用于癌症诊断和治疗的新的PSMA特异性结合蛋白的制作方法

用于癌症诊断和治疗的新的psma特异性结合蛋白
技术领域
1.本发明涉及对前列腺特异性膜抗原(psma)具有特异性的新的结合蛋白。本发明进一步涉及进一步包含诊断性或治疗性(diagnostically or therapeutically，诊断上的或治疗上的)活性组分的psma结合蛋白。本发明的进一步方面涵盖这些psma结合蛋白在医学(medicine，药物)中的用途，例如在与psma表达相关的癌症的诊断和治疗中的用途。


背景技术：

2.前列腺特异性膜抗原(psma)在肿瘤中表达，尤其是在前列腺癌中表达。在其它实体瘤例如乳腺癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃癌或脑癌(例如成胶质细胞瘤)和多发性骨髓瘤的新血管系统中也已经显示出psma的过表达。它随着癌症的进展而增加，尤其是在转移性疾病中具有高水平。三结构域糖蛋白(胞外、跨膜和短胞内结构域)介导肿瘤营养和细胞增殖。开发了靶向的psma特异性单克隆抗体，用于诊断和治疗癌症，尤其是前列腺癌。迄今为止，唯一批准用于新诊断和复发性前列腺癌患者的诊断成像和染色的药剂是放射性标记的鼠单克隆抗体卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)。然而，由于与psma的细胞内表位结合，该抗体没有治疗益处。开发了与psma的细胞外表位结合的第二代单克隆抗体，如鼠单克隆抗体j591。j591已被测试用于进行性实体瘤的体内成像或用于捕获转移性循环肿瘤细胞。其治疗用途受限于毒副作用和较短的血清半衰期。
3.psma特异性单克隆抗体作为用于诊断和治疗方法的药剂，例如用于psma放射免疫疗法和psma放射成像，具有进一步的主要缺点。一个是复杂的分子结构和相应复杂的生产工艺。另一个是它们的尺寸较大，导致体内组织渗透性差。组合用于成像应用的长循环时间抗体类(based)化合物可能会由于高背景信号而导致对比度差。
4.另外，对最初有效治疗的耐药性的频繁发展构成了对前列腺癌和过表达psma的其它癌症的另外和改进的治疗剂的需求。
5.现有选项未能充分解决psma相关癌症的诊断和治疗，因此，许多患者没有从当前的策略中充分受益。毋庸置疑，迫切需要新的策略来诊断和治疗psma相关肿瘤。
6.本发明的一个目的是提供用于特异性靶向psma的分子，以允许靶向的诊断和治疗选项，包括检测psma阳性肿瘤。靶向这种肿瘤相关蛋白可以为对新型诊断和治疗途径具有未满足需求的患者提供益处。由于psma在正常组织中的分布低且受限制，因此靶向psma意味着可能是无毒的诊断和治疗方法。因此，对psma具有特异性的结合蛋白可能能够为癌症提供有效的医疗选项，并且最终改善患者的生活品质。
7.本发明提供了用于在psma相关癌症的诊断和治疗中新且改进策略的新型psma结合分子。
8.上述目的和优点由所附权利要求的主题实现。本发明通过提供psma结合蛋白的例子满足了上述需求。以上概述不一定描述了本发明所解决的所有问题。


技术实现要素：

9.本公开提供了下列[1]至[15]，但不具体地限于此：
[0010]
[1]一种前列腺特异性膜抗原(psma)结合蛋白，包含从gfahr、gwahr、sfahr、syahr、gfahl、wtttf、wtpsi、wteti、gheyl、gdgdv、khntw、vayrp、或wwnpn、或与其具有80％同一性的基序中选择的至少一个氨基酸结合基序。
[0011]
[2]根据[1]的psma结合蛋白，包含基于根据seq id no:1的泛素的一种或多种(one or more，一个或多个)泛素突变蛋白。
[0012]
[3]根据[2]的psma结合蛋白，其中结合基序的氨基酸残基对应于根据seq id no:1的泛素的第62、63、64、65、66位，优选psma结合蛋白包含基于根据seq id no:1的泛素的一种或多种泛素突变蛋白并且在对应于根据seq id no:1的泛素的第62、63、64、65、66位的氨基酸残基处含有氨基酸结合基序gfahr或与其具有80％同一性的基序。
[0013]
[4]根据[3]的psma结合蛋白，其中另外地，对应于seq id no:1的泛素的第6和8位的氨基酸被取代。
[0014]
[5]根据[3]的psma结合蛋白，其中另外地，对应于seq id no:1的泛素的第42、44、68、70和72位的氨基酸被取代。
[0015]
[6]根据[3]的psma结合蛋白，其中另外地，对应于泛素(seq id no:1)第6、8、9、10、12和46位的氨基酸被取代，或者其中另外地，至多达6个氨基酸被插入在对应于泛素(seq id no:1)第9和10位的氨基酸之间，或其中另外地，对应于泛素(seq id no:1)第11、33、51、48和74位的氨基酸被取代。
[0016]
[7]根据1.‑
[6]中任一项的psma结合蛋白，其中psma结合蛋白是包含多个根据1.‑
[6]中任一项的psma结合蛋白的多聚体，优选是根据1.‑
[6]中任一项的psma结合蛋白的二聚体。
[0017]
[8]根据1.‑
[7]中任一项的psma结合蛋白，包含从seq id no:3
‑
55的组中选择的或从分别与其具有至少90％同一性的氨基酸序列中选择的氨基酸序列，或由从seq id no:3
‑
55的组中选择的或从分别与其具有至少90％同一性的氨基酸序列中选择的氨基酸序列组成。
[0018]
[9]根据1.‑
[8]中任一项的psma结合蛋白，其中psma结合蛋白对psma的胞外结构域的特异性结合亲和力为500nm或更小。
[0019]
[10]根据1.‑
[9]中任一项的psma结合蛋白，进一步包含用于偶联化学部分(chemical moiety)的一个或多个偶联位点(coupling site，偶联部位，耦接位点)，优选其中化学部分选自螯合剂、药物、毒素、染料和小分子中的任何。
[0020]
[11]根据1.‑
[10]中任一项的psma结合蛋白，进一步包含至少一个诊断性活性部分，其任选地选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶或上述的任何组合。
[0021]
[12]根据1.‑
[11]中任一项的psma结合蛋白，进一步包含至少一种治疗性活性部分，其任选地选自单克隆抗体或其片段、结合蛋白、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶或其衍生物、或上述的任何组合。
[0022]
[13]根据1.‑
[12]中任一项的psma结合蛋白，进一步包含至少一种调节药代动力学的部分，其任选地选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖、或包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的非
结构化(unstructured)氨基酸序列。
[0023]
[14]根据1.‑
[13]中任一项的psma结合蛋白，用于诊断或治疗psma相关肿瘤，优选用于对肿瘤成像和psma相关肿瘤的放射疗法治疗。
[0024]
[15]一种包含根据1.‑
[14]中任一项的psma结合蛋白的组合物，其用于医学(medicine，药物)，优选用于诊断或治疗psma相关肿瘤，优选用于对肿瘤成像和psma相关肿瘤的放射疗法治疗。
[0025]
[16]一种生产根据1.‑
[15]中任一项的psma结合蛋白的方法，包括步骤：a)在适合于获得所述psma结合蛋白的条件下培养宿主细胞，和b)分离所生产的所述psma结合蛋白。
[0026]
本发明内容不一定描述了本发明的所有特征。其它实施方式从后续的详细描述回顾中将变得显而易见。
附图说明
[0027]
附图显示：
[0028]
图1
‑
3示出了psma结合蛋白的示例，其在对应于seq id no:1(泛素)的位置62
‑
66的氨基酸中具有特征性基序。泛素中被取代的(顶行的数字)或者插入在泛素的第9和10位之间的(图2中顶行的数字：9a、9b、9c、9d、9e、9f)相应氨基酸示出了此类泛素突变蛋白的结构特征。功能特征被示出为由spr(biacore)确定的对psma的亲和力、由dsf确定的热稳定性和实施例中所述的细胞结合。
[0029]
图1示出了在位置62
‑
66具有5
‑
氨基酸基序wwnpn的psma结合蛋白。对应于泛素第6、8、9、10、12、42、44、46、62
‑
66、68、70、72位的氨基酸被取代。在一些结合蛋白中，发现了进一步的取代，如列进一步取代所示。
[0030]
图2示出了具有对应于位置62
‑
66的5
‑
氨基酸基序khntw的psma结合蛋白。对应于泛素第42、44、62
‑
66、68、70、72位的氨基酸被取代，并且在泛素的第9和10位之间插入了6个氨基酸。在一些结合蛋白中，发现了进一步的取代，如列进一步取代”所示。
[0031]
图3示出了具有5
‑
氨基酸基序gfahr或gwahr(或类似)和/或5
‑
氨基酸wtttf、wtpsi、wtpti或gdgdv的psma结合蛋白。对应于泛素第6、8、62
‑
