一种耐盐促生的假单胞菌RL-WG26菌株及其应用的制作方法

一种耐盐促生的假单胞菌rl
‑
wg26菌株及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业微生物技术领域，更具体地，涉及一种耐盐促生的假单胞菌rl
‑
wg26菌株及其应用。


背景技术：

2.近些年以来，随着温室气体的排放增加，导致温室效应在全球范围内不断加强，引起气候变暖，南北极冰川发生消融，海平面上升。海平面上升对沿海地区造成巨大威胁，田地遭受海水倒灌，而中国东部和南部大陆海岸线长，海域面积大，加上农民不合理的耕种和灌溉，盐渍化加剧，海滨盐碱地不断增多，导致可种植粮食土地面积大幅度减少。现在盐碱地的存在与大量增加，已经成为重要的一部分土地资源，因此如何利用盐碱地已然是现在备受关注的一个问题。
3.在盐碱地的利用上，国内外的研究者对盐碱地的治理和改良都进行了相关的研究和施行。将治理和改良方法分为物理改良、生物改良、化学改良、水利改良四大类。其中，生物改良多是植树造林，种植耐盐的树木，抗盐性强的植物，防风固沙的同时，也可以有效改善盐碱地的土壤构造、增强土壤的肥力，从而有效地防止土壤盐分在地表土中的积聚；还使用微生物菌肥，降低土壤碱性，采用菊芋、海葵新品种，建立种植带都是目前可行的措施。
4.而微生物中的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。现有报道的pgpr在改善盐土、促进植物耐盐性的研究主要集中在假单胞菌属(pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(bacillus sp.)、黄杆菌属(flavobacteria)和固氮菌属(azotobacter)等菌株筛选上，并对它们在不同植株作物上研究较多。其中，假单胞菌属(pseudomonas sp.)目前只针对番茄的耐盐促生长上研究较多，如现有技术中公开了一种耐盐促生菌菌株b9，能在盐胁迫下显著提高番茄的耐盐促生能力，将该菌株制成的番茄耐盐促生剂，能明显增大番茄的株型，促进番茄幼苗的干物质积累，减缓了盐害现象，从而促进番茄幼苗的生长，有助于提高番茄的耐盐性。然而所述耐盐促生的菌株b9耐盐能力较弱，而假单胞菌属(pseudomonas sp.)在水稻盐渍土壤修复以及耐盐的根际促生菌的筛选上还少有研究，在盐碱地的利用和开发上，有必要研究出新的水稻耐盐的根际促生菌，为盐碱地的利用提供更多更高效的耐盐促生菌选择。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种水稻耐盐的根际促生菌，为盐碱地的利用提供更多更高效的耐盐促生菌选择。
6.本发明第一个目的是提供一种耐盐促生的假单胞菌(pseudomonas sp.)rl
‑
wg26菌株。
7.本发明第二个目的是提供一种水稻耐盐促生剂。
8.本发明第三个目的是提供所述菌株的应用。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
10.一种耐盐促生菌rl
‑
wg26菌株，所述菌株于2021年9月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏编号为gdmcc no：61956。
11.具体地，所述菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no:1所示。
12.本发明从耐盐水稻“海稻86”根际土壤中分离得到一种耐盐促生菌，制备土壤悬液后，将所得细菌培养液106稀释涂布，挑取生长良好的单菌落进行培养，在非耐盐水稻品种“ir29”上经过3次以上的接种实验，配制得到的耐盐促生剂能明显提高水稻的成活率和叶绿素含量，显著促进水稻的干物质积累，并对水稻的根长、表面积、根体积均有促进作用，减缓了盐害现象，从而促进水稻幼苗的生长，同时还能减少化学肥料的使用。
13.因此，本发明提供一种耐盐促生菌rl
‑
wg26菌株在盐胁迫下促进水稻生长中的应用。
14.本发明提供一种耐盐促生菌rl
‑
wg26菌株在制备水稻促生剂中的应用。
15.本发明还提供一种耐盐促生菌rl
‑
wg26菌株在制备水稻耐盐促生剂中的应用。
16.本发明提供一种水稻耐盐促生剂，采用所述rl
‑
wg26菌株或菌液为活性成分。
17.优选地，所述菌液终浓度为1
×
108cfu/ml。
18.本发明提供水稻耐盐促生剂在盐胁迫下促进水稻生长中的应用。
19.本发明还提供一种促进水稻生长的方法，将rl
‑
wg26菌株的菌液配置成终浓度为1
×
108～10
10
cfu/ml的水溶液，注入水稻幼苗根际土壤中，每株水稻幼苗根际注入1ml水稻耐盐促生剂。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明提供的一种耐盐促生的假单胞菌(pseudomonas sp.)rl
‑
wg26菌株及耐盐促生剂，用于盐胁迫中促进非耐盐水稻品种“ir29”生长的应用。将耐盐促生剂注入水稻幼苗根围土壤中，能明显提高植株的成活率、株高、茎粗，显著减缓离子毒害现象，并对水稻幼苗的根长、根表面积、跟体积均有促进作用，减缓了盐胁迫现象；并且在非盐胁迫下，施加耐盐促生菌rl
‑
