用于植物健康的融合蛋白、重组细菌和孢子外壁片段的制作方法

用于植物健康的融合蛋白、重组细菌和孢子外壁片段
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年3月19日提交的美国临时专利申请第62/820,789号的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
发明领域
3.本发明涉及包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的融合蛋白，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)家族成员的孢子外壁(exosporium)。所述融合蛋白还包含果胶酶，包括果胶酸裂合酶(pectate lyase)或多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)。本发明还涉及表达所述融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员、源自所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段和含有所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段的制剂。还提供了用重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂处理的植物种子。本发明还涉及使用重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。
4.电子方式提交的序列表的引用
5.序列表的正式副本通过efs
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web、作为ascii格式的序列表以电子方式提交，其文件名为“bcs199003wo_st25.txt”，创建于2020年3月13日，大小为321千字节，序列表的正式副本与说明书共同提交。该ascii格式的文件中包含的序列表是说明书的一部分，并且以引用的方式全文纳入本文。
6.发明背景
7.在植物根部周围的区域内有一个称为根际的区域。在根际，细菌、真菌和其他生物体竞争营养物并竞争与植物的根结构结合。有害和有益的细菌和真菌都可以占据根际。细菌、真菌和植物的根系都可能受到根际中肽、酶和其他蛋白质作用的影响。用这些肽、酶或其他蛋白质中的某些来增强土壤或处理植物将对有益土壤细菌和真菌的整个群体具有有益效果，为植物生长创造更健康的整体土壤环境，改善植物生长，并保护植物抵抗某些细菌和真菌病原体。然而，先前将肽、酶和其他蛋白质引入土壤以诱导对植物这种有益效果的尝试受到酶、蛋白质和肽在土壤中的低存活率的阻碍。此外，土壤中天然存在的蛋白酶的普遍存在会导致土壤中蛋白质的降解。植物根部周围的环境(根际)是细菌、真菌、营养物和根部的独特混合物，其质量不同于原土壤。这些生物体之间的共生关系是独特的，并且可以通过包含外源蛋白而得到更好的改变。由于土壤中蛋白酶和其他对蛋白质有害的元素的水平异常高，根际中高浓度的真菌和细菌导致蛋白质的更大降解。此外，引入土壤中的酶和其他蛋白质会迅速从植物根部消散。
8.因此，本领域需要一种将肽、酶和其他蛋白质有效地递送至植物(例如至植物根系)并延长此类分子保持活性的时期的方法。此外，本领域需要一种将这些肽、酶和蛋白质选择性地靶向根际，特别是植物叶片和植物根的方法。


技术实现要素：

9.提供了一种融合蛋白。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶。
10.果胶酸裂合酶是来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(bacillus safensis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)或解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的果胶酸裂合酶或包含与seq id no：213
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217和222
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226中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的果胶酸裂合酶。
11.多聚半乳糖醛酸酶是来自黑曲霉(apergillus niger)atcc 9029的多聚半乳糖醛酸内切酶；简单芽孢杆菌(bacillus simplex)多聚半乳糖醛酸内切酶；沙福芽孢杆菌多聚半乳糖醛酸酶；高地芽孢杆菌(bacillus altitudinis)多聚半乳糖醛酸酶；地衣芽孢杆菌多聚半乳糖醛酸酶；短小芽孢杆菌多聚半乳糖醛酸酶或包含与seq id nos：210
‑
227具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的多聚半乳糖醛酸酶；或包含与seq id no：218
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221中任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的多聚半乳糖醛酸酶，或包含与seq id no：211或212具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的多聚半乳糖醛酸酶。
12.在一个实施方案中，包含与seq id no：218
‑
221中任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的多聚半乳糖醛酸酶来自芽孢杆菌属(bacillus)并且还含有与黑曲霉epg i的多聚半乳糖醛酸酶i的那些(为seq id no：210和227的氨基酸残基asp186、asp207、asp208和h229)保守的催化残基。
13.提供了一种重组蜡样芽孢杆菌家族成员。所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白。融合蛋白可以是本文所述的任何融合蛋白。
14.提供了重组蜡样芽孢杆菌家族成员的全发酵液培养物。提供了重组蜡样芽孢杆菌家族成员的发酵产物。
15.提供了孢子外壁片段。所述孢子外壁片段源自重组蜡样芽孢杆菌家族成员，包括重组蜡样芽孢杆菌家族成员的全发酵液或发酵产物。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以是本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员。孢子外壁片段可以包含本文所述的任何融合蛋白。
16.提供了一种制剂。所述制剂包含本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员，包括本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员的发酵产物。所述制剂还包含农业上可接受的载体。
17.提供了另一种制剂。所述制剂包含源自本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段，包括本文所述的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的全发酵液。所述制剂还
包含农业上可接受的载体。
18.还提供了又另一种制剂。所述制剂包含表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员。替代地或另外地，所述制剂包含源自表达融合蛋白的蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。所述制剂还包含第二种酶。
19.提供了一种经处理的植物种子。所述植物种子可用本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员处理。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以表达本文所述的任何融合蛋白。
20.提供了另一种经处理的植物种子。所述植物种子可用本文所述的任何孢子外壁片段处理。所述孢子外壁片段可源自本文所述的任何蜡样芽孢杆菌家族成员。孢子外壁片段可以包含本文所述的任何融合蛋白。
21.提供了又另一种经处理的植物种子。所述植物种子可用本文所述的任何制剂处理。
22.提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可包含本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以表达本文所述的任何融合蛋白。
23.提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将孢子外壁片段施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述孢子外壁片段可包含源自本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。孢子外壁片段可以包含本文所述的任何融合蛋白。
24.提供了又另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述制剂可包含本文所述的任何制剂。
25.提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。
26.提供了又另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将源自表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子的孢子外壁片段施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。
27.提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植
物种子周围的区域。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。所述方法还包括将第二种酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。
28.提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将源自表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌的孢子的孢子外壁片段施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述融合蛋白包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。所述方法还包括将第二种酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。
29.其他目的和特征在某种程度上是显而易见的，并且在下文中部分指出。
30.定义
31.当本文使用冠词“一个(a)”、“一个(an)”、“一个(one)”、“该”和“所述”时，除非另有说明，它们表示“至少一个”或“一个或多个”。
32.本文所用的术语“蜡样芽孢杆菌家族成员”是指能够产生孢子外壁的任何芽孢杆菌属物种。因此，蜡样芽孢杆菌细菌家族包括炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(bacillus mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(bacillus pseudomycoides)、bacillus samanii、bacillus gaemokensis、bacillus weihenstephensis和bacillus toyoiensis种。蜡样芽孢杆菌家族成员在本领域中也被称为“bacillus cereus sensolato”。
33.术语“包含(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”旨在是包含性的，并且意味着除了所列出的元素之外，还可以有其他元素。
34.本文所用的术语“游离酶”是指基本上不含完整细胞的酶制剂。术语“游离酶”包括但不限于含有酶的粗细胞提取物、部分纯化的、基本上纯化的或纯化的酶。游离酶可以任选地固定在化学基质或支撑物上，以实现酶的受控释放。本文所用的关于将酶固定在基质或支撑物上的术语“固定”是指酶与基质或支撑物的结合，使得酶保持在基质或支撑物上或在受控的时间段内从支撑物中释放出来，而不是以不受控的方式消散到环境中。示例性的基质和支撑物包括但不限于木炭、生物炭、纳米碳、琼脂糖、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、二氧化硅、塑料、不锈钢、玻璃、聚苯乙烯、陶瓷、白云石、粘土、硅藻土、滑石、聚合物、树胶、水可分散性材料及其任意组合。
35.本文所用的关于将酶或重组微生物施用于植物的术语“叶面”是指将酶或重组微生物施用于植物的一个或多个地上部分，包括茎、叶、果实、花或植物的其他暴露的地上部分。