66位的氨基酸被取代；连接了两个泛素突变蛋白。在一些psma结合蛋白中，例如在泛素第11、33、48、51、74位发现了进一步的取代，如列“进一步取代”所示。
[0032]
图4.通过流式细胞术确定的psma结合蛋白的功能特征。直方图确认seq id no:4(称为191871)结合在psma
‑
过表达hek293
‑
细胞或psma
‑
表达lncap
‑
细胞上(灰色峰)；在对照细胞系hek293
‑
pentry或pc3上无结合。未修饰的泛素(双泛素(bis
‑
ubi)；白色峰)显示与细胞没有结合。
具体实施方式
[0033]
本发明人开发了一种解决方案，通过提供新型psma结合蛋白来满足本领域对扩大癌症诊断和治疗的医疗选项的强烈需求。如本文所定义的psma特异性蛋白的功能特征在于对psma具有高特异性亲和力。特别地，本发明提供基于泛素突变蛋白(也称为分子)的psma结合蛋白。本文所述的psma结合蛋白提供了具有有利物理化学特性、在细菌中高
水平表达并允许使用简单生产方法的分子格式。新型psma结合蛋白可以拓宽迄今为止尚未满足的psma相关癌症诊断和治疗的医学策略。特别地，psma结合蛋白可用于诊断或成像目的，例如用于诊断或成像存在的表达psma的肿瘤细胞，以及用于放射疗法治疗表达psma的肿瘤。
[0034]
在下面更详细地描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于本文所述的特定方法学、协议和试剂，因为它们可以变化。还应理解的是，本文所用术语仅用于描述特定方面和实施方式的目的，并不旨在限制由所附权利要求反映的本发明的范围。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。这包括在蛋白质工程和纯化领域工作的技术人员，也包括在开发用于技术应用以及治疗和诊断的新靶标特异性结合分子领域工作的技术人员。
[0035]
优选地，如a multilingual glossary of biotechnological terms:(iupac recommendations)”,leuenberger,h.g.w,nagel,b.和h.eds.(1995),helvetica chimica acta,ch
‑
4010basel,switzerland)中描述，对本文使用的术语进行定义。
[0036]
贯穿本说明书和所附权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”等变型应被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤、或整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤、或整数或步骤组。术语“包含(comprise(s))”或“包含(comprising)”可涵盖对“由
…
组成(consists)”或“由
…
组成(consisting of)”的限制，如果这种限制出于任何原因和在任何程度上是必要的。
[0037]
本说明书中可能会引用一些文献(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明、基因库登录号序列提交等)。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。本文引用的某些文献的特征可能是“以引用方式并入”。如果此类并入参考文献的定义或教导与本说明书中叙述的定义或教导之间存在冲突，则以本说明书的文本为准。
[0038]
本文所提及的所有序列均在所附序列表中公开，其全部内容和公开构成本说明书公开内容的一部分。
[0039]
一般定义
[0040]
术语“psma”是指前列腺特异性膜抗原。人类psma是一种约100kd的糖蛋白，具有短胞内结构域(残基1
‑
19)、跨膜结构域(残基20
‑
43)和胞外结构域(残基44
‑
750)。psma由uniprot id q04609(2017年3月15日的版本)表示；人类psma mrna由ncbi参考序列nm_004476.1表示。术语psma包含与q04609显示出至少70％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的多肽。
[0041]
术语“psma结合蛋白”是指与psma具有高亲和力结合的蛋白质。
[0042]
术语“蛋白质”和“多肽”是指由肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指特定长度的产品。因此，肽、蛋白质、氨基酸链或用于指代两个或更多个氨基酸链的任何其它术语都包括在多肽”的定义中，并且术语多肽可用于代替或互换使用这些术语中的任何一个。术语多肽还旨在指本领域众所周知的多肽翻译后修饰的产物。术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指亲本多肽序列中特定位置的参考氨基酸被另一氨基酸取代、缺失或插入。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成dna技术，熟练的科学家可以轻松构建编码氨基酸变体
的dna。本文使用的术语“突变蛋白”是指例如根据seq id no:1的泛素或根据seq id no:2的双泛素或类似蛋白的衍生物，其因氨基酸交换、插入、缺失或其任何组合而不同于所述氨基酸序列，前提条件是所述突变蛋白对psma具有特异性结合亲和力。
[0043]
术语(navigo proteins gmbh的注册商标)是指非免疫球蛋白衍生的结合蛋白。
[0044]
术语“取代”被理解为一个氨基酸被另一个氨基酸交换。术语“插入”包含向原始氨基酸序列添加氨基酸。
[0045]
术语泛素是指根据seq id no:1的泛素，或是指seq id no:2的双泛素，以及是指具有至少95％同一性的蛋白，诸如，例如在位置45、75、76具有不影响与靶(psma)结合的点突变。
[0046]
术语结合“亲和力”和“结合活性”在本文中可互换使用，并且它们是指多肽结合另一蛋白质、肽或其片段或结构域的能力。结合亲和力通常由平衡解离常数(k
d
)测量和报告，该常数用于评估和排序双分子相互作用的强度。
[0047]
术语融合蛋白”是指包含至少第一蛋白质与至少第二蛋白质遗传连接的蛋白质。融合蛋白是通过连接两个或更多个最初编码不同蛋白质的基因而产生的。融合蛋白可以进一步包含不参与与靶结合的另外的结构域，诸如但不限于例如多聚化部分、多肽标签、多肽接头或与不同于psma的靶结合的部分。
[0048]
术语“氨基酸序列同一性”是指对两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)进行定量比较。相对于参考多肽序列的氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在将序列进行对比并且如果必要引入间隙以实现最大序列同一性百分比之后，序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定序列同一性，将查询蛋白质的序列与参考蛋白质或多肽的序列进行比对。序列比对的方法是本领域公知的。例如，为了确定任意多肽相对于氨基酸序列的氨基酸序列同一性程度，优选使用本领域已知的sim local相似性程序。对于多重比对分析，如本领域技术人员已知的，优选使用clustal omega。
[0049]
术语“多聚结合分子”是指包含至少两个、三个、四个、五个或更多个结合蛋白的结合蛋白。所述结合蛋白可以特异性地结合靶抗原上相同或重叠的表位，例如psma的重叠表位，或者它们可以与靶抗原上的不同表位结合，例如psma的不同表位。
[0050]
如本文所用的术语“缀合物”是指一种蛋白，其包含化学附接至另一物质诸如附接至非蛋白质(化学)部分或第二蛋白的至少第一蛋白，例如本发明的psma结合蛋白。
[0051]
术语“表位”包括能够被本文定义的结合蛋白结合的任何分子决定簇，并且是由结合蛋白结合的靶抗原(即psma)的区域，并且可以包括直接接触结合蛋白的特定氨基酸。
[0052]
本发明实施方式的详细描述
[0053]
psma结合蛋白的结构特征.本文定义的前列腺特异性膜抗原(psma)结合蛋白包含至少一个氨基酸结合基序，其选自由下述组成的组：gfahr、gwahr、sfahr、syahr、gfahl、wtttf、wtpsi、wteti、gdgdv、khntw、vayrp和wwnpn(seq id no:56
‑
61和72
‑
77)，或分别与其具有至少80％同一性的氨基酸基序。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含泛素(seq id no:1)的突变蛋白。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含从gfahr、gwahr、sfahr、syahr、gfahl、wtttf、wtpsi、wteti、gdgdv、khntw、vayrp和wwnpn或类似基序的组中选择的氨基酸
