一种原代干细胞的培养方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术，尤其涉及一种原代干细胞的培养方法。


背景技术：

2.干细胞，是一种多功能细胞，具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。在成体的器官中，干细胞可以通过不断分裂来修复组织。
3.组织器官的损伤和功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题，完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、器官或肢体的伤残一直是人类的梦想，也是难以攻克的医学高峰。目前的治疗方案均难以完全修复受损的组织、器官或使其功能得以长期恢复。
4.干细胞是对疾病进行基因治疗的理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、aids等领域具有广阔的应用前景。
5.现有干细胞，一般是通过脐带的原代干细胞进行培养，主要是两种培养方法，具体如下：
6.第一种方法是组织块植块法。是将脐带组织块剪碎，以定点植块的方法，固定放置培养瓶中，再添加干细胞培养基，经过多次换液，最终获取原代细胞。但该方法容易由于换液时导致组织块移位、漂浮，导致细胞不能从组织块爬出，最终容易导致原代细胞少、甚至培养失败。
7.第二种常见方法是组织块消化法。用胶原酶将组织块进行消化，消化完全后，经过过滤直接获得细胞，再接种于培养瓶中。此方法容易由于分离的组织块大小不一，导致消化时，不同大小的组织块消化时长不一，容易使得大块组织块消化完全后，小块组织块消化过度，所获得的细胞就会出现损伤。如为避免消化过度，大块组织又容易消化不完全被过滤掉，最终过滤获取的细胞也偏少。


技术实现要素：

8.基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种培养工艺简单、细胞收获率高的组织块消化法进行原代干细胞的培养方法。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种原代干细胞的培养方法，包括如下步骤：
11.第0天，从脐带中剥胶分离出相应组织块，将剥离的组织块经过ⅱ型胶原酶消化处理10～60分钟；终止消化后，洗涤消化后的组织块；将洗涤后的组织块直接接种到培养瓶中，添加干细胞培养基后将培养瓶静置于培养箱中进行干细胞培养；
12.第2天和第4天，分别往培养瓶中添加干细胞培养基；
13.第7天，对培养瓶进行全量换液，并将换下的营养液转移至离心管中离心处理，离心停止后，去除上清，将保留的沉底转入培养瓶中并再添加干细胞培养基，继续培养；
14.第10天和第13天，对培养瓶进行半量换液，再添加干细胞培养基；
15.第15天，停止培养，往培养瓶中加入消化液进行细胞的消化，使细胞脱离培养瓶壁，收集细胞，并进行洗涤后获得原代干细胞。
16.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，第0天中，所述ⅱ型胶原酶的浓度为0.01％
‑
0.5％。
17.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，第0天中，所述培养瓶采用t175培养瓶；所述组织块直接接种到培养瓶中时，组织块接种量为每个t175培养瓶中接种量2～20ml且干细胞培养基添加量为每个t175接种5～30ml。
18.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，第2天至第13天，每次添加干细胞培养基量为2～20ml。
19.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，第15天中，所述消化液为浓度为0.01％
‑
0.25％的胰酶。
20.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，所述干细胞培养基为αmem培养基或dmem/f12培养基。
21.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，所述培养箱中，温度为37℃、co2体积百分比为含量为5％、相对饱和湿度为100％。
22.与现有技术相比，本发明采用组织块半消化法进行原代干细胞的培养，具有如下优点：
