”是指angptl2多肽序列或angptl2核酸序列(例如，转录物)的变体，所述变体天然存在于限定的分类学组(如哺乳动物，如小鼠、猴和人)内。通常，
当提及多核苷酸的“天然存在的变体”时，所述术语还可以涵盖编码angptl2的基因组dna的任何等位基因变体(由于染色体易位或复制所致，发现于染色体位置9q33.3(即，genbank登录号nc_000009.12的残基127,087,349至127,122,765的反向互补体))和rna(如从其衍生的mrna)的任何等位基因变体。“天然存在的变体”还可以包括源自angptl2 mrna的选择性剪接的变体。当提及特定多肽序列时，例如，所述术语还包括蛋白质的天然存在的形式，其因此可以例如通过共翻译或翻译后修饰(如信号肽切割、蛋白质水解切割、糖基化等)进行加工。
76.当提及两个单独的核酸或核苷酸序列时，术语“对应于(corresponding to)”和“对应于(corresponds to)”可以用于阐明所述序列中基于同源性和/或功能性彼此对应或相似的区域，但是特定序列的核苷酸的编号可以不同。例如，基因转录物的不同亚型可以具有核苷酸序列的相似或保守部分，所述相似或保守部分的编号可以基于选择性剪接和/或其他修饰而在相应亚型中不同。此外，已经认识到，当表征核酸或核苷酸序列(例如，基因转录物并且不论是从翻译起始密码子开始对序列进行编号还是包括5'utr)时，可以采用不同的编号系统。另外，认识到，基因或基因转录物的不同变体的核酸或核苷酸序列可以变化。然而，如本文所用，变体中共享核酸或核苷酸序列同源性和/或功能性的区域被认为彼此“对应”。例如，angptl2转录物中对应于seq id no:1(“参考序列”)的核苷酸x至y的核苷酸序列是指具有与seq id no:1的核苷酸x至y相同的序列或类似的序列的angptl2转录物序列(例如，angptl2前体mrna或mrna)，其中x是起始位点并且y是终止位点(如图2中所示)。本领域普通技术人员可以通过将angptl2转录物序列与seq id no:1进行比对来鉴定angptl2转录物序列中的相应x和y残基。
77.术语“相应的核苷酸类似物”和“相应的核苷酸”意图表明，核苷酸类似物和天然存在的核苷酸中的核碱基具有相同的配对或杂交能力。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“相应的核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(与2-脱氧核糖不同)。
78.术语“互补性”描述核苷/核苷酸进行沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对是鸟嘌呤(g)-胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)-胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。将理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶来代替胞嘧啶(胞嘧啶的相应核苷酸类似物的例子)，并且因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基与修饰的核碱基之间的沃森-克里克碱基配对(参见例如,hirao等人(2012)accounts of chemical research第45卷第2055页；以及bergstrom(2009)current protocols in nucleic acid chemistry增刊37 1.4.1)。如本文所用的术语“反向互补体”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“互补体”、“互补的”和“互补性”互换。在一些实施方案中，术语“互补的”是指与angptl2转录物内的连续核酸序列的100％匹配或互补性(即，完全互补)。在一些实施方案中，术语“互补的”是指与angptl2转录物内的连续核酸序列的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％匹配或互补性。37 1.4.1)。
79.如本文所用术语“互补的”是指核酸分子(例如，寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中如下核苷酸的比例(以百分比计)：其在所述连续核苷酸序列中与参考序列(例如，靶序列或序列基序)互补。因此通过以下方式来计算互补性百分比：计数两个序列之间(在用靶序列
5'-3'和寡核苷酸序列3'-5'比对时)互补的(根据沃森-克里克碱基对)所比对核碱基的数量，用该数字除以寡核苷酸中核苷酸的总数，并乘以100。在这种比较中，将没有对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。在连续核苷酸序列的互补性％的计算中不允许插入和缺失。将理解，在确定互补性时，不顾及核碱基的化学修饰，只要保留核碱基形成沃森-克里克碱基配对的功能性能力即可(例如，出于计算同一性％的目的，认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
80.术语“完全互补”是指100％互补性。
81.如本文所用术语“杂交”或“杂交”应理解为两条核酸链(例如，寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合的亲和力是杂交的强度。所述亲和力通常根据解链温度(tm)来描述，解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸双链体化的温度。在生理条件下，tm不与亲和力严格成比例(mergny和lacroix,2003,oligonucleotides 13:515-537)。标准态吉布斯自由能δg
°
是结合亲和力的更准确的表示，并且依据δg
°
＝-rtln(kd)与反应的解离常数(kd)有关，其中r是气体常数并且t是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的极低δg
°
反映寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。δg
°
是与反应相关的能量，其中水溶液浓度为1m，ph为7，并且维度为37
°
℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，并且对于自发反应，δg
°
小于零。δg
°
可以通过实验来测量，例如，通过使用等温滴定量热法(itc)方法测量，如以下文献中所述：hansen等人,1965,chem.comm.36-38以及holdgate等人,2005,drug discov today。技术人员将得知，商业设备可用于δg
°
测量。也可以通过使用最近邻模型(如santalucia,1998,proc natl acad sci usa.95:1460-1465所述)使用适当衍生的热力学参数(sugimoto等人,1995,biochemistry 34:11211-11216以及mctigue等人,2004,biochemistry 43:5388-5405所述)在数字方面估计δg