wg26后水稻的根长和根面积都高于对照组，表明在非盐胁迫下施加耐盐促生菌rl
‑
wg26后也能促进水稻的生长，从而促进水稻幼苗的生长，有助于提高水稻的耐盐性，减少化学肥料使用。该耐盐促生菌菌株具有广泛的应用前景，为运用pgpr来缓解作物盐害提供了理论依据和技术支撑。
附图说明
22.图1为本发明rl
‑
wg26在lb固体培养基上的菌落形态。
23.图2为本发明rl
‑
wg26的系统发育树。
具体实施方式
24.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
25.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
26.实施例1菌株的分离和筛选
27.取耐盐水稻“海稻86”的根际土壤样本置于锥形瓶内，并加入有100ml无菌水，用隔菌膜封住锥形瓶口，置于摇床内，180rpm30℃恒温振荡1h，得到土壤悬液。把得到的土壤悬液接种于含5％nacl的lb培养基中，30℃振荡培养24h后，转接于10％nacl的lb培养基中，30℃振荡培养24h后，再转接于15％nacl的lb培养基中，30℃振荡培养24h后，将所得细菌培养液106稀释涂布，挑取生长良好的单菌落进行培养。首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照，结果如图1所示；并转接于nacl的lb液体培养基中，30℃振荡180rpm培养24h后，摇菌至细菌指数生长期时保存于30％的甘油水溶液中，冻存于
‑
80℃冰箱备用。
28.实施例2菌株的鉴定
29.1.菌株的形态学特征：
30.菌株在lb培养基上的菌落为黄色，圆形凸起，边缘规整，不透明，湿软，表面光滑。
31.2.细菌dna提取：
32.将上述分离得到的菌株接种到lb培养基中，置于摇床中30℃180rpm条件下培养3d。取培养后的菌液1ml，进行离心并收集菌体，用ctab法提取基因组dna，得到的dna用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，
‑
20℃保存备用。
33.3.菌株16s rrna基因序列的pcr扩增：
34.以上述细菌dna为模板，扩增引物采用细菌通用引物：
35.正向引27(f)5
’‑
agagtttgatcmtggctcag
‑3’
；
36.反向引物1492(r)5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
；
37.采用50μl pcr扩增体系：22μl无菌水，正向和反向引物各1μl，25μl r
‑
taq mix，1μl目标微生物基因组dna。
38.扩增反应程序：
①
95℃预变性2min，
②
95℃变性30s，
③
55℃退火30s，
④
72℃延伸1.5min，步骤
②
～
④
进行33个循环后，体系在72℃继续延伸10min，扩增产物保存于4℃。
39.pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶(含0.01％gelred)电泳检测，以dna marker 2000作为参照，并置于1
×
tae缓冲液内130v恒压电泳30min。随后在凝胶成像系统下观察pcr扩增产物条带，用taraka公司的切胶回收试剂盒进行pcr扩增产物的回收。
40.4.菌株16s rrna基因序列测序与菌种鉴定：
41.将上述pcr扩增产物送由南京金唯智生物公司进行测序，并将所得16s rrna基因序列上传至ncbi并进行比对，筛选亲缘关系较近的种属进行基于16s rrna基因序列的系统发育分析，系统发育树如图2所示。
42.同时，基于16s rrna基因序列分析结果，最终将该菌株鉴定为假单胞菌属(pseudomonas sp.)，命名为pseudomonas sp.rl
‑
wg26。该菌株于2021年9月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：61956，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
43.实施例3菌株rl
‑
wg26的耐盐性能试验
44.挑选大小一致、饱满的非耐盐水稻品种“ir29”种子用2％的naclo溶液表面消毒15min，用去离子水反复冲洗种子多次，置于去离子水中浸种24h，再将其置于铺有湿润纱布的培养皿上，27℃催芽2d。选取出芽一致的种子播种于水稻田，待幼苗长至三叶一心时移植到塑料盆(670
×
410
×
150mm)中，其中栽培土为稻田土，盐水为海水。
45.水稻耐盐促生剂的配制：将菌株rl
‑
wg26接种于lb液体培养基，180rpm、30℃下培养至od
600
为1.0得到菌液，将菌液5000rpm的转速离心10min，弃上清液，再注入等体积的ddh2o，振荡重悬浮后，以5000rpm的转速离心10min，弃上清液，重复2次，重悬浮后即得水稻耐盐促生剂。
46.已知水稻品种“ir29”为非耐盐品种，在高盐度土壤中能不存活，因此本实验设0、0.6％和0.7％四个盐度处理，以适当稀释后的海水对稻田土进行浇灌，充分混匀后测定水层盐度，制备得测试用含盐土壤。