23.1)、避免了单纯组织块接种后换液操作使得组织块漂浮而最终导致培养失败的问题；本发明培养过程中，消化时间短，为10～60分钟，细胞自行从组织块中解离出来并贴壁生长，可以避免直接完全消化处理脐带组织时，ⅱ型胶原酶溶液对细胞造成损伤，如，杀死、杀伤细胞等，避免影响细胞扩增数量；
24.2)可以避免脐带组织块完全消化后由于换液操作所带来的组织形态大小上的差异。
25.3)避免ⅱ型胶原酶过度消化细胞使细胞老化，也避免过滤损失掉未消化完全的组织块，使得过滤得到的原代细胞量过少，后续可使用的种子量少；
26.4)可以利用残留组织块中的ⅱ型胶原酶，在后续培养中进行缓慢的消化，充分利用了脐带组织，也通过补液操作不断减少残留ⅱ型胶原酶含量；
27.5)在短时间可以获得大量高活性的原代细胞，倍增时间短，单位培养面积收获细胞数量多。
附图说明
28.图1为本发明提供的原代干细胞的培养工艺流程图；
29.图2分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法传代p1干细胞单瓶倍增时间对比图；其中，细胞培养时间为72小时；
30.图3分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法细胞培养时间为72小时后收获的细胞数量对比图；
31.图4分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法传代p1干细胞单瓶175培养瓶收集细胞数量对比图；其中，细胞培养时间为72小时。
具体实施方式
32.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
33.如图1所示，本发明提供的原代干细胞的培养方法，包括如下步骤：
34.s1、第0天，取得脐带，使用器械和盐水将脐带洗涤至洗涤液无血色为止，将脐带剪段，使用镊子将脐带的静脉和动脉剥离，将沃顿胶从羊膜剥离获得组织块，并剪碎。向剥离的组织块中加入ⅱ型胶原酶，放入摇床中进行消化；消化后，加入生理盐水，洗涤消化后的组织块至少两遍；将洗涤后的组织块直接接种到培养瓶中，添加干细胞培养基后将培养瓶静置于培养箱中进行干细胞培养。
35.该步骤中，ⅱ型胶原酶的浓度为0.01％
‑
0.5％；如，在一实施例中，ⅱ型胶原酶的浓度可以为0.01％；其他实施例中，ⅱ型胶原酶的浓度也可以为0.1％、0.2％或者0.5％。
36.消化处理时间为10～60分钟；如，在一实施例中，消化处理时间可以为10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或者60分钟；在其他实施例中，根据脐带组织块消化的状态，也可以延长至60分钟以上，如，60～90分钟，此时总消化处理为10～90分钟。
37.上述组织块直接接种到培养瓶，优选为t175培养瓶时，其组织块接种量为每个t175培养瓶中接种量为2～20ml，干细胞培养基添加量为每个t175培养瓶接种5～30ml；如，每个t175培养瓶中，可以接种组织块量为2ml、10ml、16ml或20ml，相应地，根据组织块接种量，干细胞培养基添加量可以为5ml、10ml、20ml、30ml或者5～30ml之间的其他任一体积数；一般来说，组织块接种量越高，所需的培养基体积数也就会越高，因为细胞生长、扩增过程需要消耗大量的营养物质或养分。
38.s2、第2天和第4天，取出培养瓶，分别往培养瓶中添加一定量的干细胞培养基，再放入培养箱中培养。
39.该步骤中，补液时，添加干细胞培养基量为2～20ml；如，具体到某个实施例中，需要根据步骤s1中组织块接种量来定，干细胞培养基添加量可以为2ml、5ml、15ml、20ml或者2～20ml之间的其他任一体积数；一般来说，接种量越高，所需的培养基体积数也会越高。
40.s3、第7天，取出培养瓶，对培养瓶进行全量换液，换出的悬液进行离心处理，保留沉淀，将沉淀平均分到原瓶中，重新进行细胞接种，再添加干细胞培养基继续培养。
41.该步骤中，细胞还没有迁移出来，可以采用全量换液操作，有利于细胞迁移出来。因此，补液时，添加干细胞培养基的全换液量为2～20ml；如，具体实施例中，需要根据步骤s1中组织块接种量来定，干细胞培养基添加量可以为2ml、5ml、15ml、20ml或者2～20ml之间的其他任一体积数。
42.s4、第10天和第13天，取出培养瓶，进行半量换液，使用电动移液枪将培养瓶中培养基吸出一半培养基，再添加干细胞培养基继续培养。
43.该步骤中，组织块中已经有细胞迁移出来了，在吸取培养瓶中的培养基时，尽可能不要让移液枪碰到培养瓶壁，将移液枪吸嘴轻轻的放在培养基中，吸除大概一半的培养基；接着，采用半换液操作，补充一半新鲜的培养基以提供细胞生长所需的养分或营养组份。这是因为有细胞迁移出来了，如果还采用全量换液，会影响细胞生长，所以采用半换液方式，