36.本文所用的术语“融合蛋白”是指具有多肽序列的蛋白质，所述多肽序列包含源自两种或更多种单独蛋白质的序列。可通过将编码第一多肽的全部或部分的核酸分子与编码第二多肽的全部或部分的核酸分子连接在一起以产生核酸序列来产生融合蛋白，所述核酸序列在表达时产生具有源自每一种原始蛋白的功能性质的单一多肽。
37.本文所用的术语“萌发率”是指在特定时间段内萌发的种子数量。例如，85％的萌发率表明100粒种子中有85粒在给定的时间段内萌发。
38.本文所用的关于重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子的失活的术语“失活(inactivate或inactivation)”是指孢子不能萌发，或孢子能萌发，但被破坏以致萌发不产生活细菌。术语“部分失活(partially inactivate或partial inactivation)”是指一定百分比的孢子失活，但一些孢子保留萌发和恢复到活的、复制状态的能力。术语“遗传失活”是指通过孢子dna的突变使重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子失活，该突变导致孢子完全失活或部分失活。术语“物理失活”和“化学失活”是指使用任何物理或化学方法使孢子失活，例如通过热处理、γ辐射、x射线辐射、uv
‑
a辐射、uv
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b辐射，或用溶剂如戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿、苯酚或其任意组合处理。
39.术语“天然序列”、“天然氨基酸序列”、“野生型序列”和“野生型氨基酸序列”在本文中可互换使用，指存在于天然存在的蛋白质中的氨基酸序列。
[0040]“植物生长培养基”包括能够支持植物生长的任何材料。
[0041]
术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，是指提高或增加植物的高度、重量、叶大小、根大小、果实大小、芽大小或茎大小中的至少一种的能力，和/或增加植物的蛋白质产量，和/或增加作物产量，和/或提高植物活力的能力。例如，与未处理的植物或作物相比，这可能涉及到经处理的植物或作物的根和/或芽的长度和/或鲜重和/或干重增加。
[0042]
植物，特别是农业植物、造林植物和/或观赏植物的产量增加是指相应植物的产物的产量比在相同条件下生产，但不施用本文公开的组合物的植物的相同产物的产量增加的可测量的量。
[0043]
提高的植物活力包括以下：(a)提高的植物的生命力，(b)提高的植物和/或植物产物的质量，例如提高的蛋白质含量，(c)改善的视觉外观，(d)延缓衰老，(e)增强的根生长和/或更发达的根系(例如由根的干质量确定)，(f)增强的结瘤，特别是根瘤菌结瘤，(g)更长的圆锥花序，(h)更大的叶片，(i)更少的死基叶，(j)增加的叶绿素含量，(k)延长的光合活跃期，(l)增加的或改善的植物林分密度(plant stand density)，(m)更少的植物节(倒伏)，(n)增加的植物重量，(o)增加的植物高度，(p)分蘖增加，(q)更强壮的和/或更有生产力的分蘖，(r)更少的无生产力的分蘖，(s)增加的光合活性和/或增加的色素含量，从而使叶颜色更绿，(t)更早和/或改善的萌发，(u)改善的和/或更均匀的和/或更早的出苗，(v)增加的芽生长，(w)开花更早，(x)结果更早，(y)谷粒成熟更早，(z)需要更少的肥料，(aa)需要更少的种子。
[0044]
关于本文所述细菌的使用的术语“重组”包括与相同类型的野生型细菌相比具有任何遗传修饰的细菌，包括已被修饰以缺失基因或基因的一部分的细菌(例如具有基因“敲除”的细菌)，以及已被修饰以表达外源肽或蛋白的细菌。
[0045]
术语“根际”与“根区”可互换使用，表示围绕植物根并受其影响的土壤部分。
[0046]
本文所用的术语“协同有效量”是指当第一种物质与第二种物质(例如第二种酶)组合使用时产生的生物效应大于单独使用时第一种物质和第二种物质各自的生物效应之和的第一种物质(例如第一种酶)的量。
[0047]
本文所用的术语“靶向序列”是指当作为较长多肽或蛋白质的一部分存在时，导致
较长多肽或蛋白质定位于特定亚细胞位置的多肽序列。本文所述的靶向序列导致蛋白质定位于蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
[0048]
附图的简要说明
[0049]
图1a和1b描绘了炭疽芽孢杆菌sterne菌株bcla的氨基末端部分的氨基酸序列与来自蜡样芽孢杆菌家族成员的各种孢子外壁蛋白的相应区域的比对。
[0050]
发明详述
[0051]
i.在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达的融合蛋白
[0052]
本发明涉及包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的融合蛋白，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将所述融合蛋白靶向重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。所述融合蛋白还包含本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。当这些融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员细菌中表达时，其靶向至孢子的孢子外壁层，并且物理定向使得果胶酶展示在孢子的外部。
[0053]
这种芽孢杆菌孢子外壁展示(bemd)系统可用于将本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种递送至植物(例如植物叶、果实、花、茎或根)或植物生长培养基如土壤。以这种方式递送到土壤或另一种植物生长培养基中的酶和蛋白质在土壤中持续存在并表现出延长时间段的活性。将表达本文所述融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员细菌引入土壤或植物根际，导致在许多不同土壤条件下有益地增强植物生长。使用bemd产生这些酶，使他们能够在植物生命的前几个月内继续对植物和根际发挥其有益的结果。
[0054]
此外，如下文进一步所述，可以修饰bemd系统，使得可以将重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁从孢子中除去，产生含有融合蛋白的孢子外壁片段。孢子外壁片段也可用于以无细胞制剂的形式将本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种递送至植物。
[0055]
a.用于将果胶酶靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段
[0056]
为了便于参考，表1中提供了可用于将酶或蛋白(例如本文公开的果胶酶，例如果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种)靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段的氨基酸序列的描述及其seq id no。
[0057]
表1.用于将目的蛋白质或肽靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的肽和蛋白质序列
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
scientific reports，2016，vol.6，no.19005，pp.1
‑
12。peng等人指出：
[0068]
蜡样芽胞杆菌群的孢子是复杂的多层结构。含有核心的类核被包围在肽聚糖皮层内，该皮层被孢子外壳包围。所有蜡样芽胞杆菌群物种的孢子都被称为孢子外壁的额外松散层包围，这种孢子外壁不存在于其他物种中，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其外壳构成成熟孢子的最外层。孢子外壁是气球状层，作为孢子的外部渗透屏障，有助于孢子存活和毒力。
[0069]
之前发现，来自bcla和bclb n端区域的某些序列可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁(参见美国专利申请公开号2010/0233124和2011/0281316，以及thompson et al.，“targeting of the bcla and bclb proteins to the bacillus anthracis spore surface”，molecular microbiology 70(2)：421
‑
34(2008))。还发现炭疽芽孢杆菌的beta/bas3290蛋白定位于孢子外壁。在美国专利申请公开号2016/0031948和2016/0108096中描述了可以掺入融合蛋白并用于将目的肽或蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的其他靶向序列以及孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白的片段，所述美国专利申请公开号2016/0031948和2016/0108096以引用的方式全文纳入本文。
[0070]
特别是，已发现炭疽芽孢杆菌sterne菌株bcla的氨基酸20
‑
35足以靶向至孢子外壁。图1a和1b显示了bcla的氨基酸1
‑
41(seq id no：1)与几种其他蜡样芽孢杆菌家族孢子外壁蛋白和具有相关序列的蜡样芽孢杆菌家族蛋白的相应n端区域的序列比对。从图1a和1b可以看出，在对应于bcla的氨基酸20
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41的区域中，在所有蛋白质中存在高度同源性的区域。然而，在这些序列中，与bcla的氨基酸36
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41对应的氨基酸含有二级结构，并且对于融合蛋白定位到孢子外壁来说不是必需的。bcla的保守靶向序列区域(seq id no：1的氨基酸20
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35)在图1a和1b中以粗体显示。靶向序列中跨越bcla氨基酸25
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35的一个更高度保守的区域在图1a和1b的序列中用下划线标出，该区域是exsfa/bxpb/exsfb和同源物的识别序列，它们在孢子外壁表面指导和组装所述蛋白质。图1a中seq id no：3、5和7的氨基酸序列分别为炭疽芽孢杆菌sterne菌株beta/bas3290的氨基酸1
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33、甲硫氨酸后跟炭疽芽孢杆菌sterne菌株bas4623的氨基酸2
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43、和炭疽芽孢杆菌sterne菌株bclb的氨基酸1
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34。(对于bas4623，发现用甲硫氨酸替换天然蛋白中1位存在的缬氨酸导致更好的表达。)从图1a可以看出，这些序列中的每一个都包含对应于bcla的氨基酸20
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35的保守区(seq id no：1；以粗体显示)和对应于bcla的氨基酸25
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35的更高度保守的区域(下划线)。
[0071]
来自蜡样芽孢杆菌家族成员的其他蛋白质也含有保守靶向区域。特别地，在图1a和1b中，seq id no：9是炭疽芽孢杆菌sterne菌株bas1882的氨基酸1
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30，seq id no：11是bacillus weihenstephensis kbab4 2280基因产物的氨基酸1
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39，seq id no：13是bacillus weihenstephensis kbab4 3572基因产物的氨基酸1
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39，seq id no：15是蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽的氨基酸1
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49，seq id no：17是蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸1
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33，seq id no：19是蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663的氨基酸1
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39，seq id no：21是bacillus weihenstephensis kbab4 yvtnβ螺旋桨蛋白的氨基酸1