结合基序，其中结合基序的氨基酸残基对应于根据seq id no:1的泛素的第62、63、64、65、66位。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含根据seq id no:1的泛素的突变蛋白，其中泛素突变蛋白在对应于泛素(seq id no:1)的第62、63、64、65、66位的位置包含从gfahr、gwahr、sfahr、syahr、gfahl、wtttf、wtpsi、wteti、gdgdv、khntw、vayrp或wwnpn或类似基序中选择的至少一个氨基酸结合基序。
[0054]
具有基序wwnpn的psma结合蛋白
[0055]
在各个实施方式中，psma结合蛋白在泛素(seq id no:1)的第62、63、64、65、66位具有特征性氨基酸基序wwnpn。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含根据seq id no:1的泛素的突变蛋白，其中泛素突变蛋白在对应于泛素(seq id no:1)的第62、63、64、65、66位的位置包含氨基酸结合基序wwnpn，并且在对应于seq id no:1的第6、8、9、10、12、42、44、46、68、70、72位的位置包含进一步取代。在一些实施方式中，psma结合蛋白包含除q62w、k63w、e64n、s65p和t66n之外，由从k6y或k6w；l8r或l8a或l8k；t9a、t9v、t9e或t9q；g10l或g10f；t12q；r42m或r42k或r42t；i44f或i44k；a46k或a46r；h68s；v70n或v70d；r72d或r72n或r72g的组中选择的进一步取代所修饰的至少一种泛素突变蛋白，或者由上述至少一种泛素突变蛋白组成。在一些实施方式中，psma结合蛋白包含具有例如但不限于从e16a、e18g、i23v、k29r、q31r、k33r、i36t、k48r、l71r和l73r(例如参见seq id no:38、39、40、41、47、48、49、50、51)的组中选择的另外的1、2或3个取代的泛素突变蛋白。
[0056]
在各个实施方式中，psma结合蛋白包含在seq id no:1的氨基酸位置6、8、9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68、70和72具有取代的泛素突变蛋白，或者由所述泛素突变蛋白组成，其中泛素突变蛋白在位置62、63、64、65、66具有特征性的五氨基酸基序wwnpn。图1示出了在seq id no:1的位置6、8、9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68、70和72具有氨基酸取代的psma结合蛋白的例子。
[0057]
在一个实施方式中，psma结合蛋白包含从由seq id no:35
‑
51组成的组选择的一个或多个氨基酸，例如但不限于seq id no:40(affilin
‑
187191)(导致psma结合的与seq id no:1的差异用下划线表示)。
[0058]
mqifvytralkqitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqmlfwkgrqledgrtlsdyniwwnpnlslnldlraa。
[0059]
具有基序khntw或vayrp的psma结合蛋白
[0060]
在各个实施方式中，psma结合蛋白在泛素(seq id no:1)的位置62、63、64、65、66具有特征性的氨基酸基序khntw。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含由从泛素(seq id no:1)的r42h、i44y、q62k、k63h、e64n、s65t、t66w、h68e、v70m和r72f中选择的取代修饰的泛素突变蛋白，或由所述泛素突变蛋白组成。
[0061]
在各个实施方式中，psma结合蛋白在泛素(seq id no:1)的位置62、63、64、65、66具有特征性的氨基酸基序vayrp。在其它实施方式中，psma结合蛋白包含由从泛素(seq id no:1)的r42i、i44w、q62v、k63a、e64y、s65r、t66p、h68y、v70t和r72a中选择的取代修饰的泛素突变蛋白，或由所述泛素突变蛋白组成。
[0062]
在一些实施方式中，psma结合蛋白包含通过在泛素(seq id no:1)的氨基酸t9和g10之间插入4
‑
8个氨基酸，优选通过插入6个氨基酸进行另外修饰的泛素突变蛋白。在各个实施方式中，psma结合蛋白在位置9和10之间具有插入的6个氨基酸基序，其中处于第6位置
no:74)或类似基序，或者第二泛素部分具有基序wtttf或wtpsi或wteti或gdgdv或类似基序。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含两个泛素部分或由两个泛素部分组成，其中第一泛素部分具有基序gfahr或gwahr或sfahr或syahr或gfahl或类似基序，并且第二泛素部分具有基序wtttf或wtpsi或wteti或gdgdv或类似基序。图3示出了由两个泛素部分组成的psma结合蛋白中位置6、8、62、63、64、65、66的具体氨基酸的例子。在各个实施方式中，psma结合蛋白包含彼此融合的两个泛素突变蛋白，或者由彼此融合的两个泛素突变蛋白组成，所述两个泛素突变蛋白在对应于seq id no:1的位置6、8、62、63、64、65、66的氨基酸处具有取代，其中n
‑
末端定位的泛素突变蛋白具有对应于位置62、63、64、65、66的特征性五氨基酸基序gfahr或gwahr或sfahr或syahr或gfahl，并且c
‑
末端定位的泛素突变蛋白具有对应于位置62、63、64、65、66的特征性五氨基酸基序wtttf或wtpsi或wteti或gdgdv，如图3所示。
[0071]
在一些实施方式中，泛素突变蛋白具有从k6r或k6w；l8m、l8p、l8q、l8w、l8d、l8g、l8h或l8i；q62g、q62s或q62w；k63f、k63w、k63g、k63p或k63y；e64a或e64g；s65h或s65d；和t66r、t66q或t66l中选择的取代。在一些实施方式中，泛素突变蛋白具有从k6m、k6l、k6a或k6h；l8q、l8r、l8f、l8n或l8h；q62w或q62g；k63t、k63h或k63d；e64t、e64p、e64e或e64g；s65t、s65y或s65d以及t66f、t66i、t66l或t66v中选择的取代。
[0072]
在一些实施方式中，psma结合蛋白包含被进一步的取代另外修饰的泛素突变蛋白，例如但不限于泛素的位置10、11、33、48、48、51、74，在特定的实施方式中，例如选自泛素的g10q、k11q、k33t、k48t、e51a、r74c的组(例如参见seq id no:11、12、17、19)。
[0073]
在一些实施方式中，psma结合蛋白包含彼此连接的两个泛素突变蛋白，即psma结合蛋白包含双泛素(seq id no:2)的突变蛋白。
[0074]
在一个实施方式中，例如，psma结合蛋白包含从由seq id no:3
‑
24组成的组中选择的一个或多个氨基酸(导致psma结合的与seq id no:1或seq id no:2的差异用下划线表示)。
[0075]
seq id no:3(affilin
‑
162462)
[0076]
mqifvrtptgktitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrliwagkqledgrtlsdynigfahrlhlvlrlraamqifvmtqtgktitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrliwagkqledgrtlsdyniwtttflhlvlrlraa；
[0077]
seq id no:4(affilin
‑
191871)
[0078]
mqifvrtqtgktitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrliwagkqledgrtlsdynigwahrlhlvlrlraamqifvhtntgktitlevepsdtienvkakiqdkegippdqqrliwagkqledgrtlsdyniwtetilhlvlrlraa。
[0079]
本发明的psma结合蛋白包含从由seq id no:3
‑
55组成的组中选择的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方式中，psma结合蛋白包含展示与seq id no:3
‑
55的氨基酸序列中的一个或多个具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。例如但不限于，图1、图2和图3中示出了所选择的psma结合蛋白的氨基酸序列。
[0080]