以减少生长环境的影响。
44.s5、第15天，停止培养，往培养瓶中加入胰酶进行细胞的消化，使细胞脱离培养瓶壁，收集细胞，并进行洗涤后获得原代干细胞。
45.该步骤中，消化液为浓度0.01％
‑
0.25％的胰酶；较好地，根据步骤s1中组织块接种量，胰酶浓度可以为0.01％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或者0.01％
‑
0.25％之间的其他任一比例数；消化液也可以是商品化温和消化酶。
46.上述原代干细胞的培养方法中，干细胞培养基优选为αmem培养基或dmem/f12培养基，或可以是其他商品化干细胞培养基。
47.一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，所述培养箱中，温度为37℃、co2体积百分比为含量为5％、相对饱和湿度为100％。
48.下面通过几个实施例进一步详细说明
49.在细胞培养过程中，分别采用组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法进行原代干细胞传代培养。
50.实施例1
51.本实施例采用组织块半消化法培养脐带干细胞原代培养，培养步骤如下：
52.1、获取脐带组织
53.(1)组织块剥胶
54.将脐带从采集瓶取出，用生理盐水洗涤血污，剪切成段，用有齿镊将表皮去掉，再去掉一条静脉两条动脉；把组织块加入到50ml离心管中，用剪刀将组织块剪切成小块，加入生理盐水，用800g，离心5分钟。
55.(2)组织块消化
56.离心结束后，去掉上清液，加入0.1％的ⅱ型胶原酶，放于恒温摇床，37度，200rpm/min，消化30min；消化结束后，加满生理盐水，800g，5min洗涤2遍。
57.(3)组织块接种
58.按照一瓶t175培养瓶接种离心后去上清组织块体积5ml的比例进行接种。加入干细胞培养基10ml，放入培养箱培养；其中，培养箱中，温度为37℃、co2体积百分比为含量为5％、相对饱和湿度为100％。
59.(4)细胞培养及培养基的添加与换液
60.第2天，取出培养瓶，每个培养瓶补5ml干细胞培养基，放回培养箱培养。
61.第4天，取出培养瓶，每个培养瓶补5ml干细胞培养基，放回培养箱培养。
62.第7天，取出培养瓶，将培养液全部倒出进行全量换液，收集到50ml离心管中，800g，5min离心；离心后将沉淀接种回培养瓶中，每瓶培养基添加20ml干细胞培养基，放回培养箱培养。
63.第10天，取出培养瓶，将培养液吸出一半进行半量换液，即每瓶吸出10ml培养基弃掉，再补充加入10ml培养基，放回培养箱培养。
64.第13天，取出培养瓶，将培养液吸出一半进行半量换液，即每瓶吸出10ml培养基弃掉，再补充加入10ml培养基，放回培养箱培养。
65.(5)细胞收集
66.第15天，取出培养瓶，观察，待细胞融合度达70
‑
80％即可进行细胞收集操作；收集
培养上清，800g,5min离心，作为终止液。每瓶倒入5ml生理盐水，洗涤细胞培养面，弃去生理盐水，再向每瓶培养瓶中加入0.05％胰酶吗，消化2min；加入终止液终止消化，收集细胞悬液到50ml离心管中，200g，离心8min；离心结束后，弃去上清，再加入生理盐水，200g，离心8min，离心结束后，弃去上清，获得干细胞原代细胞，细胞可用于传代、冻存。
67.实施例2
68.本实施例采用组织块植块法培养脐带干细胞原代培养，培养步骤如下：
69.(1)组织块剥胶
70.将脐带从采集瓶取出，用生理盐水洗涤血污，剪切成段，用有齿镊将表皮去掉，再去掉一条静脉两条动脉，把组织块加入到50ml离心管中，用剪刀将组织块剪切成小块，加入生理盐水，用800g，离心5分钟。
71.(2)组织块接种
72.离心结束后，去掉上清。按照一瓶t75培养瓶组织块12块的比例进行接种。接种后倒扣1小时。再加入干细胞培养基4ml。放入培养箱培养；其中，培养箱中，温度为37℃、co2体积百分比为含量为5％、相对饱和湿度为100％。
73.(3)细胞培养、培养基的添加与换液
74.第2天，取出培养瓶，向每个培养瓶补充干细胞培养基4ml，放回培养箱中继续培养。
75.第7天，取出培养瓶，分别将培养瓶中的旧培养基全部吸掉废弃，再加入8ml干细胞培养基，放回培养箱中培养。
76.第11和15天，分别取出培养瓶，分别将培养瓶中的旧培养基吸走4ml,再分别补充加入4ml干细胞培养基，放回培养箱中培养。
77.(4)细胞收集
78.第18
‑
20天，取出培养瓶，观察，待细胞融合度达70
‑