°
。为了得到通过杂交调节其计划核酸靶标的可能性，本公开文本的寡核苷酸与靶核酸杂交，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的δg
°
值低于-10kcal。在一些实施方案中，通过标准态吉布斯自由能δg
°
来测量杂交的程度或强度。寡核苷酸可以与靶核酸杂交，对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的δg
°
值低于-10kcal的范围，如低于-15kcal，如低于-20kcal并且如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸杂交，估计的δg
°
值为-10至-60kcal，如-12至-40，如-15至-30kcal或-16至-27kcal，如-18至-25kcal。
82.如本文所用的术语“des编号”或“des号”是指给予具有核苷(例如，dna)和核苷类似物(例如，lna)的特殊模式的核苷酸序列的唯一编号。如本文所用，aso的设计是通过大写字母与小写字母的组合来显示。例如，des-0190是指具有llddddddddddddll的aso设计(即，gagcctttacatgccg)的gagcctttacatgccg的aso序列(seq id no:5)，其中l(即，大写字母)指示核苷类似物(例如，lna)，并且d(即，小写字母)指示核苷(例如，dna)。
83.如本文所用的术语“aso编号”或“aso号”是指给予具有如下组分的详细化学结构的核苷酸序列的唯一编号，所述组分例如核苷(例如dna)、核苷类似物(例如，β-d-氧基-lna)、核碱基(例如，a、t、g、c、u或mc)和骨架结构(例如，硫代磷酸酯或磷酸二酯)。例如，aso-0190可以指代(5'-3')oxygsoxyasdnagsdnacsdnacsdnatsdnatsdnatsdnaasdnacsdnaasdnatsdnagsdnacsoxymcsoxyg。
84.aso化学的注释如下：β-d-氧基lna核苷酸通过oxyn来命名，其中n表示核苷酸碱
基，如胸腺嘧啶(t)、尿苷(u)、胞嘧啶(c)、5-甲基胞嘧啶(mc)、腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g)，因此包括oxya、oxyt、oxymc、oxyc和oxyg。dna核苷酸通过dnan来命名，其中小写的n表示核苷酸碱基，如胸腺嘧啶(t)、尿苷(u)、胞嘧啶(c)、5-甲基胞嘧啶(mc)、腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g)，因此包括dnaa、dnat、dnac、dnamc和dnag。c或c之前的字母m指示5-甲基胞嘧啶。字母s指示硫代磷酸酯核苷酸间连接。
85.除非另外说明，否则“效力”通常表示为ic50或ec50值，以μm、nm或pm计。效力也可以用抑制百分比来表示。ic50是治疗分子的抑制中浓度。ec50是治疗分子相对于媒介物或对照(例如，盐水)的有效中浓度。在功能测定中，ic50是治疗分子的将生物反应(例如，mrna的转录或蛋白质表达)降低通过所述治疗分子实现的生物反应的50％的浓度。在功能测定中，ec50是治疗分子的产生50％生物反应(例如，mrna的转录或蛋白质表达)的浓度。ic50或ec50可以通过本领域已知的许多手段来计算。
86.如本文所用，术语“抑制”例如angptl2基因转录物和/或angptl2蛋白的表达是指aso降低细胞或组织中angptl2基因转录物和/或angptl2蛋白的表达。在一些实施方案中，术语“抑制”是指对angptl2基因转录物或angptl2蛋白的完全抑制(100％抑制或不可检测的水平)。在其他实施方案中，术语“抑制”是指对细胞或组织中的angptl2基因转录物和/或angptl2蛋白表达的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％抑制。
[0087]“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或疗法的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物、运动动物和动物园动物，包括例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
[0088]
术语“药物组合物”是指如下制剂，其所呈形式使得活性成分的生物活性有效，并且其不含对会被施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。这种组合物可以是无菌的。
[0089]
如本文公开的aso的“有效量”是足以实现明确陈述的目的的量。“有效量”可以关于所陈述的目的凭经验并以常规方式来确定。
[0090]
术语(如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)”或者“减轻(alleviating)”或“以减轻(to alleviate)”)是指以下两者：(1)治愈、减缓、减少诊断的病理状况或障碍的症状和/或阻止所述病理状况或障碍的进展的治疗措施，以及(2)预防和/或减慢靶向的病理状况或障碍的发展的预防性(prophylactic)和/或预防性(preventative)措施。因此，需要治疗的那些受试者包括已经患有障碍的那些受试者；易患障碍的那些受试者；以及要预防障碍的那些受试者。在某些实施方案中，如果患者显示例如与疾病或障碍相关的症状的完全、部分或暂时减轻或消除，则根据本文提供的方法针对本文其他地方公开的疾病或病症成功地“治疗”受试者。ii.靶向angptl2的反义寡核苷酸
[0091]
本公开文本采用反义寡核苷酸(aso)用于调节编码哺乳动物angptl2的核酸分子(如angptl2核酸，例如，angptl2转录物，包括angptl2前体mrna和angptl2 mrna)或编码哺乳动物angptl2的此类核酸分子的天然存在的变体的功能。在本公开文本的情况下，术语“aso”是指通过两个或更多个核苷酸的共价连接形成的分子(即，寡核苷酸)。
ssc、0.1％sds的洗涤溶液，其中在45℃下在1x ssc中进行最终洗涤。
[0108]
在一些实施方案中，本公开文本的aso能够下调来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的angptl2转录物。在某些实施方案中，本文公开的aso能够下调人和啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)二者的angptl2转录物。因此，在一些实施方案中，aso能够下调(例如，降低或去除)人和啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)二者中的angptl2 mrna或angptl2蛋白的表达。
[0109]