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39，seq id no：23是bacillus weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1
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30，seq id no：25是bacillus weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1
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30，seq id no：27是bacillus weihenstephensis kbab4含有三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
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36，seq id no：29是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1
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39seq id no：31是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1
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30，seq id no：33是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1
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21，seq id no：35是苏云金芽孢杆菌35646胶原蛋白三螺旋重复蛋白的氨基酸1
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22，seq id no：43是蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652的氨基酸1
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35，seq id no：45是蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导序列wp016117717的氨基酸1
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41，seq id no：47是蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸1
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49，seq id no：49是蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353的氨基酸1
‑
38，seq id no：51是蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸1
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39，seq id no：53是蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸1
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39，seq id no：55是苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525的氨基酸1
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36，seq id no：57是蜡样芽孢杆菌假设蛋白tigr03720的氨基酸1
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136，seq id no：59是蜡样芽孢杆菌atcc 10987胶原蛋白三螺旋重复结构域蛋白的氨基酸1
‑
36，seq id no：61是蜡样芽孢杆菌e33l胶原蛋白样蛋白的氨基酸1
‑
39，seq id no：63是b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
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41，seq id no：65是苏云金芽孢杆菌菌株al hakam假设蛋白balh_2230的氨基酸1
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30，seq id no：67是蜡样芽孢杆菌atcc14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
33，seq id no：69是蜡样芽孢杆菌胶原蛋白三螺旋重复的氨基酸1
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44，seq id no：71是蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
38，seq id no：73是蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk1835的氨基酸1
‑
30，seq id no：75是b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
48，seq id no：77是蜡样芽胞杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
30，seq id no：79是蜡样芽胞杆菌atcc 14579假设蛋白bc4725的氨基酸1
‑
39，seq id no：81是蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk4476的氨基酸1
‑
44，seq id no：83是炭疽芽孢杆菌菌株
‘
ames ancestor’含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
40，seq id no：85是苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97
‑
27bcla蛋白的氨基酸1
‑
34，seq id no：87是蜡样芽孢杆菌atcc 10987保守假设蛋白的氨基酸1
‑
34，seq id no：89是蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸1
‑
34，seq id no：91是蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导肽部分序列的氨基酸1
‑
99，seq id no：93是b.weihenstephanensis假设蛋白er45_27600的氨基酸1
‑
136。如图1a和1b所示，这些蛋白的每个n端区域含有与bcla(seq id no：1)的氨基酸20
‑
35保守的区域，以及对应于bcla的氨基酸25
‑
35的更高度保守的区域。
[0072]
来自苏云金芽孢杆菌的bcla(seq id no：204)的氨基酸1
‑
41和来自炭疽芽孢杆菌的bcla(seq id no：206)的氨基酸1
‑
41与seq id no：2相同，因此未在图1中描绘。
[0073]
包含氨基酸20
‑
35的bcla的任何部分均可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。此外，全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。因此，全长bcla或包含氨基酸20
‑
35的bcla片段可用于靶向至孢子外壁。例如，全长bcla(seq id no：2、204或206)或缺少羧基端的bcla中型片段，如seq id no：95或207(bcla的氨基酸1
‑
196)或205(bcla的氨基酸1
‑
166)，可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。中型片段，如seq id no：95、205和207的片段，其二级结构少于全长bcla，已发现适合用作靶向序列。靶向序列还可以包含bcla的更短的部分，其包含氨基酸20
‑
35，如seq id no：1(bcla的氨基酸1
‑
41)、seq id no：1的氨基酸1
‑
35、seq id no：1的氨基酸20
‑
35或seq id no：96(与bcla的氨基酸20
‑
35连接的甲硫氨酸残基)。甚至更短的bcla片段(仅包含氨基酸20
‑
35中的一些)也显示出将融合蛋白靶向至孢子外壁的能力。例如，靶向序列可以包含seq id no：1的氨基酸22
‑
31、
seq id no：1的氨基酸22
‑
33或seq id no：1的氨基酸20
‑
31。
[0074]
替代地，以下蛋白的任何包含对应于bcla的氨基酸20
‑
35的氨基酸的部分可作为靶向序列：beta/bas3290、bas4623、bclb、bas1882、kbab42280基因产物、kbab43572基因产物、蜡样芽胞杆菌vd200孢子外壁前导肽、蜡样芽胞杆菌vd166孢子外壁前导肽、蜡样芽胞杆菌vd200假设蛋白ikg_04663、b.weihenstephensis kbab4 yvtnβ螺旋桨蛋白、b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363、b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131、b.weihenstephensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc00001_21660、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510、苏云金芽孢杆菌35646胶原蛋白三螺旋重复蛋白、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导序列wp016117717、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369、蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770、苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525、蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720、蜡样芽孢杆菌atcc 10987胶原蛋白三螺旋重复结构域蛋白、蜡样芽孢杆菌e33l胶原蛋白样蛋白、b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白、苏云金芽孢杆菌菌株a1 hakam假设蛋白balh_2230、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白、蜡样芽孢杆菌胶原蛋白三螺旋重复、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白、蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk1835、b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白、蜡样芽孢杆菌atcc 14579假设蛋白bc4725、蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk4476、炭疽芽孢杆菌菌株
‘
ames ancestor’含三螺旋重复的胶原蛋白、苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97
‑
27 bcla蛋白、蜡样芽孢杆菌atcc 10987保守假设蛋白、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导肽部分序列或b.weihenstephanensis假设蛋白er45_27600。
[0075]
从图1a可以看出，beta/bas3290的氨基酸12
‑
27、bas4623的氨基酸23
‑
38、bclb的氨基酸13
‑
28、bas1882的氨基酸9
‑
24、kbab4 2280基因产物的氨基酸18
‑
33、kbab4 3572基因产物的氨基酸18
‑
33、蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽的氨基酸28
‑
43、蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸12
‑
