一种提高淀粉分支酶催化活力的方法与流程

1.本发明涉及一种提高淀粉分支酶催化活力的方法，属于酶工程技术领域。


背景技术：

2.淀粉分支酶(1,4
‑
α
‑
glucan branching enzyme；ec 2.4.1.18；gbe)是能够直接参与淀粉生物合成的一类糖基转移酶，属于α
‑
淀粉酶家族。gbe通过水解淀粉分子的α
‑
1,4
‑
糖苷键，产生具有非还原性末端的低聚糖链，再通过α
‑
1,6
‑
糖苷键转接至受体链上，形成新的α
‑
1,6
‑
分支点，从而增加淀粉分子的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能。gbe可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物，如高支化淀粉、慢消化糊精、高支化环糊精等，具有极大地工业应用价值。
3.耐热性、酶活和催化效率是制约淀粉分支酶工业化应用的重要因素，同时酶蛋白用量也是影响生产成本的主要因素。酶活较低时，在应用生产中需加入较多酶液以达到生产要求，极大的提高了生产成本，因此提高淀粉分支酶的催化活力，减少生产中酶蛋白用量，对于扩大淀粉分支酶工业化应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了提高现有技术当中淀粉分支酶的催化活力，本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的淀粉分支酶的第25位的亮氨酸突变得到的。
5.在本发明的一种实施方式中，编码所述淀粉分支酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6.在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为seq id no.1所示的淀粉分支酶的第25位的亮氨酸突变为精氨酸，命名为：l25r；其氨基酸序列如seq id no.3所示。
7.在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列为seq id no.1所示的淀粉分支酶的第25位的亮氨酸突变为丙氨酸，命名为：l25a；其氨基酸序列如seq id no.4所示。
8.本发明还提供了一种编码上述突变体的基因。
9.本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。
10.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是pet
‑
20b( )为表达载体。
11.本发明还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。
12.在本发明的一种实施方式中，以细菌或真菌为宿主细胞。
13.本发明还提供了一种提高淀粉分支酶催化活力的方法，将氨基酸序列为seq id no.1所示的淀粉分支酶的第25位的亮氨酸进行突变。
14.在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列为seq id no.1所示的淀粉分支酶的第25位的亮氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列为seq id no.1所示的淀粉分
支酶的第25位的亮氨酸突变为丙氨酸。
15.本发明还提供了一种改性麦芽糊精，或提高麦芽糊精分支度的方法，所述方法为，将上述突变体，或上述重组细胞添加至含有麦芽糊精的反应体系中进行改性。
16.本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备淀粉、麦芽糊精水解产品方面的应用。
17.有益效果
18.(1)本发明提供了一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体，采用本发明提供的高催化活力的淀粉分支酶突变体，能够减少生产中酶蛋白用量，对于扩大淀粉分支酶工业化应用具有重要意义。
19.(2)本发明提供了一种淀粉分支酶突变体l25r和突变体l25a；其中变体l25r的比酶活比野生型淀粉分支酶提高了约1.28倍；突变体l25a的比酶活比野生型淀粉分支酶提高了约1.23倍。
20.(3)本发明提供了一种淀粉分支酶突变体l25r和突变体l25a；二者改性麦芽糊精后，产物中的α
‑
1,6
‑
糖苷键含量由3.85％增加到5.71％，分支度相较于野生型改性后α
‑
1,6分支度提高了0.95％。
附图说明
21.图1：野生型和突变型gbe粗酶液的sds
‑
page图；其中，条带marker：蛋白标准分子量。