小鼠angptl2转录物的序列是本领域已知的。例如，小鼠angptl2基因的序列可以在公众可获得的genbank登录号nc_000068.7下发现。小鼠angptl2前体mrna转录物的序列对应于nc_000068.7的残基33,215,951-33,247,725。小鼠angptl2mrna转录物的序列是已知的并且可根据以下登录号获得：nm_011923.4(seq id no:196)、xm_006498051.1(seq id no:197)、bc138610.1(seq id no:198)和bc138609.1(seq id no:199)。小鼠angptl2蛋白的序列可以在以下公众可获得的登录号下发现：np_036053.2(seq id no:200)、q9r045.2(seq id no:201)、edl08598.1(seq id no:202)、edl08597.1(seq id no:203)、aai38611.1(seq id no:204)、aai38610.1(seq id no:205)和xp_006498114.1(seq id no:206)。
[0110]
大鼠angptl2转录物的序列也是本领域中已知的。大鼠angptl2基因可以在公众可获得的genbank登录号nc_005102.4下发现。大鼠angptl2前体mrna转录物的序列对应于nc_005102.4的残基12,262,822-12,292,665。大鼠angptl2 mrna转录物的序列是已知的并且可以根据登录号：nm_133569.1(seq id no:207)获得。大鼠angptl2蛋白的序列可以在公众可获得的以下登录号下发现：np_598253.1(seq id no:208)和edl93193.1(seq id no:209)。ii.b.aso序列
[0111]
本公开文本的aso包含对应于angptl2转录物的区域(例如，对应于seq id no:1的核苷酸序列)的互补体的连续核苷酸序列。
[0112]
在某些实施方案中，本公开文本提供长度为10-30(如10-15个核苷酸、10-20个核苷酸或10-25个核苷酸)(例如，长度为15-20个核苷酸)的aso，其中连续核苷酸序列具有与angptl2转录物(如seq id no:1)或其天然存在的变体的互补体内的区域的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性。因此，例如，aso与具有seq id no:1的序列或其部分的单链核酸分子杂交。
[0113]
aso可以包含与编码哺乳动物angptl2蛋白的核酸(例如，seq id no:1)的等效区域完全互补(完美互补)的连续核苷酸序列。aso可以包含与对应于seq id no:1的核苷酸x-y的核酸序列或所述序列内的区域完全互补(完美互补)的连续核苷酸序列，其中x和y分别是起始位点和终止位点，如图2中所示。
[0114]
在一些实施方案中，本公开文本的aso的核苷酸序列或连续核苷酸序列具有与选自seq id no:4至193(即，图2中的序列)的序列至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源性)。在一些实施方案中，aso具有本文其他地方描述的设
计或本文其他地方显示的化学结构(例如，图2)。
[0115]
在一些实施方案中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自seq id no:4至193的序列之一或其至少10个连续核苷酸的区域，其中在与相应angptl2转录物相比时，所述aso(或其连续核苷酸部分)可以任选地包含一个或两个错配。
[0116]
在一些实施方案中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自seq id no:4至193的序列之一或其至少12个连续核苷酸的区域，其中在与相应angptl2转录物相比时，所述aso(或其连续核苷酸部分)可以任选地包含一个或两个错配。
[0117]
在一些实施方案中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自seq id no:4至193的序列之一或其至少14个连续核苷酸的区域，其中在与相应angptl2转录物相比时，所述aso(或其连续核苷酸部分)可以任选地包含一个或二个错配。
[0118]
在一些实施方案中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自seq id no:4至193的序列之一或其至少15或16个连续核苷酸的区域，其中在与相应angptl2转录物相比时，所述aso(或其连续核苷酸部分)可以任选地包含一个或两个错配。
[0119]
在一些实施方案中，aso包含选自以下的序列：seq id no:8、seq id no:20、seq id no:38、seq no:46、seq id no:76、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:85、seq id no:87、seq id no:89、seq id no:90、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:97、seq id no:101、seq id no:111、seq id no:116、seq id no:119、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:132、seq id no:141、seq id no:142、seq id no:143、seq id no:144、seq id no:146及其组合。
[0120]
在一些实施方案中，aso包含选自以下的序列：seq id no:116、seq id no:117、seq id no:118、seq id no:119、seq id no:120、seq id no:121、seq id no:122及其组合。
[0121]
在一些实施方案中，本公开文本的aso与靶核酸序列(例如，angptl2转录物)结合，并且与细胞中的正常(即，对照)表达水平相比，能够将所述angptl转录物的表达抑制或降低至少10％或20％，例如，与正常表达水平(例如，没有暴露于aso的细胞中的表达水平)相比，至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
[0122]
在一些实施方案中，与不与aso接触(例如，与盐水接触)的sk-n-as细胞相比，在使细胞与25μm的aso接触时，本公开文本的aso能够在体外将sk-n-as细胞中的angptl2 mrna的表达降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
[0123]
在一些实施方案中，与不与aso接触(例如，与盐水接触)的sk-n-as细胞相比，在使细胞与5μm的aso接触时，本公开文本的aso能够在体外将sk-n-as细胞中的angptl2 mrna的表达降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
[0124]
在某些实施方案中，本公开文本的aso具有选自以下的至少一种特性：(i)降低sk-n-as细胞中编码angptl2的mrna水平；(ii)降低sk-n-as细胞中angptl2的蛋白质水平；
氯-6-氨基嘌呤)来修饰核碱基部分。
[0132]