27、蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663的氨基酸18
‑
33、b.weihenstephensis kbab4 yvtnβ螺旋桨蛋白的氨基酸18
‑
33、b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9
‑
24、b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9
‑
24、b.weihenstephensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸15
‑
30、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18
‑
33、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9
‑
24、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1
‑
15、苏云金芽孢杆菌35646胶原蛋白三螺旋重复蛋白的氨基酸1
‑
16、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652的氨基酸14
‑
29、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导序列wp016117717的氨基酸20
‑
35、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸28
‑
43、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353的氨基酸17
‑
32、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸18
‑
33、蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸18
‑
33、苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525的氨基酸15
‑
30和蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720的氨基酸115
‑
130对应于bcla的氨基酸20
‑
35。从’661公开文本的图1b可以看出，蜡样芽孢杆菌atcc 10987胶原蛋白
三螺旋重复结构域蛋白的氨基酸15
‑
30、蜡样芽孢杆菌e33l胶原蛋白样蛋白的氨基酸18
‑
33、b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸20
‑
35、苏云金芽孢杆菌菌株al hakam假设蛋白balh_2230的氨基酸9
‑
24、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸12
‑
27、蜡样芽孢杆菌胶原蛋白三螺旋重复的氨基酸23
‑
38、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸17
‑
32、蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk1835的氨基酸9
‑
24、b.weihenstephanensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸27
‑
42、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸9
‑
24、蜡样芽孢杆菌atcc 14579假设蛋白bc4725的氨基酸18
‑
33、蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk4476的氨基酸23
‑
38、炭疽芽孢杆菌菌株
‘
ames ancestor’含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸19
‑
34、苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97
‑
27bcla蛋白的氨基酸13
‑
28、蜡样芽孢杆菌atcc 10987保守假设蛋白的氨基酸13
‑
28、蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白的氨基酸13
‑
28、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导肽部分序列的氨基酸78
‑
93和b.weihenstephanensis假设蛋白er45_27600的氨基酸115
‑
130对应于bcla的氨基酸20
‑
35。因此，包含上述列出的相应氨基酸的这些蛋白质的任何部分都可用作靶向序列。
[0076]
此外，任何包含bcla的氨基酸20
‑
35，或任何上述列出的相应氨基酸的氨基酸序列，均可作为靶向序列。
[0077]
靶向序列可以包含seq id no：1的氨基酸1
‑
35、seq id no：1的氨基酸20
‑
35、seq id no：1、seq id no：96、seq id no：1的氨基酸22
‑
31、seq id no：1的氨基酸22
‑
33或seq id no：1的氨基酸20
‑
31。替代地，靶向序列可以由seq id no：1的氨基酸1
‑
35、seq id no：1的氨基酸20
‑
35、seq id no：1或seq id no：96组成。替代地，靶向序列可以由seq id no：1的氨基酸22
‑
31、seq id no：1的氨基酸22
‑
33或seq id no：1的氨基酸20
‑
31组成。替代地，孢子外壁蛋白可包含全长bcla(seq id no：2)，或孢子外壁蛋白片段可包含缺少羧基端的bcla的中型片段，如seq id no：95(bcla的氨基酸1
‑
196)。替代地，孢子外壁蛋白片段可由seq id no：95组成。
[0078]
靶向序列可以包含seq id no：1的氨基酸2
‑
35；seq id no：1的氨基酸5
‑
35；seq id no：1的氨基酸8
‑
35；seq id no：1的氨基酸10
‑
35；或seq id no：1的氨基酸15
‑
35。
[0079]
靶向序列可以包含seq id no：3的氨基酸1
‑
27、seq id no：3的氨基酸12
‑
27或seq id no：3，或者孢子外壁蛋白可以包含全长beta/bas3290(seq id no：4)。还发现与beta/bas3290的氨基酸12
‑
27连接的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：97。替代地，靶向序列可以包含seq id no：3的氨基酸14
‑
23、seq id no：3的氨基酸14
‑
25或seq id no：3的氨基酸12
‑
23。
[0080]
靶向序列可以包含seq id no：3的氨基酸2
‑
27；seq id no：3的氨基酸5
‑
27；seq id no：3的氨基酸8
‑
27；或seq id no：3的氨基酸10
‑
27。
[0081]
靶向序列可以包含seq id no：5的氨基酸1
‑
38、seq id no：5的氨基酸23
‑
38、seq id no：5或seq id no：201(与bas4623的氨基酸23
‑
38连接的甲硫氨酸残基)或孢子外壁蛋白可以包含全长bas4623(seq id no：6)。
[0082]
靶向序列可以包含seq id no：5的氨基酸2
‑
38；seq id no：5的氨基酸5
‑
38；seq id no：5的氨基酸8
‑
38；seq id no：5的氨基酸10
‑
38；seq id no：5的氨基酸15
‑
38；或seq id no：5的氨基酸20
‑
38。
[0083]
替代地，靶向序列可以包含seq id no：7的氨基酸1
‑
28、seq id no：7的氨基酸13
‑
28、seq id no：7或seq id no：202(与bclb的氨基酸13
‑
28连接的甲硫氨酸残基)，或者孢子外壁蛋白可以包含全长bclb(seq id no：8)。
[0084]
靶向序列可以包含seq id no：7的氨基酸2
‑
28；seq id no：7的氨基酸5
‑
28；seq id no：7的氨基酸8
‑
28；或seq id no：7的氨基酸10
‑
28。
[0085]
靶向序列可以包含seq id no：9的氨基酸1
‑
24、seq id no：9的氨基酸9
‑
24或seq id no：9，或者孢子外壁蛋白可以包含全长bas1882(seq id no：10)。与bas1882氨基酸9
‑
24相连的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：105。
[0086]
靶向序列可以包含seq id no：9的氨基酸2
‑
24；seq id no：9的氨基酸5
‑
24；或seq id no：9的氨基酸8
‑
24。
[0087]
靶向序列可以包含seq id no：11的氨基酸1
‑
33、seq id no：11的氨基酸18
‑
33或seq id no：11，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4 2280基因产物(seq id no：12)。可将与b.weihenstephensis kbab4 2280基因产物的氨基酸18
‑
33连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：98。
[0088]
靶向序列可以包含seq id no：11的氨基酸2
‑
33；seq id no：11的氨基酸5
‑
33；seq id no：11的氨基酸8
‑
33；seq id no：11的氨基酸10
‑
33；或seq id no：11的氨基酸15
‑
33。
[0089]
靶向序列还可以包含seq id no：13的氨基酸1
‑
33、seq id no：13的氨基酸18
‑
33或seq id no：13，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4 3572基因产物(seq id no：14)。可将与b.weihenstephensis kbab4 3572基因产物的氨基酸18
‑
33连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：99。
[0090]
靶向序列可以包含seq id no：13的氨基酸2
‑
33；seq id no：13的氨基酸5
‑
33；seq id no：13的氨基酸8
‑
33；seq id no：13的氨基酸10
‑
33；或seq id no：13的氨基酸15
‑
33。
[0091]
替代地，靶向序列可以包含seq id no：15的氨基酸1
‑
43、seq id no：15的氨基酸28
‑
43或seq id no：15，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌vd200孢子外壁前导肽(seq id no：16)。
[0092]
靶向序列可以包含seq id no：15的氨基酸2
‑
43；seq id no：15的氨基酸5
‑
43；seq id no：15的氨基酸8
‑
43；seq id no：15的氨基酸10
‑
43；seq id no：15的氨基酸15
‑
43；seq id no：15的氨基酸20
‑
43；或seq id no：15的氨基酸25
‑
43。
[0093]
靶向序列还可以包含seq id no：17的氨基酸1
‑
27、seq id no：17的氨基酸12
‑
27或seq id no：17，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌vd166孢子外壁前导肽(seq id no：18)。与蜡样芽胞杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸12
‑
27连接的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：100。
[0094]
靶向序列可以包含seq id no：17的氨基酸2
‑
27；seq id no：17的氨基酸5
‑
27；seq id no：17的氨基酸8
‑
27；或seq id no：17的氨基酸10
‑
27。
[0095]
靶向序列还可以包含seq id no：19的氨基酸1
‑
33、seq id no：19的氨基酸18
‑
33或seq id no：19，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌vd200假设蛋白ikg_04663(seq id no：20)。
[0096]
靶向序列可以包含seq id no：19的氨基酸2
‑
33；seq id no：19的氨基酸5
‑
33；seq id no：19的氨基酸8
‑
33；seq id no：19的氨基酸10
‑
33；或seq id no：19的氨基酸15
‑
33。
[0097]
替代地，靶向序列包含seq id no：21的氨基酸1
‑
33、seq id no：21的氨基酸18
‑
33或seq id no：21，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4 yvtnβ螺旋桨蛋白(seq id no：22)。可将与b.weihenstephensis kbab4 yvtnβ螺旋桨蛋白的氨基酸18