在一些实施方式中，如本文公开的psma结合蛋白与seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列具有至少74％、75％、76％、77％、78％或79％的序列同一性。在各个实施方式中，本文公开的psma结合蛋白与seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列具有至少80％的
序列同一性。本文公开的psma结合蛋白与seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％或85％的序列同一性。在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与泛素(seq id no:1)或双泛素(seq id no:2)的氨基酸序列具有处在74％同一性和90％同一性之间的任何氨基酸同一性。
[0081]
在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与seq id no:3的氨基酸序列具有至少90％的任何氨基酸同一性。在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与seq id no:4的氨基酸序列具有至少90％的任何氨基酸同一性。在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与seq id no:25的氨基酸序列具有至少90％的任何氨基酸同一性。在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与seq id no:26的氨基酸序列具有至少90％的任何氨基酸同一性。在一些实施方式中，本文公开的psma结合蛋白可以与seq id no:40的氨基酸序列具有至少90％的任何氨基酸同一性。
[0082]
多聚体.在优选的实施方式中，psma结合蛋白是一种多聚体，包含多个如本文定义的psma结合蛋白。多聚体可以包含两个、三个、四个或更多个psma结合蛋白。在一个实施方式中，psma结合蛋白包含2、3、4或更多个彼此连接的psma结合蛋白，即psma结合蛋白可以是二聚体、三聚体或四聚体等。在一些实施方式中，多聚体是以上定义的psma结合蛋白的二聚体。在各个实施方式中，psma结合蛋白是同二聚体。本文所理解的同二聚psma结合蛋白是其中具有相同氨基酸序列的两个psma结合蛋白彼此连接的蛋白质。同二聚体可以是通过融合seq id no:3
‑
51的组中的任一个的或与其具有至少90％同一性的任何氨基酸序列的两个相同蛋白质来产生的。例如但不限于，seq id no:52(seq id no:3的二聚体)和seq id no:53(seq id no:25的二聚体)中例示了同二聚体。
[0083]
在其它实施方式中，多聚体是异质二聚体，例如psma结合蛋白的两个氨基酸序列不相同。例如，产生了如seq id no:54(seq id no:25与seq id no:3的二聚体，从n
‑
至c
‑
末端)和seq id no:55(seq id no:3与seq id no:25的二聚体，从n
‑
至c
‑
末端)所示的异质二聚体。
[0084]
在一些实施方式中，两个或更多个psma结合蛋白直接连接。在一些实施方式中，两个或更多个psma结合蛋白通过肽接头连接。在各个实施方式中，两个或更多个psma结合蛋白经由至多达30个氨基酸的肽接头连接。在其它实施方式中，两个或更多个psma结合蛋白经由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸的肽接头连接。在一个实施方式中，两个psma结合蛋白通过16个氨基酸连接。
[0085]
一个实施方式涉及一种包含从甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或脯氨酸的组中选择的至少两个或更多个的氨基酸的接头。在一些实施方式中，两个或更多个psma结合蛋白经由根据sapaaspspaapapspaspapaspasapsapasappaasa(seq id no:62)或paapapspaspapaspasaps(seq id no:63)中任何一个的氨基酸序列的肽接头或与其具有至少90％同一性的肽接头连接。用于融合蛋白质的其它接头是本领域已知的并且可以使用。
[0086]
功能特征.在一些实施方式中，通过facs测定，本文所述的psma结合蛋白结合细胞上表达的psma，和/或通过表面等离子共振测定法测定，对psma的结合亲和力为500nm或更小。
[0087]
在一些实施方式中，如本文所述的psma结合蛋白对psma的结合亲和力(k
d
)小于500nm。psma结合蛋白以小于500nm、小于200nm、小于100nm、小于50nm、小于20nm、小于10nm、
小于5nm和小于1nm的可测量结合亲和力结合psma。合适的方法是本领域技术人员已知的或在文献中描述的。确定结合亲和力的方法本身是已知的并且可以选自例如本领域已知的以下方法：酶联免疫吸附测定(elisa)，表面等离子体共振(spr)、动力学排除分析(kinexa测定)、生物层干涉测量(bli)、流式细胞术、荧光光谱技术、等温滴定量热法(itc)、分析超速离心法、放射免疫测定(ria或irma)和增强化学发光(ecl)。下面的实施例中描述了所述方法中的一些。通常，解离常数k
d
在20℃和30℃之间的温度范围内确定，例如在20℃、25℃或30℃下。如无特别说明，本文所述的k
d
值均在25℃下通过spr测定。k
d
值越低，生物分子对其结合伴侣的结合亲和力就越大。k
d
值越高，结合伴侣之间的结合就越弱。图1、图2、图3和实施例中提供了示例。本文所述的psma结合蛋白的结合对psma是高度特异的。泛素(seq id no:1)不结合psma。如通过表面等离子共振测定法确定的，本文所述的psma结合蛋白与psma结合，但不与人免疫球蛋白igg1的fc结构域可检测地结合。k
d
小于500nm的psma结合对于psma相关癌症的靶向医学应用可能很重要。另外，与psma结合的k
d
小于500nm的蛋白质可以具有降低的潜在毒副作用。在一些实施方式中，psma结合蛋白包含泛素突变蛋白，该泛素突变蛋白具有：(a)在对应于泛素(seq id no:1)的位置62、63、64、65和66的位置从gfahr、gwahr、sfahr、syahr、gfahl、wtttf、wtpsi、wteti、gheyl、gdgdv、khntw、vayrp和wwnpn中选择的五氨基酸残基基序，或与其具有80％同一性的基序；(b)与seq id no:1具有80％至93％的序列同一性；和(b)对psma的结合亲和力(k
d
)小于500nm。半数最大有效浓度ec
50
是指在指定暴露时间后诱导介于基线和最大值之间的一半响应的psma结合蛋白的浓度，因此代表了当观察到其最大效应的50％时的psma结合蛋白的浓度，在此种情况下，为细胞结合流式细胞实验中的半数最大荧光强度信号。在一些实施方式中，本文所述的psma结合蛋白对psma
‑
表达细胞的ec
50
小于100nm、小于50nm、小于20nm、小于10nm、小于5nm和小于1nm。在一些实施方式中，在37℃下在存在小鼠血清的情况下温育至少24小时后，本文所述的psma结合蛋白对psma
‑
表达细胞的ec
50
小于1nm。合适的方法是本领域技术人员已知的。ec
50
值越低，psma结合蛋白对psma的结合越大。表4提供了即使在血清存在下也稳定的psma结合蛋白的例子。
[0088]
在一些实施方式中，如本文所述的psma结合蛋白在至高达85℃的高温下稳定。对于稳定性分析，例如与化学或物理解折叠相关的基于光谱或荧光的方法是本领域技术人员已知的。例如，分子的稳定性可以通过使用标准方法测量热熔(t
m
)温度来确定，即一半分子解折叠时的温度，单位为摄氏度(℃)。通常，t
m
越高，分子越稳定。通过差示扫描荧光法(dsf)确定温度稳定性，如实施例和图1、图2、图3中进一步详细描述的。
[0089]
比较psma结合蛋白的竞争结合实验显示，具有不同基序的psma结合蛋白可以结合不相同或不重叠的表位(见实施例)。例如，具有基序khntw的seq id no:25结合的表位不同于具有基序gfahr和wtttf的seq id no:15。因此，某些psma结合蛋白不竞争psma结合，并且特别适用于某些诊断或治疗应用。
[0090]
通过使用psma过表达细胞的细胞psma结合分析进行了另外的功能表征。免疫荧光显微术和流式细胞术分析证实了本文所述的psma结合蛋白与来自人源的psma
‑
阳性肿瘤细胞系和与活细胞上的psma的特异性结合(见实施例)。
[0091]
偶联位点.在一些实施方式中，本文所述的psma结合蛋白进一步包含用于偶联化学部分的一个或多个偶联位点。偶联位点能够与其它化学基团反应，以将psma结合蛋白与
化学部分偶联。偶联位点的确定数目和确定位置使得化学部分与本文所述的psma结合蛋白能够位点特异性偶联。因此，如果需要，可以将大量化学部分结合至psma结合蛋白。本领域技术人员可以将偶联位点的数量调整至适用于某一应用的最佳数量，从而相应地调整化学部分的数量。在选择的实施方式中，偶联位点可以选自可以用特定化学标记的一个或多个氨基酸的组，诸如一个或多个半胱氨酸残基、一个或多个赖氨酸残基、一个或多个酪氨酸残基、一个或多个色氨酸残基、或一个或多个组氨酸残基。psma结合蛋白可以包含1至20个偶联位点，诸如1至6个偶联位点，诸如2个偶联位点，或一个偶联位点。