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码表示，例如，a、t、g、c或u，其中每个字母可以任选地包括具有等效功能的修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自a、t、g、c和5-甲基-胞嘧啶。任选地，对于lna gapmer，可以使用5-甲基-胞嘧啶lna核苷。ii.d.2.糖修饰
[0133]
本公开文本的aso可以包含具有修饰的糖部分(即与dna和rna中存在的核糖部分相比时对糖部分的修饰)的一种或多种核苷。已经制备了具有核糖部分的修饰的许多核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。
[0134]
此类修饰包括如下那些：其中核糖环结构例如通过用己糖环(hna)或二环或未连接的核糖环替代来修饰，所述二环通常在核糖环上的c2'与c4'碳之间具有双自由基桥(lna)，所述未连接的核糖环通常在所述c2'与c3'碳之间缺乏键(例如，una)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(wo 2011/017521)或三环核酸(wo 2013/154798)。修饰的核苷还包括如下核苷：其中糖部分被非糖部分替代，例如在肽核酸(pna)或吗啉核酸的情况下。
[0135]
糖修饰还包括经由将核糖环上的取代基改变为除氢或天然存在于rna核苷中的2'-oh基团以外的基团而进行的修饰。取代基可以例如在2'、3'、4'或5'位置处引入。具有修饰的糖部分的核苷还包括2'修饰的核苷，如2'取代的核苷。实际上，已经将许多注意力集中在开发2'取代的核苷上，并且发现许多2'取代的核苷在掺入到寡核苷酸中时具有有益的特性，如增强的核苷抗性和增强的亲和力。ii.d.2.a 2'修饰的核苷
[0136]
2'糖修饰的核苷是在2'位置处具有除h或-oh以外的取代基(2'取代的核苷)或包含2'连接的双自由基的核苷，并且包括2'取代的核苷和lna(2'-4'双自由基桥接的)核苷。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力(例如，增强亲和力的2'糖修饰的核苷)和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷的例子是2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧基乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna、2'-氟-dna、阿糖核酸(ana)和2'-氟-ana核苷。其他例子请参见例如，freier和altmann；nucl.acid res.,1997,25,4429-4443；uhlmann,curr.opinion in drug development,2000,3(2),293-213；以及deleavey和damha,chemistry and biology 2012,19,937。下文说明一些2'取代的修饰的核苷。
ii.d.2.b锁核酸核苷(lna).
[0137]“lna核苷”是2'-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的c2'和c4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，所述双基限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或二环核酸(bna)。在将lna掺入互补rna或dna分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与增强的杂交亲和力相关(双链体稳定化)。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补体双链体的解链温度来确定。
[0138]
非限制性示例性lna核苷披露于以下文献中：wo 99/014226、wo 00/66604、wo 98/039352、wo 2004/046160、wo 00/047599、wo 2007/134181、wo 2010/077578、wo 2010/036698、wo 2007/090071、wo 2009/006478、wo 2011/156202、wo 2008/154401、wo 2009/067647、wo 2008/150729；morita等人,bioorganic&med.chem.lett.12,73-76；seth等人.j.org.chem.2010,第75娟(5)第1569-81页；以及mitsuoka等人,nucleic acids research 2009,37(4),1225-1238；以及wan和seth,j.medical chemistry 2016,59,9645-9667。
[0139]
其他非限制性示例性lna核苷公开于方案1中。方案1：
[0140]
在一些实施方案中，lna核苷是β-d-氧基-lna、6'-甲基-β-d-氧基lna，如(s)-6'-甲基-β-d-氧基-lna(scet)，或)和ena。在某些实施方案中，lna是β-d-氧基-lna。ii.e.核酸酶介导的降解
[0141]
核酸酶介导的降解是指在与互补核苷酸序列形成双链体时能够介导这个序列降解的寡核苷酸。
[0142]
在一些实施方案中，寡核苷酸可以经由核酸酶介导的靶核酸的降解来发挥功能，其中本公开文本的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是内切核酸酶，优选地内切核糖核酸酶(核糖核酸酶)，如核糖核酸酶h，如核糖核酸酶h1。经由核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的例子是如下寡核苷酸：其通常包含至少5或6个dna核苷的区域并且在一侧或两侧上侧接增强亲和力的核苷，例如，gapmer、headmer和tailmer。ii.f.核糖核酸酶h活性和募集
[0143]
反义寡核苷酸的核糖核酸酶h活性是指其在处于与互补rna分子的双链体中时募集核糖核酸酶h并诱导所述互补rna分子降解的能力。wo 01/23613提供用于确定核糖核酸酶h活性的体外方法，其可以用于确定募集核糖核酸酶h的能力。通常，如果寡核苷酸在与互
补靶核酸序列一起提供时，具有在使用与所测试的修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有dna单体并且在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸，并且使用由wo 01/23613的实施例91-95提供的方法时所确定的初始速率的至少5％(如至少10％或超过20％)的初始速率(以pmol/l/min测量)，则认为所述寡核苷酸能够募集核糖核酸酶h。在一些实施方案中，可以使用重组人核糖核酸酶h1确定寡核苷酸在处于与互补rna分子的双链体中时募集核糖核酸酶h并诱导所述互补rna分子降解的能力。
[0144]