‑
33连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：101。
[0098]
靶向序列可以包含seq id no：21的氨基酸2
‑
33；seq id no：21的氨基酸5
‑
33；seq id no：21的氨基酸8
‑
33；seq id no：21的氨基酸10
‑
33；或seq id no：21的氨基酸15
‑
33。
[0099]
靶向序列还可以包含seq id no：23的氨基酸1
‑
24、seq id no：23的氨基酸9
‑
24或seq id no：23，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363(seq id no：24)。可将与b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9
‑
24连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：102。
[0100]
靶向序列可以包含seq id no：23的氨基酸2
‑
24；seq id no：23的氨基酸5
‑
24；或seq id no：23的氨基酸8
‑
24。
[0101]
靶向序列包含seq id no：25的氨基酸1
‑
24、seq id no：25的氨基酸9
‑
24或seq id no：25，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131(seq id no：26)。可将与b.weihenstephensis kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9
‑
24连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：103。
[0102]
靶向序列可以包含seq id no：25的氨基酸2
‑
24；seq id no：25的氨基酸5
‑
24；或seq id no：25的氨基酸8
‑
24。
[0103]
替代地，靶向序列包含seq id no：27的氨基酸1
‑
30、seq id no：27的氨基酸15
‑
30或seq id no：27，或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：28)。
[0104]
靶向序列可以包含seq id no：27的氨基酸2
‑
30；seq id no：27的氨基酸5
‑
30；seq id no：27的氨基酸8
‑
30；或seq id no：27的氨基酸10
‑
30。
[0105]
靶向序列还可以包含seq id no：29的氨基酸1
‑
33、seq id no：29的氨基酸18
‑
33或seq id no：29，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660(seq id no：30)。
[0106]
靶向序列可以包含seq id no：29的氨基酸2
‑
33；seq id no：29的氨基酸5
‑
33；seq id no：29的氨基酸8
‑
33；seq id no：29的氨基酸10
‑
33；或seq id no：29的氨基酸15
‑
33。
[0107]
靶向序列还可以包含seq id no：31的氨基酸1
‑
24、seq id no：31的氨基酸9
‑
24或seq id no：31，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540(seq id no：32)。可将与蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9
‑
24连接的甲硫氨酸残基用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：104。
[0108]
靶向序列可以包含seq id no：31的氨基酸2
‑
24；seq id no：31的氨基酸5
‑
24；或seq id no：31的氨基酸8
‑
24。
[0109]
替代地，靶向序列包含seq id no：33的氨基酸1
‑
15、seq id no：33，或者孢子外壁蛋白包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510(seq id no：34)。
[0110]
靶向序列还可以包含seq id no：35的氨基酸1
‑
16、seq id no：35，或者孢子外壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌35646胶原蛋白三螺旋重复蛋白(seq id no：36)。
[0111]
靶向序列可包含seq id no：43的氨基酸1
‑
29、seq id no：43的氨基酸14
‑
29或seq id no：43，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652(seq id no：44)。
[0112]
靶向序列可以包含seq id no：43的氨基酸2
‑
29；seq id no：43的氨基酸5
‑
29；seq id no：43的氨基酸8
‑
29；或seq id no：43的氨基酸10
‑
29。
[0113]
替代地，靶向序列可以包含seq id no：45的氨基酸1
‑
35、seq id no：45的氨基酸20
‑
35或seq id no：45，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导序列wp016117717(seq id no：46)。与蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导序列wp016117717的氨基酸20
‑
35连接的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可以包含seq id no：106。
[0114]
靶向序列可以包含seq id no：45的氨基酸2
‑
35；seq id no：45的氨基酸5
‑
35；seq id no：45的氨基酸8
‑
35；seq id no：45的氨基酸10
‑
35；或seq id no：45的氨基酸15
‑
35。
[0115]
靶向序列可以包含seq id no：47的氨基酸1
‑
43、seq id no：47的氨基酸28
‑
43或seq id no：47，或孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192(seq id no：48)。
[0116]
靶向序列可以包含seq id no：47的氨基酸2
‑
43；seq id no：47的氨基酸5
‑
43；seq id no：47的氨基酸8
‑
43；seq id no：47的氨基酸10
‑
43；seq id no：47的氨基酸15
‑
43；seq id no：47的氨基酸20
‑
43；或seq id no：47的氨基酸25
‑
43。
[0117]
靶向序列可以包含seq id no：49的氨基酸1
‑
32、seq id no：49的氨基酸17
‑
32或seq id no：49，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353(seq id no：50)。
[0118]
靶向序列可以包含seq id no：49的氨基酸2
‑
32；seq id no：49的氨基酸5
‑
32；seq id no：49的氨基酸8
‑
32；seq id no：49的氨基酸10
‑
32；或seq id no：49的氨基酸15
‑
32。
[0119]
替代地，靶向序列可以包含seq id no：51的氨基酸1
‑
33、seq id no：51的氨基酸18
‑
33或seq id no：51，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369(seq id no：52)。
[0120]
靶向序列可以包含seq id no：51的氨基酸2
‑
33；seq id no：51的氨基酸5
‑
33；seq id no：51的氨基酸8
‑
33；seq id no：51的氨基酸10
‑
33；或seq id no：51的氨基酸15
‑
33。
[0121]
靶向序列可以包含seq id no：53的氨基酸1
‑
33、seq id no：53的氨基酸18
‑
33或seq id no：53，或孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770(seq id no：54)。
[0122]
靶向序列可以包含seq id no：53的氨基酸2
‑
33；seq id no：53的氨基酸5
‑
33；seq id no：53的氨基酸8
‑
33；seq id no：53的氨基酸10
‑
33；或seq id no：53的氨基酸15
‑
33。
[0123]
替代地，靶向序列可以包含seq id no：55的氨基酸1
‑
30、seq id no：55的氨基酸15
‑
30或seq id no：55，或者孢子外壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525(seq id no：56)。
[0124]
靶向序列可以包含seq id no：55的氨基酸2
‑
30；seq id no：55的氨基酸5
‑
30；seq id no：55的氨基酸8
‑
30；或seq id no：55的氨基酸10
‑
30。
[0125]
靶向序列可以包含seq id no：57的氨基酸1
‑
130、seq id no：57的氨基酸115
‑
130或seq id no：57，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720(seq id no：58)。
[0126]
靶向序列可以包含seq id no：57的氨基酸2
‑
130；seq id no：57的氨基酸5
‑
130；seq id no：57的氨基酸10
‑
130；seq id no：57的氨基酸20
‑
130；seq id no：57的氨基酸30
‑
130；seq id no：57的氨基酸40
‑
130；seq id no：57的氨基酸50
‑
130；seq id no：57的氨基酸60
‑
130；seq id no：57的氨基酸70
‑
130；seq id no：57的氨基酸80
‑
130；seq id no：57的氨基酸90
‑
130；seq id no：57的氨基酸100
‑
130；或seq id no：57的氨基酸110
‑
130。
[0127]
靶向序列可以包含seq id no：59的氨基酸1
‑
30；或seq id no：59；或孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 10987胶原蛋白三螺旋重复结构域蛋白(seq id no：60)。
[0128]
靶向序列可以包含seq id no：59的氨基酸2
‑
30；seq id no：59的氨基酸4
‑
30；或seq id no：59的氨基酸6
‑
30。
[0129]
靶向序列可以包含seq id no：61的氨基酸1
‑
33；seq id no：61的氨基酸18
‑
33；或seq id no：61；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌e33l胶原蛋白样蛋白(seq id no：62)。
[0130]
靶向序列可以包含seq id no：61的氨基酸2
‑
33；seq id no：61的氨基酸5
‑
33；seq id no：61的氨基酸10
‑
33；或seq id no：61的氨基酸15
‑
33。
[0131]
靶向序列可以包含seq id no：63的氨基酸1
‑
35；或seq id no：63；或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：64)。
[0132]
靶向序列可以包含seq id no：63的氨基酸2
‑
35；seq id no：63的氨基酸5
‑
35；seq id no：63的氨基酸8
‑
35；seq id no：63的氨基酸10
‑
35；或seq id no：63的氨基酸15
‑
35。
[0133]
靶向序列可以包含seq id no：65的氨基酸1
‑
24；seq id no：65的氨基酸9
‑
24；seq id no：65；或seq id no：107；或者孢子外壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌菌株al hakam假设蛋白balh_2230(seq id no：66)。
[0134]
靶向序列可以包含seq id no：65的氨基酸2
‑
24；或seq id no：65的氨基酸5
‑
24。
[0135]
靶向序列可以包含seq id no：67的氨基酸1
‑
27；seq id no：67的氨基酸12
‑
27；或seq id no：67；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc14579含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：68)。