22.图2：野生型和突变型gbe纯化后的sds
‑
page图；其中，条带marker：蛋白标准分子量。
23.图3：野生型gbe和突变体l25r、l25a处理后的麦芽糊精样品的1h nmr图谱。
24.图4：淀粉分支酶改性前后麦芽糊精的链长分布图比较；其中，(a)麦芽糊精经野生型淀粉分支酶改性后脱支；(b)麦芽糊精经l25r改性后脱支；(c)麦芽糊精经l25a改性后脱支；(d)麦芽糊精经l25k改性后脱支。
具体实施方式
25.本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
26.下述实施例中公开的麦芽糊精溶液购自山东保龄宝生物股份有限公司，下述实施例中所涉及的异淀粉酶购自美国sigma公司。
27.下述实施例所涉及的培养基如下：
28.lb液体培养基：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
29.lb固体培养基：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph 7.0，1.5％(w/v)琼脂。
30.tb液体培养基：酵母粉24g/l，胰蛋白胨12g/l，甘油5g/l，kh2po
4 17mm，k2hpo
4 72mm，ph 7.0。
31.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
32.淀粉分支酶酶活的检测：
33.用10mm磷酸缓冲液(ph 7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入0.5mg/ml淀粉分支酶后混合均匀并置于50℃水浴条件下准确反应15min。反应结束后沸水浴灭酶。取300μl反应混合液加入5.0ml显色液(0.05％(w/v)ki，0.005％(w/v)i2，ph7.5)混匀后与室温下避光显色15min。显色15min后在530nm处测定吸光值。
34.一个酶活力单位定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位。
35.实施例1：淀粉分支酶突变体的制备
36.具体步骤如下：
37.(1)化学合成核苷酸序列如seq id no.1所示的淀粉分支酶gbe，采用xhoi和ndei内切酶对淀粉分支酶gbe和pet
‑
20b( )质粒酶切之后连接，制备得到重组质粒pet
‑
20b( )
‑
gbe；
38.(2)以步骤(1)制备得到的重组质粒pet
‑
20b( )
‑
gbe为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照takara公司star primer gxl试剂盒说明书所示方法进行定点突变；分别制备得到含有突变体l25r、l25k、l25a的基因的重组质粒。
39.表1淀粉分支酶突变位点的引入
[0040][0041][0042]1下划线碱基对应于相应突变氨基酸
[0043]
pcr反应体系依照star primer试剂盒说明书中所设定条件：5
×
primestar buffer(mg
2
plus)10μl，模板dna 1μl，正向和反向引物(10μm)均为1μl，primestar hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl，dntps(各2.5mm)4μl，最后加入超纯水32.5μl。pcr扩增条件为：98℃条件下预变性5min；随后以98℃10s，60℃(l25r)/55℃(l25k、l25a)15s，68℃6min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；68℃10min，最后4℃下保温10min。
[0044]
将反应后得到的pcr产物用dpni在37℃下保温消化1h，随后将处理好的pcr产物按照e.coli jm109感受态转化方法转入到e.coli jm109中，制备得到转化子，并将转化子涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上，将涂布后的lb固体培养基倒置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取阳性单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基并于37℃下培养10～12h，提取质粒，并送公司测序，分别获得含有突变基因的重组质粒：
pet
‑
20b( )
‑
l25r、pet
‑
20b( )
‑
l25k、pet
‑
20b( )
‑
l25a。
[0045]
实施例2：含有表达本发明淀粉分支酶突变体基因的基因工程菌的构建及突变体的表达及分离纯化