在一些实施方案中，如果寡核苷酸在与互补靶核酸一起提供时，核糖核酸酶h初始速率(以pmol/l/min测量)为在使用与所测试的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有dna单体，没有2'取代并且在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸，并且使用由wo 01/23613的实施例91-95提供的方法时所确定的初始速率的小于20％(如小于10％，如小于5％)，则认为所述寡核苷酸基本上不能募集核糖核酸酶h。ii.g.aso设计
[0145]
本公开文本的aso可以包含具有核苷和核苷类似物两者的核苷酸序列，并且可以呈gapmer、blockmer、mixmer、headmer、tailmer或totalmer的形式。可以与本公开文本的aso一起使用的gapmer、blockmer、mixmer、headmer、tailmer或totalmer的构型的例子描述于美国专利申请公开号2012/0322851中。
[0146]
如本文所用的术语“gapmer”是指反义寡核苷酸，其包含在5'和3'侧接一个或多个增强亲和力的修饰的核苷(侧翼)的核糖核酸酶h募集寡核苷酸的区域(空位)。术语“headmer”和“tailmer”是能够募集核糖核酸酶h的寡核苷酸，其中一个侧翼缺失，即，所述寡核苷酸的仅一端包含增强亲和力的修饰的核苷。对于headmer，3'侧翼缺失(即，5'侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)，并且对于tailmer，5'侧翼缺失(即，3'侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)。术语“lnagapmer”是gapmer寡核苷酸，其中至少一种增强亲和力的修饰的核苷是lna核苷。术语“混合翼gapmer”是指lna gapmer，其中侧翼区域包含至少一个lna核苷和至少一个dna核苷或非lna修饰的核苷，如至少一个2'取代的修饰的核苷，如例如2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧基乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna、2'-氟-dna、、阿糖核酸(ana)和2'-氟-ana核苷。
[0147]
称为“mixmer”的其他“嵌合”aso由以下的交替组合物组成：(i)可由核糖核酸酶识别和切割的dna单体或核苷类似物单体，以及(ii)非核糖核酸酶募集的核苷类似物单体。
[0148]“totalmer”是仅包含非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物的单链aso。
[0149]
在一些实施方案中，除了增强aso对靶区域的亲和力之外，一些核苷类似物也介导核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶h)的结合和切割。由于α-l-lna单体在一定程度上募集核糖核酸酶h活性，因此在一些实施方案中，含有α-l-lna单体的aso的空位区域(例如，在本文中被称为b区域)由可由核糖核酸酶h识别和切割的较少单体组成，并且在mixmer构建中引入更大的灵活性。ii.g.1.gapmer设计
[0150]
在一些实施方案中，本公开文本的aso是gapmer，并且包含能够募集核糖核酸酶(如核糖核酸酶h)的连续核苷酸延伸段(例如，一个或多个dna，在本文中被称为b区域(b))，其中b区域在5'和3'两处侧接位于b区域的连续核苷酸延伸段的5'和3'的核苷类似物区域，这些区域分别被称为a区域(a)和c区域(c)。在一些实施方案中，核苷类似物是糖修饰的核
苷(例如，高亲和力的糖修饰的核苷)。在某些实施方案中，a区域和c区域的糖修饰的核苷增强aso对靶核酸的亲和力(即，增强亲和力的2'糖修饰的核苷)。在一些实施方案中，糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，如高亲和力的2'糖修饰，如lna或2'-moe。
[0151]
在gapmer中，b区域的最5'和最3'核苷是dna核苷，并且分别与a区域和c区域的核苷类似物(例如，高亲和力的糖修饰的核苷)相邻定位。在一些实施方案中，可以通过使核苷类似物位于离b区域最远的一端(即，在a区域的5'端和在c区域的3'端)来进一步限定a区域和c区域。
[0152]
在一些实施方案中，本公开文本的aso包含式(5'至3')a-b-c的核苷酸序列，其中：(a)(5'区域或第一翼序列)包含至少一个核苷类似物(例如，1-5个lna单元)；(b)包含至少四个连续核苷(例如，4-28个dna单元)，它们能够募集核糖核酸酶(在与互补rna分子(如前体mrna或mrna靶)形成双链体时)；并且(c)(3'区域或第二个翼序列)包含至少一个核苷类似物(例如，1-5个lna单元)。ii.h.核苷酸间连接
[0153]
本文所述的aso的单体经由连接基团偶联在一起。合适地，每个单体经由连接基团与3'相邻单体连接。
[0154]
本领域普通技术人员将理解，在本公开文本的情况下，在aso的末端的5'单体不包含5'连接基团，但是其可以包含或可以不包含5'末端基团。
[0155]
术语“连接基团”或“核苷间连接”旨在意指能够将两个核苷共价偶联在一起的基团。具体且优选的例子包括磷酸酯基团和硫代磷酸酯基团。
[0156]
本公开文本的aso的核苷或其连续核苷序列经由连接基团偶联在一起。合适地，每个核苷经由连接基团与3'相邻核苷连接。
[0157]
在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的核苷间连接被修饰。
[0158]
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的核苷之间的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。ii.i.缀合物
[0159]
如本文所用的术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或c区域或第三区域)共价连接的aso。
[0160]
本公开文本的aso与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以例如通过影响aso的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性来改善aso的药理学。在一些实施方案中，非核苷酸部分通过改善aso的细胞分布、生物可利用性、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来改变或增强aso的药代动力学特性。在某些实施方案中，非核苷酸部分可以将aso靶向到特定器官、组织或细胞类型，并且从而增强aso在此器官、组织或细胞类型中的有效性。在其他实施方案中，非核苷酸部分降低了aso在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如在非靶细胞类型、组织或器官中的脱靶活性或活性。wo 93/07883和wo 2013/033230提供了合适的缀合物部分。其他合适的缀合物部分是能够与去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)结合的那些。特定地，三价n-乙酰半乳糖胺缀合物部分适合于与asgpr结合，参见例如，wo 2014/076196、wo 2014/207232和wo 2014/179620。