[0136]
靶向序列可以包含seq id no：67的氨基酸2
‑
27；seq id no：67的氨基酸5
‑
27；或seq id no：67的氨基酸10
‑
27。
[0137]
靶向序列可以包含seq id no：69的氨基酸1
‑
38；seq id no：69的氨基酸23
‑
38；或seq id no：69；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌胶原蛋白三螺旋重复(seq id no：70)。
[0138]
靶向序列可以包含seq id no：69的氨基酸2
‑
38；seq id no：69的氨基酸5
‑
38；seq id no：69的氨基酸10
‑
38；或seq id no：69的氨基酸15
‑
38。
[0139]
孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：72)。
[0140]
靶向序列可以包含seq id no：73，或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌e33l假设蛋白bczk1835(seq id no：74)。
[0141]
靶向序列可以包含seq id no：75的氨基酸1
‑
42；seq id no：75的氨基酸27
‑
42；或seq id no：75；或者孢子外壁蛋白可以包含全长b.weihenstephensis kbab4含三螺旋重复
的胶原蛋白(seq id no：76)。
[0142]
靶向序列可以包含seq id no：75的氨基酸2
‑
42；seq id no：75的氨基酸5
‑
42；seq id no：75的氨基酸10
‑
42；seq id no：75的氨基酸15
‑
42；seq id no：75的氨基酸20
‑
42；或seq id no：75的氨基酸25
‑
42。
[0143]
靶向序列可以包含seq id no：77的氨基酸1
‑
24；seq id no：77的氨基酸9
‑
24；或seq id no：77；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：78)。
[0144]
靶向序列可以包含seq id no：77的氨基酸2
‑
24；或seq id no：77的氨基酸5
‑
24。
[0145]
孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 14579假设蛋白bc4725(seq id no：80)。
[0146]
靶向序列可以包含seq id no：81的氨基酸1
‑
38；seq id no：81的氨基酸23
‑
38；或seq id no：81；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽胞杆菌e33l假设蛋白bczk4476(seq id no：82)。
[0147]
靶向序列可以包含seq id no：81的氨基酸2
‑
38；seq id no：81的氨基酸5
‑
38；seq id no：81的氨基酸10
‑
38；seq id no：81的氨基酸15
‑
38；或seq id no：81的氨基酸20
‑
38。
[0148]
靶向序列可以包含seq id no：83的氨基酸1
‑
34；或seq id no：83；或者孢子外壁蛋白可以包含全长炭疽芽孢杆菌菌株’ames ancestor’含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：84)。
[0149]
所述孢子外壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97
‑
27bcla蛋白(seq id no：86)。
[0150]
靶向序列可以包含seq id no：87的氨基酸1
‑
28；seq id no：87的氨基酸13
‑
28；或seq id no：87；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 10987保守假设蛋白(seq id no：88)。
[0151]
靶向序列可以包含seq id no：87的氨基酸2
‑
28；seq id no：87的氨基酸5
‑
28；或seq id no：87的氨基酸10
‑
28。
[0152]
靶向序列可以包含seq id no：89的氨基酸1
‑
28；或seq id no：89；或者孢子外壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌atcc 14579含三螺旋重复的胶原蛋白(seq id no：90)。
[0153]
靶向序列可以包含seq id no：89的氨基酸2
‑
28；seq id no：89的氨基酸5
‑
28；或seq id no：89的氨基酸10
‑
28。
[0154]
靶向序列可以包含seq id no：91的氨基酸1
‑
93；或seq id no：91；或者孢子外壁蛋白可以包含蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导肽部分序列(seq id no：92)。
[0155]
靶向序列可以包含seq id no：91的氨基酸2
‑
93；seq id no：91的氨基酸10
‑
93；seq id no：91的氨基酸20
‑
93；seq id no：91的氨基酸30
‑
93；seq id no：91的氨基酸40
‑
93；seq id no：91的氨基酸50
‑
93；或seq id no：91的氨基酸60
‑
93。
[0156]
靶向序列可以包含seq id no：93的氨基酸1
‑
130；或seq id no：93；或者孢子外壁蛋白可以包含b.weihenstephanensis假设蛋白er45_27600，部分序列(seq id no：94)。
[0157]
靶向序列可以包含seq id no：93的氨基酸2
‑
130；seq id no：93的氨基酸10
‑
130；seq id no：93的氨基酸20
‑
130；或seq id no：93的氨基酸30
‑
130。
[0158]
靶向序列可以包括seq id no：204的氨基酸1
‑
35、seq id no：204的氨基酸20
‑
35、
seq id no：204或seq id no：205。
[0159]
靶向序列可以包含seq id no：206的氨基酸1
‑
35、seq id no：206的氨基酸20
‑
35、seq id no：206或seq id no：207。
[0160]
此外，已发现短于bcla的氨基酸20
‑
35的序列可用于将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。特别是，bcla的氨基酸20
‑
33、bcla的氨基酸20
‑
31、bcla的氨基酸21
‑
33或bcla的氨基酸23
‑
31可用于将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。因此，靶向序列可以由seq id no：1的氨基酸20
‑
33、seq id no：1的氨基酸20
‑
31、seq id no：1的氨基酸21
‑
33或seq id no：1的氨基酸23
‑
31组成。图1a和1b所示的任何seq id no.的相应区域也可用于将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。“相应区域”是指当序列与seq id no：1比对时，如图1a和1b所示，与seq id no：的氨基酸对齐的其他氨基酸序列的区域是那些序列的“相应区域”。因此，如seq id no：3的氨基酸12
‑
25、seq id no：5的氨基酸23
‑
36、seq id no：7的氨基酸13
‑
26等，可用于将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁，因为这些区域与seq id no：1的氨基酸20
‑
33对齐，如图1a所示。
[0161]
bcla的氨基酸20
‑
35中更短的区域也可用于将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。特别地，可以使用包含seq id no：1的氨基酸25
‑
30或来自图1a和1b所示的任何序列的相应氨基酸的任何氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，从seq id no：1的氨基酸25
‑
30或图1a和1b中所示的任何序列的相应区域开始，可以将额外的氨基酸添加到氨基端、羧基端或氨基端和羧基端两端，以产生将有效地将融合蛋白靶向到重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列。
[0162]
此外，从’661公开文本的图1a和1b中的序列比对可以容易地看出，虽然bcla的氨基酸20
‑
35是保守的，并且氨基酸25
‑
35是更保守的，但是在该区域中可以发生一定程度的变异，而不影响靶向序列将蛋白质靶向至孢子外壁的能力。’661公开文本的图1a和1b列出了各序列的各相应氨基酸与bcla的氨基酸20
‑
35(“20
‑
35％同一性”)和bcla的氨基酸25
‑
35(“25
‑
35％同一性”)的百分比同一性。因此，例如，与bcla的氨基酸20
‑
35相比，beta/bas3290的相应氨基酸约81.3％相同，bas4623的相应氨基酸约50.0％相同，bclb的相应氨基酸约43.8％相同，bas1882的相应氨基酸约62.5％相同，kbab42280基因产物的相应氨基酸约81.3％相同，和kbab43572基因产物的相应氨基酸约81.3％相同。在图1a和1b中列出了剩余序列在该区域上的序列同一性。
[0163]
关于bcla的氨基酸25
‑
35，beta/bas3290的相应氨基酸约90.9％相同，bas4623的相应氨基酸约72.7％相同，bclb的相应氨基酸约54.5％相同，bas1882的相应氨基酸约72.7％相同，kbab42280基因产物的相应氨基酸约90.9％相同，和kbab43572基因产物的相应氨基酸约81.8％相同。在图1a和1b中列出了剩余序列在该区域上的序列同一性。
[0164]
因此，靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约54％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约43％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约54％。
[0165]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸
序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0166]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0167]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约56％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0168]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。替代地，靶向序列可以由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约62％同一性，其中与seq id no：1的氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0169]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少68％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0170]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性，其中与seq id no：1的氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0171]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。替代地，靶向序列由16个氨基酸组成的氨基酸序列组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性，其中与seq id no：1的氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0172]
靶向序列还可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0173]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约90％。替代地，靶向序列由这样的氨基酸序列组成，即所述氨基酸序列由16个氨基酸组成，并且与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约90％。
[0174]
本领域技术人员将认识到，上述序列的变体也可以用作靶向序列，只要靶向序列包含bcla的氨基酸20
‑
35，beta/bas3290、bas4263、bclb、bas1882、kbab42280基因产物或kbab 3572基因产物的相应氨基酸，或者存在包含与bcla的氨基酸20