[0092]
偶联结构域.一个实施方式提供了一种psma结合蛋白，其包含：包含一个或多个偶联位点的1至80个氨基酸的至少一个偶联结构域。在一些实施方式中，1至80个氨基酸的偶联结构域可以包含丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸以及作为偶联位点的半胱氨酸。seq id no:5中提供了具有氨基酸sac偶联结构域的psma结合蛋白的一个例子(具有c
‑
末端氨基酸sac的affilin
‑
191871)。在其它实施方式中，1至80个氨基酸残基的偶联结构域可以由丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和作为偶联位点的半胱氨酸组成。在一个实施方式中，偶联结构域由20
‑
60％丙氨酸、20
‑
40％脯氨酸、10
‑
60％丝氨酸和在如本文所述的psma结合蛋白c
‑
或n
‑
末端作为偶联位点的一个或多个半胱氨酸残基组成。在一些实施方式中，氨基酸丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸随机分布在整个偶联结构域氨基酸序列中，使得不超过最多2、3、4或5个相同的氨基酸残基相邻，优选最多3个氨基酸。1至20个偶联结构域的组成可以不同或相同。具有偶联位点(半胱氨酸)的偶联结构域的选定实例的氨基酸组成在表1中示出。
[0093]
表1.偶联结构域的实例的氨基酸组成
[0094][0095]
在一些实施方式中，化学部分选自螯合剂、药物、毒素、染料和小分子中的任何一种。在一些实施方式中，至少一个化学部分是设计为络合剂的螯合剂，用于将一个或多个其它部分与目标化合物偶联到本文公开的psma结合蛋白。一个实施方式涉及一种psma结合蛋白，其中螯合剂是用于偶联一种或多种放射性同位素或其它可检测标记的络合剂，如实施例中所述。
[0096]
诊断部分.在各个实施方式中，psma结合蛋白进一步包含诊断部分。在其它实施方式中，psma结合蛋白进一步包含多于一个诊断部分。在一些实施方式中，此类诊断部分可以选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶、或上述的任何组合。在一些实施方式中，可以采用包含至少一个诊断部分的psma结合蛋白例如作为成像剂，例如评估肿瘤细胞或转移的存在、肿瘤分布和/或肿瘤复发。检测或监测癌细胞的方法涉及成像方法。此类方法涉及通过例如放射成像或光致发光或荧光来成像psma相关癌细胞。
[0097]
治疗部分.在各个实施方式中，psma结合蛋白进一步包含治疗性活性部分。在其它实施方式中，psma结合蛋白进一步包含多于一个治疗性活性部分。在一些实施方式中，此类治疗性活性部分可以选自单克隆抗体或其片段、结合蛋白诸如泛素突变蛋白(affilin)、受体的胞外结构域或其片段、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶或其衍生物、或上述的任何组合。在一些实施方式中，包含治疗性活性组分的psma结合蛋白可以用于将任何上列组分靶向递送至psma表达肿瘤细胞并且在其中积聚，由此对正常细胞产生较低水平的毒性。
[0098]
放射性核素.适用于体内或体外成像或放射疗法的放射性核素包括例如但不限于γ发射同位素组、正电子发射体组、β发射体组和α发射体组。在一些实施方式中，合适的缀合配偶体包括螯合剂如1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7,10
‑
四乙酸(dota)或二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或它们的活化衍生物、纳米颗粒和脂质体。在各个实施方式中，dota可适合作为放射性同位素的络合剂和其它成像剂，如实施例中进一步详细描述的。
[0099]
调节药代动力学的部分.在一些实施方式中，psma结合蛋白进一步包含至少一种调节药代动力学的部分，其任选地选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合蛋白、免疫球蛋白结合蛋白或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖(例如羟乙基淀粉)、或增加流体动力学半径的非结构化氨基酸序列，例如包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的多聚体。在各个实施方式中，所述部分将psma结合蛋白的半衰期增加至少1.5倍。生产具有延长半衰期的psma结合蛋白的多种技术是本领域已知的，例如调节药代动力学的部分与上述psma结合蛋白的直接融合或化学偶联方法。调节药代动力学的部分可以通过肽接头序列或通过如上所述的偶联位点附接在例如psma结合蛋白的一个或多个位点上。
[0100]
可以应用本领域众所周知的化学方法进行蛋白质或非蛋白质部分与psma结合蛋白的缀合。在一些实施方式中，可以适用专用于半胱氨酸或赖氨酸残基衍生化的偶联化学。化学偶联可以通过本领域技术人员众所周知的化学进行，包括但不限于取代、加成或环加成或氧化化学(例如二硫化物形成)。
[0101]
用于纯化/检测的分子.在一些实施方式中，可以在psma结合蛋白的n
‑
末端或c
‑
末端或两者处延伸另外的氨基酸。另外的序列可以包括例如引入例如用于纯化或检测的序列。在一个实施方式中，另外的氨基酸序列包括向某些色谱柱材料赋予亲和性的一个或多个肽序列。此类序列的典型例子包括但不限于链球菌标签(strep
‑
tag)(见例如seq id no:71)、寡聚组氨酸
‑
标签、谷胱甘肽s
‑
转移酶、麦芽糖
‑
结合蛋白、内含肽、内含肽片段或蛋白g的白蛋白结合域。
[0102]
在医学中的用途.各个实施方式涉及如本文所公开的psma结合蛋白用于医学。在一个实施方式中，psma结合蛋白在医学中使用以诊断或治疗与psma表达相关的癌症。如本文所公开的psma结合蛋白允许选择性诊断和治疗psma相关的癌细胞或癌组织。已知psma在肿瘤细胞中被上调。psma在前列腺癌及其转移(例如选自但不限于肝、甲状腺、b
‑
细胞滤泡性淋巴瘤、淋巴结和骨转移)以及其它实体瘤(优选选自乳腺癌、肾脏癌/肾癌、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌和胃癌)中高表达。
[0103]
一个实施方式是一种诊断(包括监测)患有psma相关癌症的受试者的方法，该诊断(监测)方法包括向受试者施用所述的psma结合蛋白，该psma结合蛋白任选地与放射性分子缀合。在各个实施方式中，如本文公开的psma结合蛋白可以用于诊断psma相关癌症，任选地
其中，psma结合蛋白与放射性分子缀合。在一些实施方式中，使用具有标签(如放射性或荧光标签)的psma结合蛋白的成像方法可以用来可视化特定组织或细胞上的psma，例如以评估psma相关肿瘤细胞的存在、psma相关肿瘤分布、psma相关肿瘤的复发和/或评估患者对治疗性治疗的响应。
[0104]
一个实施方式是一种治疗患有psma相关癌症的受试者的方法，所述治疗方法包括向受试者施用所述的psma特异性结合蛋白，该psma特异性结合蛋白任选地缀合至放射性分子和/或细胞毒剂。在各个实施方式中，如本文所公开的psma结合蛋白可以用于治疗psma相关癌症，任选地其中psma结合蛋白缀合至细胞毒剂和/或放射性分子。一些实施方式涉及使用适合的放射性同位素或细胞毒性化合物标记的psma结合蛋白用于治疗psma相关肿瘤细胞的用途，特别地用于控制或杀死psma相关的肿瘤细胞，例如恶性细胞。在一个实施方式中，将治疗剂量的辐射选择性地递送到psma相关的肿瘤细胞，而不是正常细胞。
[0105]
组合物.各个实施方式涉及一种包含本文所公开的psma结合蛋白的组合物。包含上文定义的psma结合蛋白的组合物用于医学，优选用于诊断或治疗各种psma相关癌症肿瘤，诸如前列腺癌及其转移、肝、甲状腺、b
‑
细胞滤泡性淋巴瘤、淋巴结和骨转移、肾脏癌/肾癌、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌等。包含上述psma结合蛋白的组合物可以用于诊断和治疗目的的临床应用。特别地，包含上述psma结合蛋白的组合物可以用于对表达psma的病理细胞进行成像、监测和消除或灭活的临床应用。各个实施方式涉及一种用于诊断psma相关癌症的诊断组合物，包含本文定义的psma结合蛋白和诊断上可接受的载体和/或稀释剂。这些包括例如但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。所述组合物可以是液体制剂、冻干剂、颗粒剂的形式，乳剂或脂质体制剂的形式。
[0106]
包含本文所述的psma结合蛋白的诊断组合物可以用于诊断psma相关癌症，如上所述。
[0107]