[0161]
在一些实施方案中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如，细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如，衣壳)及其组合。ii.j.激活的aso
[0162]
如本文所用，术语“激活的aso”是指与至少一个功能性部分共价连接(即，官能化)的aso，所述功能性部分允许aso与一个或多个缀合部分(即，本身不是核酸或单体的部分)共价连接以形成本文所述的缀合物。通常，功能性部分将包含化学基团，其能够经由例如腺嘌呤碱基的3'-羟基或环外nh2基团与aso共价键合；间隔子，其可以是亲水性的；以及末端基团，其能够与缀合部分结合(例如，氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，此末端基团不受保护，例如，是nh2基团。在其他实施方案中，末端基团例如由任何合适的保护基团来保护，如以下文献中所述的那些：“protective groups in organic synthesis”theodora w greene和peter g m wuts,第3版(john wiley&sons,1999)。
[0163]
在一些实施方案中，本公开文本的aso在5'端被官能化，以允许缀合部分与aso的5'端的共价连接。在其他实施方案中，本公开文本的aso可以在3'端被官能化。在仍其他实施方案中，本公开文本的aso可以沿骨架或在杂环碱基部分上被官能化。在又其他实施方案中，本公开文本的aso可以在独立地选自5'端、3'端、骨架和碱基的超过一个位置处被官能化。
[0164]
在一些实施方案中，通过在合成过程中掺入与功能性部分共价连接的一个或多个单体来合成本公开文本的激活的aso。在其他实施方案中，本公开文本的激活的aso用尚未被官能化的单体合成，并且在合成完成后将所述aso官能化。iii.药物组合物和施用途径
[0165]
本公开文本的aso可以用于药物配制品和组合物中。在一些实施方案中，此类组合物包含药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)，并且药学上可接受的盐包括但不限于钠和钾盐。在一些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。因此，药物组合物可以位于药物溶液中，所述药物溶液包含本文公开的寡核苷酸或缀合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂(可替代地称为药学上可接受的溶剂)，如磷酸盐缓冲盐水。
[0166]
在一些实施方案中，本文公开的aso呈盐形式，如药学上可接受的盐，如钠盐、钾盐或铵盐。
[0167]
在一些实施方案中，本文公开的aso或缀合物或其药学上可接受的盐呈固体形式，例如，呈粉末(例如，冻干粉末)或干燥物(dessicate)的形式。
[0168]
本公开文本的aso可以包括在单位配制品中，如药学上可接受的载体或稀释剂中，所述aso的量足以向患者递送治疗有效量。
[0169]
本公开文本的药物组合物可以根据需要局部治疗还是全身性治疗以及根据要治疗的区域而以多种方式来施用。例如，可以使用肠胃外施用，如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；在一些实施方案中，aso是作为推注注射心内或心室内施用。在一些实施方案中，aso是皮下施用的。
[0170]
可以根据制药行业中熟知的常规技术来制备本公开文本的药物配制品，其可以方便地以单位剂型呈递。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或赋形剂结合的步
骤。通常，通过以下方式制备配制品：使活性成分与液体载体或精细固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后(如果需要)使产品成形。
[0171]
药物配制品可以包括无菌稀释剂、缓冲液、张力调节剂和抗细菌剂。活性aso可以用防止降解或从体内立即清除的载体来制备，所述载体包括具有控释特性的植入物或微胶囊。对于肠胃外或肠胃外、心内或心室内施用，载体可以是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。2007年3月22日公开的国际公开号wo2007/031091(a2)还提供合适的药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂。iv.诊断
[0172]
本公开文本还提供在与异常angptl2表达和/或活性相关的疾病或障碍的诊断期间有用的诊断方法。在一些实施方案中，这种疾病或障碍包括心血管疾病、肥胖症、代谢性疾病、2型糖尿病、癌症及其组合。
[0173]
在一些实施方案中，可以用本公开文本的aso诊断的疾病或障碍是心血管疾病。心血管疾病的非限制性例子包括动脉粥样硬化、冠心病、卒中、心力衰竭、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病心炎、主动脉瘤、外周动脉病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。在一些实施方案中，心力衰竭包括左侧心力衰竭、右侧心力衰竭、充血性心力衰竭、射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、中范围射血分数的心力衰竭(hfmref)、肥厚型心肌病(hcm)、高血压心脏病(hhd)或高血压肥厚型心肌病。
[0174]
本公开文本的aso可以用于测量来自个体的组织或体液中angptl2转录物的表达，并且将所测量的表达水平与正常组织或体液中的标准angptl2转录物表达水平进行比较，由此与标准相比表达水平的增加指示可通过本公开文本的aso治疗的疾病。
[0175]
使用本领域技术人员已知的任何方法，本公开文本的aso可以用于测定生物样品中的angptl2转录物水平。(touboul等人,anticancer res.(2002)22(6a):3349-56；verjout等人,mutat.res.(2000)640:127-38；stowe等人,j.virol.methods(1998)75(1):93-91)。
[0176]
术语“生物样品”是指从个体、细胞系、组织培养物或可能表达angptl2转录物的其他细胞来源获得的任何生物样品。从哺乳动物获得这种生物样品的方法是本领域熟知的。v.包含aso的试剂盒
[0177]
本公开文本还提供试剂盒，其包含本文所述的aso并且可以用于进行本文所述的方法。在某些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种aso。在一些实施方案中，试剂盒含有进行检测测定需要的和/或足以进行检测测定的所有组分，包括所有对照、进行测定的指导以及用于结果分析和呈现的任何必需的软件。本领域技术人员将容易认识到，所公开的aso可以容易地掺入本领域中熟知的已建立的试剂盒形式中的一种中。vi.使用方法