[0046]
具体步骤如下：
[0047]
(1)分别将实施例1中得到的重组质粒pet
‑
20b( )
‑
gbe、pet
‑
20b( )
‑
l25r、pet
‑
20b( )
‑
l25k、pet
‑
20b( )
‑
l25a导入e.coli bl21(de3)宿主感受态中，分别制备得到e.coli bl21(de3)/pet
‑
20b( )
‑
gbe，e.coli bl21(de3)/pet
‑
20b( )
‑
l25r，e.coli bl21(de3)/pet
‑
20b( )
‑
l25k，e.coli bl21(de3)/pet
‑
20b( )
‑
l25a重组菌株；
[0048]
(2)分别将重组菌株在lb固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取阳性单菌落接种于含有50ml lb液体培养基的250ml三角瓶中。将该三角瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养10～12h，制备得到种子液；
[0049]
(3)将种子液按2％(v/v)的接种量，接种于含有50ml tb液体培养基的250ml三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在30℃下诱导48h，分别制备得到含有野生型gbe的粗酶液、含有l25r的粗酶液，含有l25k的粗酶液，含有l25a的粗酶液；分别将上述粗酶液做sds
‑
page分析，结果如图1所示，结果显示，原始酶及突变体酶均得到了表达。
[0050]
各培养基在使用前添加终浓度为100μmg/ml的氨苄青霉素。
[0051]
(4)淀粉分支酶突变体的纯化
[0052]
纯化步骤如下：采用0.45μm的水系滤膜过滤淀粉分支酶粗酶液以除去大分子杂质，而后采用histrap tm excel镍离子亲和层析柱(5ml)完成纯化。用6倍柱体积的缓冲液a液(20mm咪唑，10mm tris
‑
hcl，500mm nacl，ph 7.4)以2ml/min的流速平衡镍柱，接着流速不变，进样70ml，用8倍柱体积的缓冲液a液除去粗酶液中未与镍柱结合的物质，而后用60％(v/v)的缓冲液b液(500mm咪唑，10mm tris
‑
hcl，500mm nacl，ph 7.4)以1ml/min的流速洗脱柱子，收集洗脱液(含目的蛋白)，并用磷酸钠缓冲液(50mm，ph 7.0)进行透析。
[0053]
制备得到含有野生型gbe的纯酶、含有l25r的纯酶、含有l25k的纯酶、含有l25a的纯酶。
[0054]
(5)分别检测含有野生型gbe的纯酶、含有l25r的纯酶、含有l25r的纯酶、含有l25a的纯酶的比酶活，结果如表2所示：
[0055]
表2野生型和突变体gbe的酶活力
[0056]
野生型/突变体比酶活(u/mg)1野生型1790.16
±
44.17l25r2299.58
±
23.05l25k1716.23
±
19.29l25a2210.13
±
19.28
[0057]1每个值为3次平行实验的平均值。
[0058]
实施例3：淀粉分支酶突变体的1h nmr分析
[0059]
具体步骤如下：
[0060]
(1)使用10mm磷酸缓冲液(ph 7.5)配制1％(w/v)的de 7～9麦芽糊精溶液；
[0061]
向50ml离心管中加入20ml上述配制好的麦芽糊精溶液，在50℃、160rpm的水浴摇床中平衡15min，分别加入0.55mg实施例2制备得到的野生型纯酶液和突变体纯酶液，在50
℃下反应1.5h，沸水浴灭酶30min，分别得到改性后的麦芽糊精样品。
[0062]
(2)将对照(未加酶液处理)和步骤(1)得到的改性后的麦芽糊精样品进行冷冻干燥。
[0063]
(3)称取20mg干燥后的样品溶于0.6ml重水中，通过1h核磁共振谱法(1h nmr)测定样品中的α
‑
1,4及α
‑
1,6
‑
糖苷键含量比例。根据曲线上的峰面积计算得到α
‑
1,6
‑
糖苷键比例，结果如表3所示。
[0064]
表3野生型和突变型gbe改性麦芽糊精后的糖苷键含量变化
[0065]
样品α
‑
1,4糖苷键峰面积α
‑
1,6糖苷键峰面积α
‑
1,6糖苷键相对含量对照10.040.0385wt10.050.0476l25r0.990.060.0571l25a0.990.060.0571l25kk10.050.0476
[0066]
如表3所示，经野生型gbe改性后麦芽糊精的α
‑
1,6
‑
分支度为4.76％；经突变体l25r和l25a改性后的麦芽糊精样品的α
‑
1,6
‑
分支度为5.71％，相较于野生型改性提高了0.95％；然而，麦芽糊精经突变体l25k改性后，α
‑
1,6
‑