各个实施方式涉及一种用于治疗疾病的药物(例如治疗性)组合物，包含如本文所公开的psma结合蛋白以及药学上(例如治疗上)可接受的载体和/或稀释剂。所述药物(例如治疗性)组合物可任选地包含本身已知的其它辅助剂和赋形剂。这些包括例如但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。
[0108]
包含本文定义的psma结合蛋白的药物组合物可以用于治疗疾病，如上所述。
[0109]
所述组合物含有有效剂量如本文定义的psma结合蛋白。待施用的蛋白质的量取决于生物体、疾病类型、患者年龄和体重以及本身已知的其它因素。取决于盖仑制剂(galenic preparation)，这些组合物可以通过注射或输注肠胃外施用、全身施用、腹膜内施用、肌内施用、皮下施用、透皮施用，或通过其它常规使用的施加方法施用。
[0110]
所述组合物可以是液体制剂、冻干剂、乳膏、局部用洗剂、气雾剂的形式，粉剂、颗粒剂的形式，乳剂或脂质体制剂的形式。制剂的类型取决于疾病的类型、施用途径、疾病的严重程度、患者和医学领域技术人员已知的其它因素。
[0111]
组合物的各种组分可以包装成带有使用说明的试剂盒。
[0112]
psma结合蛋白的制备.本文所述的psma结合蛋白可以通过许多常规和众所周知的技术中的任何一种来制备，诸如普通有机合成策略、固相辅助的合成技术、片段连接技术或通过市售的自动合成仪。另一方面，它们也可以通过单独的常规重组技术或与常规合成技术结合来制备。另外，它们也可以通过无细胞体外转录/翻译制备。各个实施方式涉及一种
编码如本文公开的psma结合蛋白的多核苷酸。一个实施方式进一步提供了一种包含所述多核苷酸的表达载体，以及一种包含所述分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
[0113]
各个实施方式涉及一种生产本文公开的psma结合蛋白的方法，包括在允许表达所述psma结合蛋白的适合条件下培养宿主细胞和任选地分离所述psma结合蛋白。
[0114]
例如，可以在适合的宿主中表达编码psma结合蛋白的一种或多种多核苷酸，并且可以分离出所生产的psma结合蛋白。宿主细胞包含所述核酸分子或载体。合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物。载体是指可用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。各种细胞培养系统，例如但不限于哺乳动物、酵母、植物或昆虫，也可用于表达重组蛋白。用于培养原核或真核宿主细胞的合适条件是本领域技术人员熟知的。可以在从小体积摇瓶到大发酵罐的任何规模下，应用本领域技术人员熟知的技术，进行细胞培养和蛋白质表达以产生蛋白质。
[0115]
一个实施方式涉及一种制备如上详述的结合蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(a)制备编码本文定义的psma结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸引入表达载体；(c)将所述表达载体引入宿主细胞；(d)培养宿主细胞；(e)使宿主细胞经历表达psma结合蛋白的培养条件，由此生产如本文定义的psma结合蛋白；(f)任选地分离步骤(e)中生产的psma结合蛋白；和(g)任选地将psma结合蛋白与本文定义的其它功能部分缀合。
[0116]
一般而言，可应用本领域众所周知的常规方法和技术从培养混合物中分离纯化的psma结合蛋白，诸如离心、沉淀、絮凝、不同实施方式的色谱、过滤、透析、浓缩及其组合等。色谱方法是本领域公知的并且包含但不限于离子交换色谱、凝胶过滤色谱(尺寸排阻色谱)或亲和色谱。
[0117]
为了简化纯化，可以将psma结合蛋白融合至对分离材料具有增加的亲和力的其它肽序列。优选地，选择的此类融合不会对psma结合蛋白的功能产生不利影响，或者由于引入了特定的蛋白酶切割位点而可以在纯化后分离。此类方法也是本领域技术人员已知的。
[0118]
实施例
[0119]
提供以下实施例以进一步说明本发明。本发明特别地通过泛素(seq id no:1或seq id no:2)的特定修饰来举例说明，导致与psma结合。然而，本发明并不限于此，并且以下实施例仅在上述描述的基础上示出本发明的实用性。
[0120]
实施例1.psma结合蛋白的鉴别
[0121]
文库构建和克隆.包含随机氨基酸位置的泛素文库是通过三重技术(morphosys slonomics,德国)合成的或是由合成三核苷酸亚磷酰胺(ella biotech)生成的随机寡核苷酸内部合成的，以实现均衡的氨基酸分布，同时在随机位置排除半胱氨酸和其它氨基酸残基。
[0122]
使用多个文库来鉴别psma结合蛋白
[0123]
文库spv2：在氨基酸位置6、8、9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68、70和72随机化的泛素(seq id no:1)。
[0124]
文库spl27：对应于位置62、63、64、65、66、68、70和72的氨基酸随机化并且在泛素的t9和g10之间引入了插入的六个随机氨基酸的泛素(seq id no:1)。插入中省略了出现的氨基酸残基cys、iie、leu、val和phe。
[0125]
文库spvf19：在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、66、68、70、72、82、84、138、139、140、
141、142随机化的双泛素(seq id no:2)(这对应于两个泛素部分中位置6、8、62、63、64、65、66的随机化；在文库spvf19中，两个泛素部分直接连接)。
[0126]
相应的cdna文库通过pcr扩增并使用技术人员已知的标准方法与经修饰的pcd87sa噬菌粒(本文称为pcd12)连接。pcd12噬菌粒包含经修饰的tora前导序列以实现蛋白质加工，而无需在n
‑
末端添加额外氨基酸。将等分试样的连接混合物用于大肠杆菌er2738(lucigen)的电穿孔。除非另有说明，否则使用已建立的重组遗传方法，例如sambrook,j&russel,d.w.[2001](冷泉港实验室(cold spring harbor laboratory)，ny中所述。
[0127]
靶表达、纯化和分析.将编码人类psma的胞外结构域的dna序列(uniprot登录号q04609；残基45
‑
750)与人类igg1的fc区进行基因融合，随后在n
‑
末端添加his
‑
标签。使用人类密码子的全长cdna由geneart(thermo scientific)提供，克隆到哺乳动物表达载体pcep4中，并在摇瓶中以250ml的规模在哺乳动物expi293f细胞中表达。通过sds
‑
page并通过使用针对psma和人类igg1的fc
‑
部分的抗体进行的免疫印迹分析来分析表达。将130ml大规模表达的细胞培养上清液离心并过滤，用于施加在蛋白a hp 1ml柱(ge healthcare)上进行亲和层析。靶蛋白通过温和的ph变化(ph 4)洗脱并施加到superdex xk16/600凝胶过滤柱上。可以回收9mg his
‑
fc
‑
psma；sds
‑
page分析和se
‑
hplc分析证实了靶蛋白的纯度。确认了靶蛋白对底物n
‑
乙酰基
‑
l
‑
天冬氨酰
‑
l
‑
谷氨酸(naag)的酶活性。
[0128]
通过tat噬菌体展示进行初级选择.使用tat噬菌体展示作为选择系统针对靶psma富集幼稚文库。在用携带所述文库的噬菌粒pcd12转化感受态细菌er2738细胞(lucigene)后，使用技术人员已知的标准方法进行噬菌体扩增和纯化。为了进行选择，在蛋白a或蛋白g上将靶蛋白固定为人类psma的细胞外结构域的fc融合物。噬菌体温育期间的目标浓度从200nm(第一轮)降低到100nm(第二轮)和50nm(第三轮)和25nm(第四轮)。在一些选择轮次中，添加小鼠血清以选择血清稳定性增加的分子。将靶噬菌体复合物与上清液磁性分离并洗涤数次。通过胰蛋白酶洗脱靶结合的噬菌体。为了耗尽fc
‑
结合变体的噬菌体文库，在第二轮和第三轮之前，进行了具有固定化igg1的fc片段的噬菌体的预选(athens research&technology)。为了鉴别靶特异性噬菌体库(pool，池)，通过噬菌体库elisa分析每一轮选择的洗脱和重新扩增的噬菌体。分别使用psma
‑
fc(2.5μg/ml)和igg1的fc
‑
片段(2.5μg/ml)包被中等结合微量滴定板(greiner bio
‑
one)的孔。使用α
‑
m13hrp
‑
缀合的抗体(ge healthcare)检测结合的噬菌体。
[0129]
将靶结合噬菌体库克隆到表达载体中.在噬菌体库elisa中显示与靶标特异性结合的选择库根据本领域已知的方法通过pcr扩增，用适当的限制性核酸酶切割并连接到包含链球菌标签ii(iba gmbh)的表达载体pet
‑
28a(merck,德国)的衍生物中。
[0130]
单菌落命中分析.bl21(de3)细胞(merck,德国)转化后，生长卡那霉素抗性单菌落。通过在384孔板(greiner bio
‑
one)中使用自动诱导培养基培养实现靶向结合修饰的泛素变体的表达。收获细胞，随后分别通过bugbuster试剂(novagen)化学或酶促裂解细胞，和通过冷冻/解冻循环机械裂解细胞。离心后，在高结合384elisa微量滴定板(greiner bio