[0178]
本公开文本的aso可以用作研究试剂，用于例如诊断、治疗和预防。
[0179]
在研究中，此类aso可以用于特异性抑制细胞和实验动物中angptl2蛋白的合成(通常通过降解或抑制mrna，从而防止蛋白质形成)，从而有助于靶标的功能分析或评估其作为治疗干预的靶标的有用性。还提供下调细胞或组织中angptl2 mrna和/或angptl2蛋白的表达的方法，其包括使所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本公开文本的aso、缀合
物或组合物中的一种或多种接触。
[0180]
在诊断中，可以通过rna印迹法、原位杂交或类似技术使用aso来检测和定量细胞和组织中的angptl2转录物表达。
[0181]
对于治疗，通过施用根据本公开文本的aso来治疗怀疑患有疾病或障碍的动物或人，所述疾病或障碍可以通过调节angptl2转录物和/或angptl2蛋白的表达来治疗。还提供通过施用治疗或预防有效量的本公开文本的aso或组合物中的一种或多种来治疗怀疑患有或易患与angptl2转录物和/或angptl2蛋白的增加表达相关的疾病或病症的哺乳动物(如治疗人)的方法。根据本公开文本的aso、缀合物或药物组合物通常以有效量来施用。在一些实施方案中，本公开文本的aso或缀合物用于疗法中。
[0182]
本公开文本还提供aso，用于治疗与异常angptl2表达和/或活性相关的一种或多种疾病或障碍。在一些实施方案中，此类疾病或障碍包括心血管疾病、肥胖症、代谢性疾病、2型糖尿病、癌症或其组合。在某些实施方案中，所述疾病或障碍是心血管疾病。心血管疾病的非限制性例子包括动脉粥样硬化、冠心病、卒中、心力衰竭、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病心炎、主动脉瘤、外周动脉病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。
[0183]
在某些实施方案中，所述疾病、障碍或病症与angptl2基因转录物和/或angptl2蛋白的过表达相关。
[0184]
本公开文本还提供抑制(例如，通过降低)细胞或组织中的angptl2基因转录物和/或angptl2蛋白表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本公开文本的一种或多种aso、缀合物或其药物组合物接触，以影响angptl2基因转录物的表达物的降解，从而减少angptl2蛋白。
[0185]
本公开文本还提供如所述的本公开文本的aso或缀合物用于制造用于治疗如本文所提及的障碍的药物或者用于治疗如本文所提及的障碍的方法的用途。
[0186]
本公开文本还提供一种用于抑制或减少正在表达angptl2的细胞中的angptl2蛋白的方法，其包括向所述细胞施用根据本公开文本的aso或缀合物，以影响所述细胞中angptl2蛋白的抑制或减少。
[0187]
本公开文本包括一种减轻、改善、预防或治疗有需要的受试者中运动神经元(例如，如在心肌细胞中发现的那些)的过度兴奋的方法，其包括施用根据本公开文本的aso或缀合物。
[0188]
本公开文本还提供一种用于治疗如本文所提及的障碍的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本文所述的根据本公开文本的aso或缀合物和/或根据本公开文本的药物组合物。
[0189]
根据本公开文本的aso和其他组合物可以用于治疗与angptl2蛋白的过表达相关的病症。
[0190]
一般而言，本公开文本的一方面涉及一种治疗患有或易患与angptl2的异常水平相关的病症的哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的靶向包含一个或多个lna单元的angptl2转录物的aso。根据本公开文本的aso、缀合物或药物组合物通常以有效量来施用。
[0191]
本公开文本的一个有趣方面涉及如本文定义的aso(化合物)或如本文定义的缀合
物用于制备用于治疗如本文所提及的疾病、障碍或病症的药物的用途。
[0192]
本公开文本的方法可以用于治疗或预防由angptl2蛋白的异常水平和/或活性引起的疾病。在一些实施方案中，由angptl2蛋白的异常水平和/或活性引起的疾病包括心血管疾病、肥胖症、代谢性疾病、2型糖尿病、癌症及其组合。在某些实施方案中，所述疾病是心血管疾病。如本文所用，心血管疾病可以包括动脉粥样硬化、冠心病、卒中、心力衰竭、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病心炎、主动脉瘤、外周动脉病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。
[0193]
在某些实施方案中，所述心血管疾病是心力衰竭，其可以包括左侧心力衰竭、右侧心力衰竭、充血性心力衰竭、射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数保留的心力衰竭(hfpef)、中范围射血分数的心力衰竭(hfmref)、肥厚型心肌病(hcm)、高血压心脏病(hhd)或高血压肥厚型心肌病。
[0194]
换言之，在一些实施方案中，本公开文本还涉及一种用于治疗angptl2蛋白的异常水平的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本公开文本的aso或本公开文本的缀合物或本公开文本的药物组合物。
[0195]
本公开文本还涉及一种如本文定义的aso、组合物或缀合物，其用作药物。
[0196]
本公开文本还涉及如本文定义的化合物、组合物或缀合物用于制造用于治疗angptl2蛋白的异常水平或angptl2蛋白的突变体形式(如等位基因变体，其中所述等位基因变体与本文所提及的疾病中的一种相关)的表达的药物的用途。
[0197]
需要治疗的患者是患有或可能患上所述疾病或障碍的患者。
[0198]
除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，sambrook等人编辑(1989)molecular cloning a laboratory manual(第2版；cold spring harbor laboratory press)；sambrook等人编辑(1992)molecular cloning:a laboratory manual,(cold springs harbor laboratory,纽约)；d.n.glover编辑,(1985)dna cloning,volumes i and ii；gait编辑(1984)oligonucleotide synthesis；mullis等人美国专利号4,683,195；hames和higgins编辑(1984)nucleic acid hybridization；hames和higgins编辑(1984)transcription and translation；freshney(1987)culture of animal cells(alan r.liss,inc.)