47.实验设置(1)非盐胁组：盐度浓度为0，采用自来水浇灌，(2)盐胁迫组：盐度浓度为0.6％、0.7％，以及(3)水稻耐盐促生剂处理组，采用菌株rl
‑
wg26制备得到的耐盐促生剂。
48.各处理组按设定的盐浓度浇灌，在水稻耐盐促生剂在盐浓度处理后1d施用，每株幼苗根际注入2ml水稻耐盐促生剂。实验水稻设置三个重复一组20棵苗，处理15d后采样进行指标测定。整个培养过程在温室中进行，温度：白天26
±
5℃及夜间21
±
5℃，相对湿度：白天50％
±
10％及夜间60％
±
6％。
49.以下试验均按照非盐胁组、盐胁迫组和水稻耐盐促生剂处理组进行处理。
50.1.水稻成活率实验测试：
51.取上述水稻幼苗，移植到含盐土壤中，从全部水稻幼苗种下开始，记录成活率，随后每天记录各植株生长情况，实验结果见表1所示。
52.表1水稻耐盐促生剂对植株成活率的影响
[0053][0054][0055]
结果如由表1所示，由此可知在盐胁迫下，水稻的成活率受到了明显的抑制，在0.6％和0.7％盐度处理下，水稻成活率为0；而在加了水稻耐盐促生剂的处理组中，水稻的成活率显著提升，分别提升到了63％和30％。
[0056]
2.叶绿素含量测定：
[0057]
取上述耐盐实验的水稻的叶片，采用分光光度法测定叶绿素含量浓度，将水稻的叶片洗净并吸干外附水分，用打孔器准确在主脉两侧钻取健康绿色叶圆片并剪碎叶片，称取0.20g，加入95％乙醇10ml，放入黑暗环境，直至无绿色为止。将提取液倒入比色皿，以95％乙醇为空白，分别于665、649nm等波长下比色测定，记录吸光度。按照公式(1)和(2)计算结果，计算得到植物叶片的叶绿素含量。
[0058]
c
a
＝12.635a665
‑
2.52a649
ꢀꢀꢀ
(1)
[0059]
c
b
＝20.47a665
‑
4.73a649
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0060]
表2水稻耐盐促生剂对植株叶绿素的影响
[0061][0062]
检测结果如表2所示，由此可知在盐胁迫下，水稻的叶绿素含量明显被抑制，在0.6％和0.7％盐度处理下，叶绿素a比对照组分别降低了70.3％和69.4％；叶绿素b比对照组分别降低了76.7％和78.4％；而在水稻耐盐促生剂处理组中：在0.6％盐度下，水稻耐盐促生剂处理组植株较未施加水稻耐盐促生剂植株的叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了225.1％和335.6％；在0.7％盐度下，水稻耐盐促生剂处理植株较未施加水稻耐盐促生剂植株的叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了186.8％和307.6％。
[0063]
3.根系形态分析：
[0064]
取上述耐盐实验的水稻的根部，采用爱普生v800扫描仪对根系进行扫描，并采用winrhizo根系分析系统软件(regentinstruments，inc.，quebec，canada)对根系的图像进行分析，获得根系总长度、根系总表面积和根总体积，测试结果如表3所示。
[0065]
表3水稻耐盐促生剂对植株根部生长情况
[0066][0067]
结果由表3可知，盐胁迫显著抑制了水稻幼苗根生长，随着盐度的升高抑制效果越明显，0.7％盐胁迫后的水稻根部变化尤为突出。在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的总根长与对照组相比增加了5.1％；0.6％盐度下施加水稻耐盐促生剂的总根长与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了479.3％，0.7％盐度下施加水稻耐盐促生剂的总根长与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了451.3％；在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与对照组相比提高了4.4％，0.6％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与未施加水稻耐盐促生剂的相比提高了317％，在0.7％盐度下，施加水稻耐盐促生剂的根面积与未施加水稻耐盐
促生剂的相比了288.1％；在0.6％和0.7％盐胁迫下与不施加水稻耐盐促生剂相比，两者施加水稻耐盐促生剂对水稻幼苗根体积有所增加，根体积分别增加了111.1％和114.3％。
[0068]
4.水稻根部钾、钠、钙离子含量测定：
[0069]
称取上述耐盐实验的水稻的地下部，粉碎过筛样品0.15g样品，准确记录称样量，硝酸
‑
高氯酸(混酸比例4：1)混酸6ml，置于消化炉内进行消化，消解至清凉后定容至100ml容量瓶中，过滤后待测钾、钠、钙离子含量。水稻茎叶中钠、钙离子含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定，钾离子含量采用硝酸
‑
高氯酸消解处理，火焰光度计测定。具体测量数据如下表4所示。
[0070]
表4水稻耐盐促生剂对水稻地上部离子浓度的影响
[0071][0072]
结果由表4可知，在非盐胁迫下，加水稻耐盐促生剂后的ca