‑
one)上用固定化靶标通过elisa筛选得到的上清液。通过hrp缀合物(iba gmbh)与tmb
‑
plus底物(biotrend，德国)结合检测结合的蛋白。通过添加0.2m h2so4溶液终
止反应，并在酶标仪中在450nm和620nm处测量。
[0131]
成熟文库的构建.为了使每个选定的变体成熟，使用了模块改组方法，其中结合分子被分成两个模块。对于基于seq id no:1的泛素突变蛋白，第一模块包含氨基酸1
‑
40并且第二模块包含氨基酸32
‑
76。对于基于seq id no:2的双泛素突变蛋白，第一模块包含氨基酸1
‑
77并且第二模块包含氨基酸71
‑
152。对于模块改组成熟文库的克隆，变体之一的模块保持不变并与原始文库的原生第二模块融合，反之亦然。通过重叠延伸pcr实现两个模块的融合。如上所述将获得的成熟文库的cdna与pcd12连接。可替代地，使用容易出错的pcr方法，其中在预先定义的分子或库中诱导了另外的突变。
[0132]
成熟度选择和分析.为了亲和力成熟，进行了两轮淘选。对于两轮，都使用igg1的fc片段进行了预选。在一些选择轮中，添加小鼠血清以选择血清稳定性增加的分子。为了分析成熟的和选择的库的特异性靶结合，进行噬菌体库elisa，然后将阳性库克隆到表达载体pet
‑
28a中并如上所述进行命中elisa。
[0133]
实施例2.psma结合蛋白的表达和纯化
[0134]
使用本领域技术人员已知的标准方法将psma结合分子克隆到表达载体中，如下所述进行纯化和分析。
[0135]
在t7启动子的调控下，使用低拷贝质粒系统在大肠杆菌bl21(de3)中表达所有构建体。在培养基(自诱导培养基)中包含的乳糖诱导后，蛋白质以大部分可溶形式在细胞质中产生。在用确定的质粒进行新鲜转化后，从单个集落接种所有过夜培养物。根据studier et al.(2005)在zym5052自诱导培养基中生产psma结合蛋白。过夜培养物在摇瓶中以20
‑
100ml的体积在2xyt培养基中生长至饱和。将主要培养物接种至od600为0.05至0.1，并在带有或不带有挡板的摇瓶中在旋转振荡器上以200rpm的速度在具有50μg/ml卡那霉素的zym5052中在30℃下温育长达24小时。取决于表达水平，无论是在1l摇瓶中(每瓶350ml培养基)还是在5l瓶中(每瓶1l培养基)。
[0136]
通过亲和色谱和凝胶过滤纯化带有亲和标签的affilin蛋白。亲和色谱纯化后，使用系统和superdex
tm 200hiload 16/600柱(ge healthcare)进行尺寸排阻色谱(se hplc或sec)。色谱柱体积为120ml，用2cv平衡。以1ml/min的流速施加样品。当信号强度达到10mau时开始馏分收集。在sds
‑
page分析后，合并阳性级分并测量它们的蛋白质浓度。
[0137]
使用阳离子交换色谱(sp sepharose hp,ge healthcare)，随后使用阴离子交换色谱(q sepharose hp,ge healthcare)纯化不具有亲和标签的二聚psma结合蛋白，以减少内毒素的量。
[0138]
最后，进行尺寸排阻色谱(sephacryl s200hr,ge healthcare)。进一步分析包括sds
‑
page、se
‑
hplc和rp
‑
hplc。使用摩尔吸光系数，通过280nm处的吸光度测量确定蛋白质浓度。例如，根据se
‑
hplc，seq id no:5的纯度为98％。使用dionex hplc系统和plrp
‑
s(5μm,)柱(agilents)进行了rp色谱(rp
‑
hplc)。
[0139]
实施例3.psma结合蛋白在高温下是稳定的
[0140]
通过差示扫描荧光测定法(dsf)确定了本发明的结合蛋白的热稳定性。每个样品以0.1μg/μl的浓度转移到480多孔板96(roche)中，并且以适合的稀释度添加sypro橙色染料。以每分钟1℃的加热速率程控从20到90℃的温度斜坡(
480,roche)。持续测量在465nm激发波长和580nm发射波长下的荧光(480,roche)。图1、图2和图3显示了所选突变蛋白的热解折叠的转变中点(tm，熔点)。本发明的psma结合蛋白具有高达85℃的熔化温度。seq id no:5的t
m
为69.3℃且seq id no:6的t
m
为84.2℃。所选二聚psma结合蛋白的温度稳定性见表2。
[0141]
实施例4.psma结合蛋白的分析(表面等离子体共振，spr)
[0142]
cm5传感器芯片(ge healthcare)用spr运行缓冲液平衡。通过使edc和nhs的混合物通过以产生反应性酯基团来活化表面暴露的羧基。将700
‑
1500ru psma
‑
fc(在配体上)固定在流动池上，将igg
‑
fc(脱离配体)固定在另一流动池上，与靶的比率为1:3(higg
‑
fc:靶)。配体固定后注入乙醇胺用于封闭未反应的nhs基团。配体结合后，蛋白质分析物积聚在表面上，增加了折射率。折射率的这种变化是实时测量的，并绘制为响应或共振单位(ru)与时间的关系曲线。分析物以30μl/min的流速以连续稀释施加到芯片上。结合进行120秒，并且解离进行360秒。每次运行后，芯片表面用30μl再生缓冲液再生，并用运行缓冲液平衡。稀释系列用作阳性对照，而未修饰的泛素的稀释系列代表了阴性对照。将对照样品以30μl/min的流速施加到基质上，而它们结合60秒并且解离120秒。如前所述进行再生和重新平衡。通过使用biacore 3000(ge healthcare)进行结合研究；通过使用朗缪尔1:1模型(ri＝0)，通过制造商提供的biaevaluation 3.0软件运行数据评估。使用1:1朗缪尔模式拟合数据后，例如计算了k
d
值并且示于图1、图2、图3和表2中。评估的解离常数(k
d
)针对脱靶进行了标准化，并示出。例如，seq id no:5相对于hpsma
‑
fc(通过蛋白a固定的1100ru)的k
d
为1.8nm，seq id no:6的k
d
为113nm，seq id no:22的k
d
为484nm，seq id no:45的k
d
为33nm且seq id no:26的k
d
为9.3nm。表2示出了通过spr确定的结合亲和力以及二聚psma结合蛋白的温度稳定性(见实施例3)。
[0143]
表2.二聚psma结合蛋白的结合亲和力和温度稳定性
[0144][0145]
实施例5.功能表征：结合细胞表面表达的psma(流式细胞术)
[0146]
使用流式细胞术来分析psma结合蛋白与细胞表面暴露的psma的结合。使用了过表达psma的人类前列腺癌细胞系lncap、过表达psma转染的hek293
‑
psma细胞、不表达psma的pc3细胞和空载体对照hek293
‑
pentry细胞。使细胞被胰蛋白酶消化并重悬在含有fcs的培养基中，洗涤和在预冷的facs封闭缓冲液中染色。制备细胞浓度为1x106个细胞/ml用于细胞染色，并分别将100μl填充到96孔板(greiner)的孔中，每个细胞系一式三份。在多个实验中，将不同浓度，例如50nm的psma结合蛋白或0.5μg/ml单克隆抗人
‑
psma抗体(克隆lni
‑
17；biolegend；342502)作为阳性对照添加到psma过表达和对照细胞中。psma结合蛋白包括用于纯化和检测目的的c
‑
末端链球菌标签(参见例如seq id no:71)。45分钟后，去除上清液并且添加在facs封闭缓冲液中以1:300稀释的100μl/孔兔抗链球菌标签抗体(获自genscript；a00626)。在阳性对照孔中用1:1000稀释的抗小鼠
‑
igg
‑
alexa 488(invitrogen；a
‑
10680)检测抗
‑
psma抗体。在从其它孔中去除抗链球菌标签抗体后，以1:
1000稀释度施加山羊抗兔igg alexa fluor 488抗体(获自invitrogen；a11008)。在来自merck
‑
millipore的guava easycyte 5ht装置上，在激发波长488nm和发射波长525/30nm下进行流式细胞术测量。本发明的所有psma结合蛋白(包括二聚体)显示与lncap
‑
细胞和hek293
‑
psma
‑
细胞上表面表达的psma的结合(见图1、图2、图3；结合在图中以“是”示出)，并且在psma
‑
阴性细胞系hek293
‑
pentry或pc3细胞上无结合。泛素显示在lncap
‑
细胞和hek293
‑
psma
‑
细胞上无结合。还观察到抗
‑
psma抗体与psma表达细胞的阳性结合。例如，seq id no:4显示出与hek
‑
psma和lncap细胞的强细胞结合。
[0147]
实施例6.与细胞表面表达的psma结合(免疫细胞化学和荧光显微镜)
[0148]
在psma表达lncap
‑
细胞和对照细胞系pc3(无psma表达)上测试了50nm的浓度。将双泛素用作非
‑
psma
‑
结合蛋白的对照并且1μg/ml抗
‑
psma
‑
ab用作psma结合的阳性对照。细胞以1x105个细胞/ml的浓度接种在聚
‑
d
‑
细胞溶解酶包被的腔体载玻片(sigma
‑