；immobilized cells and enzymes(irl press)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning；论文,methods in enzymology(academic press,inc.,纽约)；miller和calos编辑(1987)gene transfer vectors for mammalian cells,(cold spring harbor laboratory)；wu等人编辑,methods in enzymology,第154卷和第155卷；mayer和walker编辑(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press,伦敦)；weir和blackwell编辑,(1986)handbook of experimental immunology,第i卷-第iv卷；manipulating the mouse embryo,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,纽约,(1986)；crooke,antisense drug technology:principles,strategies and applications,第2版crc press(2007)；以及ausubel等人(1989)current protocols in molecular biology(john wiley and sons,巴尔的摩,马里兰州)。
[0199][0200]
通过说明的方式而不是通过限制的方式，提供以下实施例。实施例实施例1：aso的构建
[0201]
将本文所述的反义寡核苷酸设计为靶向angptl2前体mrna(seq id no:1)中的多个区域。seq id no:1提供基因组angptl2序列，其对应于genbank登录号nc_000009.12的残基127,087,349至127,122,765的反向互补体。例如，将aso构建为靶向使用seq id no:1的起始和终止位点表示的区域，如图2中所示。本公开文本的aso的示例性序列提供于图2中。在一些实施方案中，将aso设计为gapmer，如图2中所示。将所公开的gapmer构建为含有锁核酸-lna(大写字母)。例如，gapmer可以在5'端和3'端具有β-脱氧lna并且具有硫代磷酸酯骨架。但是所述lna也可以被任何其他核苷类似物取代，并且所述骨架可以是其他类型的骨架(例如，磷酸二酯连接、磷酸三酯连接、甲基膦酸酯连接、氨基磷酸酯连接或其任何组合)。
[0202]
所述aso是使用本领域中熟知的方法合成的。制备此类aso的示例性方法描述于以下文献中：barciszewski等人,第10章
–“
locked nucleic acid aptamers”，nucleic acid and peptide aptamers:methods and protocols,第535卷,gunter mayer(编辑)(2009)。实施例2：用于测量sk-n-as细胞中angptl2 mrna表达的降低的qpcr测定
[0203]
测试本公开文本的aso降低sk-n-as细胞中angptl2 mrna表达的能力(-2137
tm
)。sk-n-as细胞在细胞培养基(dmem高葡萄糖(d6546)、非必需氨基酸补充剂(0.1mm，m7145)、l-谷氨酰胺(2mm，g7513)和10％fbs)中生长。每5天，通过以下方式对细胞进行胰蛋白酶化：用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，之后添加0.25％胰蛋白酶-edta溶液，在37℃下孵育2-3分钟，并且研磨，之后进行细胞接种。将细胞维持培养多达15代。
[0204]
对于实验使用，以10,000个细胞/孔接种于96孔板中的100μl生长培养基中。aso是从750μm原液制备并溶解于pbs中。在接种细胞后大约24小时，将aso添加至细胞以获得所需终浓度(即，5μm或25μm)。然后在没有任何培养基变化的情况下将细胞孵育3天。对于效力确定(参见图3)，制备8种浓度的aso用于16-50,000nm的终浓度范围。在孵育后，通过去除培养基来收获细胞，之后添加125μl pro 96裂解缓冲液和125μl70％乙醇。然后，根据制造商的说明书纯化rna，并且将其在终体积为50μl的水中洗脱，从而得到10-20ng/μl的rna浓度。接下来，将rna在水中稀释10倍，然后进行一步式qpcr反应。
[0205]
对于一步式qpcr反应，将qpcr混合物(来自qauntabio的qscripttmxle 1步式rt-qpcr low rox)与两种taqman探针以10:1:1(qpcr混合物:探针1:探针2)的比率混合以生成主混合物。taqman探针获取自lifetechnologies和idt：angptl2_hs00765776_m1；actb_hs_pt.39a.22214847。然后将主混合物(6μl)和rna(4μl，1-2ng/μl)在qpcr板(光学384孔，目录号4309849)中混合。在将板密封后，使板快速旋转(在rt下以1000g持续1分钟)，并将其转移至viiatm 7系统(applied biosystems，thermo)。使用以下pcr条件：50℃持续15分钟；95℃持续3分钟；如下的40个循环：95℃持续5秒，接着进行1.6℃/秒的温度降低，接着60℃持续45秒。使用quantstudiotm实时pcr软件分析数据。相对于对照处理的样品，计算aso处理的样品的抑制百分比。结果显示于图3和图4中。实施例3：体内angptl2 mrna减少的分析
[0206]
为了评价aso在体内降低angptl2 mrna水平方面的效力，向10周龄雄性c57bl/6小鼠皮下施用以下示例性aso中的一种：aso-0027、aso-0037、aso-0094、aso-0079、aso-0050、aso-0150和aso-0132。连续三天(第1天、第2天和第3天)以30mg/kg/天的剂量施用aso(以约5mg/ml的浓度在无菌盐水中配制)。在第一剂量后1周处死小鼠，并且收获心脏，并将顶块(apical chunk)储存于rnalater中。使用magmax-96总rna分离试剂盒(thermo am1830)进行rna纯化。使用quanta qscript cdna合成试剂盒(quanta 95047)进行cdna合成。在applied biosystems viia7仪器上使用针对angptl2(thermo mm00507897_m1)和gapdh(thermo 4352339e)的双链体taqman反应使用10ng总cdna进行定量实时pcr。将angptl2 mrna水平针对gapdh归一化并呈现为给予盐水的对照组的对照百分比。
[0207]
如图5中所示，在施用至c57bl/6小鼠时，所测试的所有aso都能够降低angptl2 mrna水平。总之，本文提供的结果证实了aso在体外和在体内的效力，并且支持angptl2特异性aso可以是用于治疗多种医学障碍(如与异常angptl2表达和/或活性相关的那些，例如，心血管相关疾病或障碍)的疾病改善治疗剂。