分支度相比于野生型没有变化。
[0067]
实施例4：淀粉分支酶突变体的碘结合能力检测
[0068]
具体步骤如下：
[0069]
(1)使用50mm磷酸钠盐缓冲液(ph 7.5)配制的0.1％(w/v)马铃薯直链淀粉溶液；
[0070]
向1ml马铃薯直链淀粉溶液中加入0.005mg实施例2制备得到的野生型纯酶液和突变体纯酶液，在50℃下反应1h后，沸水浴灭酶终止反应，得到反应液。
[0071]
(2)取0.3ml反应液与5.0ml碘液进行显色反应，使用扫描光谱(500～800nm)测定淀粉反应物的吸收光谱和最大吸收波长(λ
max
)。碘结合能力检测结果如图2所示。
[0072]
结果显示，直链淀粉可以结合碘形成蓝色复合物，其最大吸收波长(λ
max
)在620nm左右。淀粉分支酶修饰直链淀粉后会降低淀粉链的长度，降低其碘结合能力，从而使得λ
max
左移，偏向支链淀粉
‑
碘复合物的最大吸收波长(540nm左右)。
[0073]
根据络合物吸光度值及其最大吸收波长(λ
max
)的变化可观察淀粉直支链含量的改变。如图3所示，最初的淀粉
‑
碘络合物呈λ
max
为620nm左右，吸光度为0.69；gbe处理降低了吸光度值并改变了它的λ
max
，λ
max
向左移动(波长变短)。直链淀粉经野生型处理1h后，吸光度下降为0.328，λ
max
从620nm到584nm左右；直链淀粉经l25r处理1h后，吸光度下降为0.214，λ
max
从620nm到571nm左右；直链淀粉经l25a处理1h后，吸光度下降为0.283，λ
max
从620nm到577nm左右；直链淀粉经l25k处理1h后，吸光度下降为0.316，λ
max
从620nm到584nm左右，根据处理后λ
max
左移的程度，可以发现，相比较于野生型，l25r和l25a不同程度地提高产物中支链含量，提高了淀粉分支酶的催化能力。
[0074]
实施例5：淀粉分支酶突变体的应用
[0075]
具体步骤如下：
[0076]
(1)使用10mm磷酸缓冲液(ph 7.5)配制1％(w/v)的de 7～9麦芽糊精溶液；
[0077]
向50ml离心管中加入20ml上述配制好的麦芽糊精溶液，在50℃、160rpm的水浴摇床中平衡15min，加入0.55mg实施例2制备得到的野生型纯酶液和突变体纯酶液，在50℃下
反应1.5h，沸水浴灭酶30min。
[0078]
(2)将对照(未加酶液处理)和改性后的麦芽糊精样品进行冷冻干燥。
[0079]
(3)分别称取10mg干燥后的样品溶于2ml醋酸钠缓冲液(50mm，ph 3.5)中，持续搅拌糊化30min，将样品放置于40℃水浴摇床中平衡15min，然后加入0.1ml异淀粉酶(10000u/ml)，40℃、160rpm反应24h，100℃沸水浴30min终止反应，待样品溶液冷却至室温后，10000rpm离心10min，取适量上清液过0.22μm水系滤膜，稀释至合适浓度后使用hpeac
‑
pad色谱测定对照和改性后麦芽糊精样品的链段分布，结果如图4和表4所示。
[0080]
表4野生型和突变体改性前后麦芽糊精的链长分布
[0081][0082]
注：表中不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。
[0083]
gt
‑
gbe作用于淀粉或淀粉衍生物时，先通过水解作用将较长链段的α
‑
1,4
‑
糖苷键水解成较短链段，然后通过转苷作用将水解下来的较短链段通过α
‑
1,6
‑
糖苷键的形式连接至另一条链上形成分支，在此过程中改变淀粉的内部结构，使底物的链长分布发生变化。为了能够更深入地理解突变对gt
‑
gbe催化能力的影响机制，将gt
‑
gbe及其突变体在同样条件下作用于麦芽糊精，并将作用前后的麦芽糊精分别用异淀粉酶进行脱支处理。采用高效阴离子交换色谱(hpaec
‑
pad)测定麦芽糊精样品的链长分布。
[0084]
将不同dp值的链段划分为dp<13、dp 13～24、dp 25～36及dp>36进行分析，结果见表4。
[0085]
结果显示，经gt
‑
gbe改性后，麦芽糊精dp<13的链段含量显著提高，其余链段含量均有不同程度的降低。dp<13的链段含量由原麦芽糊精的67.04％提高至71.49％，证明了gt
‑
gbe在改性麦芽糊精的过程中，会水解较长的链段，生成更多短链(dp<13)。
[0086]
由表4可见，25位点的突变体改性后的麦芽糊精链段分布与野生型的结果无明显差异，说明25位点的突变并未改变gt
‑
gbe的作用方式。这可能是由于突变位点距离催化中心较远，并未改变催化中心的极性环境，同时侧链的长度变化也并未影响到结合位点附近的相互作用。
[0087]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。