aldrich)中。培养72小时后，细胞用甲醇固定(5min,
‑
20℃)，随后进行封闭(5％在pbs中的胎马血清，1h)并且在室温下使用50nm psma结合蛋白温育45分钟。通过用兔抗链球菌标签抗体(1:500)温育1小时，随后用抗兔
‑
igg
‑
alexa488
‑
抗体(1:1000)温育1小时，检测psma结合。用4μg/ml dapi将细胞核染色。所有温育步骤均在室温下进行。确认了二聚体seq id no:54、二聚体seq id no:55和单体seq id no:25在lncap细胞上的psma结合，而未能够观察到与pc3细胞的结合。
[0149]
实施例7.功能表征：psma结合蛋白与肿瘤组织上表达的psma结合(免疫组织化学)
[0150]
使用冷冻lncap
‑
异种移植
‑
肿瘤和f9
‑
同种移植
‑
肿瘤切片的组织切片来分析本发明的结合蛋白。组织切片用冰冷的丙酮固定10分钟。psma结合蛋白的二聚体包括用于纯化和检测目的的c
‑
末端链球菌标签(见例如seq id no:71)。在封闭以及使用50nm和10nm的seq id no:54的二聚体、100nm和10nm的seq id no:52与seq id no:53的二聚体、和100nm对照蛋白未修饰的双泛素温育后，使用兔抗链球菌标签抗体(1:500)温育切片1小时。然后使用novolinktm聚合物(leica,re7290
‑
ce)处理切片。使用aec溶液(dako)温育切片1分钟以可视化蛋白质的结合。细胞核用mayer苏木精明矾(hemalum)溶液染色(merck millipore,目录号(cat
‑
no.)109249)。所有温育步骤均在室温下完成。2μg/ml抗
‑
psma
‑
ab gcp
‑
04(novus biologicals)和14μg/ml gcp
‑
05(thermo scientific)用作阳性对照。确认了lncap
‑
肿瘤组织上50nm异质二聚体(seq id no:54)和100nm同二聚体(seq id no:52与seq id no:53)的强psma结合。抗
‑
psma
‑
抗体gcp
‑
04和gcp
‑
05显示相同的染色模式，而未修饰的泛素未显示染色。未观察到f9
‑
肿瘤组织上的非特异性染色。
[0151]
实施例8.psma结合蛋白的竞争分析
[0152]
为了研究分离的psma
‑
affilin蛋白是否与相同或不同的psma表位结合，进行了以下测定：将psma
‑
fc融合蛋白(60nm)固定在cm5 biacore芯片上，该芯片使用nhs/edc化学与重组蛋白a偶联，产生了1000个响应单位(ru)。在第一实验中，以一个定义的浓度(0.5μm)在30μl/min pbst 0.005％吐温20的流速下注入seq id no:25(基序khntw)和seq id no:15(基序gfahr和wtttf)。在第二实验中，相同的流道首先预加载500nm seq id no:25直到芯片表面饱和。在下一步中，以与第一实验中相同的方式施加500nm seq id no:15。可替代地，在第二实验中，相同的流道首先预加载500nm seq id no:15直到芯片表面饱和，然后加载500nm seq id no:25。
[0153]
该实验表明，具有基序khntw的psma结合蛋白的结合不受存在的具有基序gfahr和wtttf的psma结合蛋白的影响，反之亦然。因此，没有观察到竞争，得出的结论是这些psma结合蛋白与不同或不重叠的psma表位结合，即与不同的表面暴露氨基酸结合。
[0154]
实施例9：用dota标记融合蛋白
[0155]
在室温下，在50mm hepes、150mm氯化钠、5mm edtaph 7.0中使用20
‑
倍过量的马来酰亚胺
‑
dota(2,2',2"
‑
(10
‑
(2
‑
((2
‑
(2,5
‑
二氧代
‑
2,5
‑
二氢
‑
1h
‑
吡咯
‑1‑
基)乙基)氨基)
‑2‑
氧代乙基)
‑
1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三基)三乙酸，chematech)将二聚体蛋白温育3小时。为了减少可能与dota分子相互作用的金属离子，用0.1m edta溶液将所有色谱柱和akta装置(ge healthcare)温育30分钟。为了制备溶液，仅使用不含金属或减少金属的组分。温育后，通过凝胶过滤(superdex s200，ge healthcare)在100mm乙酸钠ph 5.0
‑
5.8中将样品与未结合的dota分子分离。标记的蛋白质的样品也在室温下用5mm氯化铁(ii)温育1小时，以证明dota分子可用于与放射性同位素偶联。温育后，使用hitrap脱盐柱(ge healthcare)去除未结合的铁。maldi
‑
tof分析用于确定标记程度。
[0156]
实施例10：基质辅助激光解吸/电离质谱(maldi
‑
tof)质谱
[0157]
如下进行基质辅助激光解吸/电离质谱(maldi
‑
tof ms)：使用c18
‑
p10
‑
ziptips(millipore；目录号ztc18s096)纯化和浓缩融合蛋白。使用0.1％(v/v)在水中的三氟乙酸(tfa)洗涤尖端并且使用50％(v/v)乙腈/0.1％tfa洗脱。使用2％(v/v)在水中的tfa处理样品并且包埋在2,5
‑
二羟基苯乙酮(dhap)基质(bruker，目录号8231829)中。在autoflextm速度质谱仪(bruker)上测量融合蛋白的质量。使用蛋白质校准标准品(bruker，料号8206355和料号8207234)调谐autoflex速度质谱仪。
[0158]
通过maldi
‑
tof质谱分析有和没有dota标记的融合蛋白并比较峰。maldi
‑
tof分析显示，标记到二聚psma结合蛋白的dota分子可用于与氯化铁(ii)分子偶联。
[0159]
尽管标记融合蛋白后k
d
略有改变，但标记不会显著影响融合蛋白对靶标的亲和力。结果总结在表3中。
[0160]
表3.使用spr进行标记的psma结合蛋白的亲和力分析
[0161]
seq id no:标记mr
计算
mr
实验
靶亲和力k
d
5无
ꢀꢀ
1.8nm5dota
ꢀꢀ
4.2nm52无43027da43019da2.94e
‑
13m52dota44080da44072da2.99e
‑
14m52dota 铁44192da44178da未检测到(n.d.)54无35209da35216da6.32e
‑
12m54dota36263da36266da6.39e
‑
10m54dota 铁36374da36363da未检测到55无27391da27384da8.27e
‑
14m55dota28444da28433da2.04e
‑
13m55dota 铁28556da28535da未检测到
[0162]
实施例11.psma结合蛋白的血清稳定性(流式细胞术)
[0163]
分析了即使在血清存在下psma结合蛋白的稳定性。psma结合蛋白包括用于纯化和
检测目的的c
‑
末端flag
‑
标签(dykddddk；见例如seq id no:78)。在37℃下，在100％小鼠血清中，以从1μm至5.6pm的稀释系列将基于具有gfahr或与其具有80％同一性的基序的泛素突变蛋白(例如seq id no:4或seq id no:11)的psma结合蛋白温育0小时或24小时。将100μl affilin
‑
血清溶液用于分析hek293
‑
psma
‑
细胞上的血清稳定性。去除上清液后，用1μg/ml抗
‑
flag标签
‑
ab(sigma
‑
aldrich；f1804)和抗
‑
小鼠
‑
igg
‑
alexa488(invitrogen；a10680)证明了结合。即使在小鼠血清中温育24小时后，facs分析也证实了psma结合(见表4)。测试了进一步的psma结合蛋白并在血清存在下也证实了与psma的结合。
[0164]
表4.在血清存在下psma结合蛋白的结合(流式细胞术)
[0165][0166]
实施例12.psma结合蛋白的血清稳定性(elisa)
[0167]
高结合96孔板(greiner,781061)在4℃下用2.5μg/ml psma
‑
fc固定过夜。在37℃下，在100％小鼠血清中，将稀释系列的affilin
‑
191871(具有c
‑
末端sac；seq id no:5)和标记有镥lu3 的seq id no:5dota温育过夜。用1xpbs洗涤elisa板，并且用3％bsa/0.5％吐温/pbs在室温下封闭2小时。在血清存在下温育0小时或24小时后的稀释系列在elisa板上在室温下温育1小时。用pbst洗涤之后，在室温下用生物素化的抗
‑
泛素
‑
抗体(1:1000)将孔温育1小时。使用链霉亲和素
‑
hrp(1:10.000)可视化结合。psma结合蛋白在血清温育24小时之后未显示出显著的k
d
变化。例如，elisa分析确认，即使在小鼠血清中温育24小时之后，seq id no:5以及标记有镥lu3 的seq id no:5dota对psma的结合的k
d
也为0.75 /
‑
0.02(相比之下，在小鼠血清中温育0小时的k
d
为0.53 /
‑
0.02)。