80％即可进行细胞收集操作。轻轻拍打培养瓶，使组织块脱离培养瓶面。组织块连同培养上清收集到50ml离心管中，800g,5分钟离心，作为终止液使用。每瓶加5ml生理盐水，洗涤细胞培养面，弃去生理盐水。再向每瓶培养瓶中加入0.05％胰酶。消化2min。加入终止液终止消化。收集细胞悬液到50ml离心管中。200g，离心8min。离心结束后，弃去上清，再加入生理盐水，200g，离心8min。离心结束后，弃去上清，获得干细胞原代细胞，细胞可用于传代、冻存。
79.实施例3
80.采用组织块消化法培养脐带干细胞原代培养，处理步骤如下：
81.(1)组织块剥胶
82.将脐带从采集瓶取出，用生理盐水洗涤血污，剪切成段，用有齿镊将表皮去掉，再去掉一条静脉两条动脉，把组织块加入到50ml离心管中，用剪刀将组织块剪切成小块。加入生理盐水，用800g，离心5分钟。
83.(2)组织块消化及接种
84.离心结束后，去掉上清液，加入0.1％的ⅱ型胶原酶，放于恒温摇床，37度，200rpm/min，消化2
‑
4小时，直到组织块几乎消化完全即可，加干细胞培养基，终止消化；用100um滤网进行过滤，滤液使用200g,5min离心洗涤2次。离心结束后，去掉上清，用干细胞培养基重悬细胞沉淀，按照1x105/cm2接种于t75培养瓶，每个t75添加8ml干细胞培养基。
85.(3)细胞培养及培养基的添加与换液
86.第2天，取出培养瓶，进行半量换液，接下来的细胞培养过程中，每隔2
‑
3天进行半量换液，直到细胞融合度达到70
‑
80％即可进行细胞收集操作。
87.(4)细胞收集
88.取出培养瓶，观察，待细胞融合度达70
‑
80％即可进行细胞收集操作。培养上清收集到50ml离心管中，800g,5分钟离心，作为终止液使用；每瓶加5ml生理盐水，洗涤细胞培养面，弃去生理盐水，再向每瓶培养瓶中加入0.05％胰酶。消化2min。加入终止液终止消化；收集细胞悬液到50ml离心管中。200g，离心8min。离心结束后，弃去上清，再加入生理盐水，200g，离心8min。离心结束后，弃去上清，获得干细胞原代细胞，细胞可用于传代、冻存。
89.实施例4
90.原代干细胞结果测试
91.图2分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法传代第一代(p1)干细胞单瓶倍增时间对比图；其中，细胞培养时间为72小时；
92.图3分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法细胞培养时间为72小时后收获的细胞数量对比图；
93.图4分别为组织块植块法、组织块半消化法、组织块消化法传代p1干细胞单瓶175培养瓶收集细胞数量对比图；其中，细胞培养时间为72小时。
94.测试时，针对实施例1至3中各自培养的原干细胞，分别进行如下试验检测：
95.(一)、细胞迁移率检测
96.细胞迁移试验检测次数均为22次；其中，组织块植块法成功14次，组织块半消化法成功22次，组织消化法成功9次。测试结果如表1和图2所示，测试要求：原代细胞迁出成功率，以出现细胞为准。
97.表1原代干细胞细胞迁出成功率对比
[0098] 组织块植块法组织块半消化法组织块消化法试验次数222222成功数14229成功率63.6％100％40.9％
[0099]
(二)、细胞数量及倍增时间的中位值检测
[0100]
针对实施例1至3中各自培养的原干细胞培养72小时后，再进行细胞数量中位值检测，结果如图2至4及表2所示。检测结果如下：
[0101]
1)原代细胞进行传代后，各组倍增时间中位值对比，倍增时间的中位置越低越好；如图2和3所示；
[0102]
2)原代细胞传代后，各组脐带收获的p1单瓶t175数量的中位值对比，细胞数量的中位值越高越好；如图4和表2所示。
[0103]
表2各培养法在不同时间点获得的细胞数量中位值
[0104][0105]
总之，通过原代干细胞结果测试，结合图2、3、4、表1和表2中可以看出：
[0106]
1)、本发明采用组织块半消化法成功率最高，达到100％；
[0107]
2)、细胞进行传代后，组织半消化法的倍增时间最低，而且数量扩增最多；
[0108]
3)、组织半消化法进行细胞培养，在各时间点检测时获得细胞数量中位值最多，如，培养72小时后获得1751的中位值细胞数量，远高于组织块植块法和组织块消化法细胞培养对应的中位值细胞数量。组织块半消化法培养细胞的这些优点，都说明组织半消化法培养细胞时，细胞的活性高；因此组织块半消化法有很大的优势。
[0109]
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。