‑
35和25
‑
35的任何上述序列同一性的序列。
[0175]
某些缺乏与bcla的氨基酸25
‑
35具有同源性的区域的蜡样芽孢杆菌家族孢子外壁
蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。特别地，融合蛋白可以包含含有seq id no：108(蕈状芽孢杆菌inha)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：109(炭疽芽孢杆菌sterne bas1141(exsy))的孢子外壁蛋白、含有seq id no：110(炭疽芽孢杆菌sterne bas1144(bxpb/exsfa))的孢子外壁蛋白、含有seq id no：111(炭疽芽孢杆菌sterne bas1145(coty))的孢子外壁蛋白、含有seq id no：112(炭疽芽孢杆菌sterne bas1140)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：113(炭疽芽孢杆菌h9401 exsfb)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：114(苏云金芽孢杆菌hd74 inha1)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：115(蜡样芽孢杆菌atcc 10876exsj)的孢子外壁蛋白、包含seq id no：116(蜡样芽孢杆菌exsh)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：117(炭疽芽孢杆菌ames yjca)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：118(炭疽芽孢杆菌yjcb)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：119(炭疽芽孢杆菌sterne bclc)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：120(苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97
‑
27酸性磷酸酶)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：121(苏云金芽孢杆菌hd74inha2)的孢子外壁蛋白、含有seq id no：122(蕈状芽孢杆菌inha3)的孢子外壁蛋白或含有seq id no：203(炭疽芽孢杆菌coty变体)的孢子外壁蛋白。在本文所述的融合蛋白中包含含有seq id no：108
‑
122或203中任一种的孢子外壁蛋白将导致靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
[0176]
此外，与上述任何全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段具有高度序列同一性的孢子外壁蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。因此，融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其含有与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0177]
替代地，融合蛋白可包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有至少90％同一性的孢子外壁蛋白。
[0178]
融合蛋白可以包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有至少95％同一性的孢子外壁蛋白。
[0179]
融合蛋白可以包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有至少98％同一性的孢子外壁蛋白。
[0180]
融合蛋白可以包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有至少99％同一性的孢子外壁蛋白。
[0181]
融合蛋白可包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、
32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和203中任一个具有100％同一性的孢子外壁蛋白。
[0182]
本发明的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段也可以根据提供靶向功能的基序(motif)来描述。图1a和1b显示了bcla的氨基端区域(seq id no：1)与许多其他蜡样芽孢杆菌家族成员孢子外壁蛋白的相应氨基端区域的序列比对。从图1可以看出，在bcla的氨基酸20
‑
35处存在保守基序(图1中以粗体显示)，在bcla的氨基酸25
‑
35处存在更高度保守的基序(图1中以粗体显示并加下划线)。这个更高度保守的区域是exsfa/bxpb/exsfb和同源物的识别序列，所述exsfa/bxpb/exsfb和同源物在孢子外壁表面引导并装配所描述的孢子外壁蛋白。
[0183]
此外，虽然bcla的氨基酸20
‑
35是保守的，而氨基酸25
‑
35是更保守的，但在该区域可能发生一定程度的变异，而不影响靶向序列将蛋白质靶向至孢子外壁的能力。图1列出了每个序列的相应氨基酸与bcla的氨基酸20
‑
35(“20
‑
35％同一性”)和bcla的氨基酸25
‑
35(“25
‑
35％同一性”)的百分比同一性。与bcla的氨基酸20
‑
35(seq id no：1)具有低至43.8％的靶向序列同一性(其中与bcla的氨基酸25
‑
35的同一性为54.5％)的序列保留将融合蛋白靶向至孢子外壁的能力。pct公开号wo 2016/044661的实施例59中的表58提供了数据，其通过引用的方式全文纳入本文。表58显示了表达融合蛋白的蜡样芽孢杆菌家族成员孢子上的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c基因(pc
‑
plc)和脂肪酶的酶水平，所述融合蛋白含有这些酶和各种靶向序列。pct公开号wo 2016/044661的表58的相关部分复制如下，添加了两个额外的栏，以显示各靶向序列与bcla的氨基酸20
‑
35和25
‑
35(seq id no：1)的百分比同一性：
[0184][0185]
这些数据表明，使用与bcla的氨基酸20
‑
35(seq id no：1)具有50
‑
68.8％同一性(其中与bcla的氨基酸25
‑
35的同一性为63.6％至81.8％)的靶向序列，可以实现将目的蛋白(例如酶)靶向至孢子外壁蛋白。这种基序存在于将融合蛋白靶向至重组芽孢杆菌属细菌的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段中，并包含序列x1‑
x2‑
x3‑
x4‑
x5‑
x6‑
x7‑
x8‑
x9‑
x
10
‑
x
11
‑
x
12
‑
x
13
‑
x
14
‑
x
15
‑
x
16
，其中：
[0186]
x1是任何氨基酸或不存在；
[0187]
x2是苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)；
[0188]
x3是任何氨基酸；
[0189]
x4是脯氨酸(p)或丝氨酸(s)；
[0190]
x5是任何氨基酸；
[0191]
x6是亮氨酸(l)、天冬酰胺(n)、丝氨酸(s)或异亮氨酸(i)；
[0192]
x7是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；
[0193]
x8是甘氨酸(g)；
[0194]
x9是脯氨酸(p)；
[0195]
x
10
是苏氨酸(t)或脯氨酸(p)；
[0196]
x
11
是亮氨酸(l)或苯丙氨酸(f)；
[0197]
x
12
为脯氨酸(p)；
[0198]
x
13
是任何氨基酸；
[0199]
x
14
是任何氨基酸；
[0200]
x
15
是脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)或苏氨酸(t)；和
[0201]
x
16
是脯氨酸(p)、苏氨酸(t)或丝氨酸(s)。
[0202]
任何靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于将任何目的蛋白或肽(包括本文所述的果胶酶)靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
[0203]
例如，任何靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段(例如seqid no：203
‑
207中的任一个)可用于将目的蛋白或肽(例如，seq id no：210
‑
227中的任一个)靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
[0204]
在表达本文所述的任何融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子形成过程中，靶向基序、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段被孢子外壁装配机制识别并导向孢子外壁，导致融合蛋白的目的蛋白或肽部分(例如，果胶酶)展示在孢子外部。
[0205]
使用不同的靶向序列可以控制融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员孢子表面的表达水平。使用本文所述的某些靶向序列将导致融合蛋白的较高表达水平，而使用其他靶向序列将导致融合蛋白在孢子表面的较低表达水平。
[0206]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在其羧基端包含氨基酸序列gxt，其中x是任何氨基酸。
[0207]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在对应于seq id no：1的氨基酸20的靶向序列位置处包含丙氨酸残基。
[0208]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段还可在紧邻所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的第一个氨基酸之前的氨基酸位置处或在所述靶向序列的对应于seq id no：1的氨基酸20的位置处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
[0209]
b.果胶酶——果胶裂合酶、果胶酸裂合酶和多聚半乳糖醛酸内切酶
[0210]
融合蛋白可包含果胶裂合酶、果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶。果胶酶作用于果胶和相关多糖以释放小糖类。具体而言，果胶裂合酶(ec 4.2.2.10)，也称为果胶酶
(pectolyases)、果胶酸裂合酶(ec 4.2.2.2)和多聚半乳糖醛酸酶，包括多聚半乳糖醛酸内切酶(ec 3.2.1.15)和多聚半乳糖醛酸外切酶(ec 3.2.1.67)，该酶为催化聚半乳糖醛酸主链中内部α
‑
1，4键裂解的酶类。聚半乳糖醛酸(galacturonan)存在于植物细胞壁内。然而，它们主要被称为果胶，其为胞间层的主要成分。聚半乳糖醛酸主要由α
‑
1，4连接的半乳糖醛酸单体组成，所述单体可被酯化和广泛修饰。通过果胶酶的作用从多糖中释放出的小糖类可以作为碳源被植物吸收，也可以喂养植物周围的固有微生物。研究提供了对多聚半乳糖醛酸内切酶i(包括来自黑曲霉的多聚半乳糖醛酸内切酶i和多聚半乳糖醛酸内切酶ii)活性的深入了解。参见，例如，van pouderoyen等人，“structural insights in to the processivity of endopolygalacturonase i from aspergillus niger，”febs letters 554：第462
‑
466页(2003年)。也可参见santen等人，“crystal structure of endopolygalacturonase ii from aspergillus niger and identification of active site residues by site
‑
directed mutagenesis，”the journal of biological chemistry 274：第30474
‑
30480页(1999年)。
[0211]
果胶酸裂合酶氨基酸序列连同其seq id no在下表2中提供。第二列中的第一个seq id no与具有其信号肽的酶的序列相对应。第二列中的第二个seq id no与无信号肽的酶的序列相对应。
[0212]
表2.果胶酸裂合酶的氨基酸序列
[0213][0214][0215]
多聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列及其seq id no在下表3中提供。seq id no：227与seq id no：210相同，只是在seq id no：210的羧基末端添加了一个半胱氨酸残基。
[0216]