浓度下降，提高了3.5％；在0.6％盐胁迫下，加了水稻耐盐促生剂的水稻地上部ca

浓度比不加促生剂的升高了84.9％。在0.7％盐胁迫下，加了水稻耐盐促生剂的水稻根部ca

浓度比不加促生剂的地上部ca

提高，提高了82.2％；在非盐胁迫下，水稻地上部的na

降低了，降低了7.8％。在0.6％和0.7％盐胁迫下，水稻地上部加水稻耐盐促生剂的na

含量与不加促生剂的相比也都降低了，分别降低了20.8％和39.9％；而k

与na

相反，在非盐胁迫下，施加水稻耐盐促生剂的k

含量与不施加相比，提高了11.7％。在0.6％和0.7％盐胁迫下，水稻地上部加水稻耐盐促生剂的k

含量与不加促生剂的相比也都升高了，分别升高了34.5％和25％.
[0073]
综上所述，施加耐盐促生菌rl
‑
wg26后的非耐盐水稻“ir29”在盐胁迫下，成活率显著提高，分别提升到了63％和30％。其叶绿素含量和水稻幼苗的根长部生长情况都有明显的提升，能够有效的调节植物体内离子的含量。且在非盐胁迫下，施加耐盐促生菌rl
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wg26后的非耐盐水稻“ir29”的根长和根面积都高于对照组，表明在非盐胁迫下施加耐盐促生菌rl
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wg26后能促进水稻的生长；施加耐盐促生菌rl
‑
wg26后的非耐盐水稻“ir29”明显缓解盐害现象，促进水稻的生长。
[0074]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。