表3.多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列
no：19的氨基酸1
‑
33的靶向序列；(82)包含seq id no：19的氨基酸18
‑
33的靶向序列；(83)包含seq id no：19的靶向序列；(84)包含与seq id no：20具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(85)包含seq id no：19的氨基酸2
‑
33的靶向序列；(86)包含seq id no：19的氨基酸5
‑
33的靶向序列；(87)包含seq id no：19的氨基酸8
‑
33的靶向序列；(88)包含seq id no：19的氨基酸10
‑
33的靶向序列；(89)包含seq id no：19的氨基酸15
‑
33的靶向序列；(90)包含seq id no：21的氨基酸1
‑
33的靶向序列；(91)包含seq id no：21的氨基酸18
‑
33的靶向序列；(92)包含seq id no：21的靶向序列；(93)包含与seq id no：22具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(94)包含seq id no：21的氨基酸2
‑
33的靶向序列；(95)包含seq id no：21的氨基酸5
‑
33的靶向序列；(96)包含seq id no：21的氨基酸8
‑
33的靶向序列；(97)包含seq id no：21的氨基酸10
‑
33的靶向序列；(98)包含seq id no：21的氨基酸15
‑
33的靶向序列；(99)包含seq id no：23的氨基酸1
‑
24的靶向序列；(100)包含seq id no：23的氨基酸9
‑
24的靶向序列；(101)包含seq id no：23的靶向序列；(102)包含与seq id no：24具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(103)包含seq id no：23的氨基酸2
‑
24的靶向序列；(104)包含seq id no：23的氨基酸5
‑
24的靶向序列；(105)包含seq id no：23的氨基酸8
‑
24的靶向序列；(106)包含seq id no：25的氨基酸1
‑
24的靶向序列：(107)包含seq id no：25的氨基酸9
‑
24的靶向序列；(108)包含seq id no：25的靶向序列；(109)包含与seq id no：26具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(110)包含seq id no：25的氨基酸2
‑
24的靶向序列；(111)包含seq id no：25的氨基酸5
‑
24的靶向序列；(112)包含seq id no：25的氨基酸8
‑
24的靶向序列；(113)包含seq id no：27的氨基酸1
‑
30的靶向序列；(114)包含seq id no：27的氨基酸15
‑
30的靶向序列；(115)包含seq id no：27的靶向序列；(116)包含与seq id no：28具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(117)包含seq id no：27的氨基酸2
‑
30的靶向序列；(118)包含seq id no：27的氨基酸5
‑
30的靶向序列；(119)包含seq id no：27的氨基酸8
‑
30的靶向序列；(120)包含seq id no：27的氨基酸10
‑
30的靶向序列；(121)包含seq id no：29的氨基酸1
‑
33的靶向序列；(122)包含seq id no：29的氨基酸18
‑
33的靶向序列；(123)包含seq id no：29的靶向序列；(124)包含与seq id no：30具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(125)包含seq id no：29的氨基酸2
‑
33的靶向序列；(126)包含seq id no：29的氨基酸5
‑
33的靶向序列；(127)包含seq id no：29的氨基酸8
‑
33的靶向序列；(128)包含seq id no：29的氨基酸10
‑
33的靶向序列；(129)包含seq id no：29的氨基酸15
‑
33的靶向序列；(130)包含seq id no：31的氨基酸1
‑
24的靶向序列；(131)包含seq id no：31的氨基酸9
‑
24的靶向序列；(132)包含seq id no：31的靶向序列；(133)包含与seq id no：32具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(134)包含seq id no：31的氨基酸2
‑
24的靶向序列；(135)包含seq id no：31的氨基酸5
‑
24的靶向序列；(136)包含seq id no：31的氨基酸8
‑
24的靶向序列；(137)包含seq id no：33的氨基酸1
‑
15的靶向序列；(138)包含seq id no：33的靶向序列；(139)包含与seq id no：34具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(140)包含seq id no：35的氨基酸1
‑
16的靶向序列；(141)包含seq id no：35的靶向序列；(142)包含与seq id no：36具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(143)包含seq id no：43的氨基酸1
‑
29的靶向序列；(144)包含seq id no：43的氨基酸14
‑
29的靶向序列；(145)包含seq id no：43的靶向序列；(146)包含与seq id no：44具有至少85％同
一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(147)包含seq id no：43的氨基酸2
‑
29的靶向序列；(148)包含seq id no：43的氨基酸5
‑
29的靶向序列；(149)包含seq id no：43的氨基酸8
‑
29的靶向序列；(150)包含seq id no：43的氨基酸10
‑
29的靶向序列；(151)包含seq id no：45的氨基酸1
‑
35的靶向序列；(152)包含seq id no：45的氨基酸20
‑
35的靶向序列；(153)包含seq id no：45的靶向序列；(154)包含与seq id no：46具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(155)包含seq id no：45的氨基酸2
‑
35的靶向序列；(156)包含seq id no：45的氨基酸5
‑
35的靶向序列；(157)包含seq id no：45的氨基酸8
‑
35的靶向序列；(158)包含seq id no：45的氨基酸10
‑
35的靶向序列；(159)包含seq id no：45的氨基酸15
‑
35的靶向序列；(160)包含seq id no：47的氨基酸1
‑
43的靶向序列；(161)包含seq id no：47的氨基酸28
‑
43的靶向序列；(162)包含seq id no：47的靶向序列；(163)包含与seq id no：48具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(164)包含seq id no：47的氨基酸2
‑
43的靶向序列；(165)包含seq id no：47的氨基酸5
‑
43的靶向序列；(166)包含seq id no：47的氨基酸8
‑
43的靶向序列；(167)包含seq id no：47的氨基酸10
‑
43的靶向序列；(168)包含seq id no：47的氨基酸15
‑
43的靶向序列；(169)包含seq id no：47的氨基酸20
‑
43的靶向序列；(170)包含seq id no：47的氨基酸25
‑
43的靶向序列；(171)包含seq id no：49的氨基酸1
‑
32的靶向序列；(172)包含seq id no：49的氨基酸17
‑
32的靶向序列；(173)包含seq id no：49的靶向序列；(174)包含与seq id no：50具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(175)包含seq id no：49的氨基酸2
‑
32的靶向序列；(176)包含seq id no：49的氨基酸5
‑
32的靶向序列；(177)包含seq id no：49的氨基酸8
‑
32的靶向序列；(178)包含seq id no：49的氨基酸10
‑
32的靶向序列；(179)包含seq id no：49的氨基酸15
‑
32的靶向序列；(180)包含seq id no：51的氨基酸1
‑
33的靶向序列；(181)包含seq id no：51的氨基酸18
‑
33的靶向序列；(182)包含seq id no：51的靶向序列；(183)包含与seq id no：52具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(184)包含seq id no：51的氨基酸2
‑
33的靶向序列；(185)包含seq id no：51的氨基酸5
‑
33的靶向序列；(186)包含seq id no：51的氨基酸8
‑
33的靶向序列；(187)包含seq id no：51的氨基酸10
‑
33的靶向序列；(188)包含seq id no：51的氨基酸15
‑
33的靶向序列；(189)包含seq id no：53的氨基酸1
‑
33的靶向序列；(190)包含seq id no：53的氨基酸18
‑
33的靶向序列；(191)包含seq id no：53的靶向序列；(192)包含与seq id no：54具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(193)包含seq id no：53的氨基酸2
‑
33的靶向序列；(194)包含seq id no：53的氨基酸5
‑
33的靶向序列；(195)包含seq id no：53的氨基酸8
‑
33的靶向序列；(196)包含seq id no：53的氨基酸10
‑
33的靶向序列；(197)包含seq id no：53的氨基酸15
‑
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的氨基酸5
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
31组成的靶向序列；(412)由seq id no：21的氨基酸21
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
13组成的靶向序列；(434)由seq id no：33的氨基酸1
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
25组成的靶向序列；(441)由seq id no：43的氨基酸15
‑
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‑
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‑
31组成的靶向序列；(444)由seq id no：45的氨基酸21
‑
33组成的靶向序列；(445)由seq id no：106的氨基酸1
‑
15组成的靶向序列；(446)由seq id no：106的氨基酸1
‑
13组成的靶向序列；(447)由seq id no：47的氨基酸28
‑
41组成的靶向序列；(448)由seq id no：47的氨基酸28
‑
39组成的靶向序列；(449)由seq id no：53的氨基酸18
‑
31组成的靶向序列；(450)由seq id no：53的氨基酸18
‑
29组成的靶向序列；(451)由seq id no：53的氨基酸19
‑
31组成的靶向序列；(452)包含seq id no：61的氨基酸18
‑
31的靶向序列；(453)包含seq id no：61的氨基酸18
‑
29的靶向序列；(454)包含seq id no：61的氨基酸19
‑
31的靶向序列；(455)包含seq id no：65的氨基酸9
‑
22的靶向序列；(456)包含seq id no：65的氨基酸9
‑
20的靶向序列；(457)包含seq id no：65的氨基酸10
‑
22的靶向序列；(458)包含seq id no：107的氨基酸1
‑
15的靶向序列；(459)包含seq id no：107的氨基酸1
‑
13的靶向序列；(460)包含seq id no：67的氨基酸12
‑
25的靶向序列；(461)包含seq id no：67的氨基酸12
‑
23的靶向序列；(462)包含seq id no：67的氨基酸13
‑
25的靶向序列；(463)包含seq id no：67的氨基酸15
‑
23的靶向序列；(464)包含
seq id no：69的氨基酸23
‑
36的靶向序列；(465)包含seq id no：69的氨基酸23
‑
34的靶向序列；(466)包含seq id no：69的氨基酸24
‑
36的靶向序列；(467)包含seq id no：69的氨基酸26
‑
34的靶向序列；(468)包含seq id no：75的氨基酸27
‑
40的靶向序列；(469)包含seq id no：75的氨基酸27
‑
38的靶向序列；(470)包含seq id no：77的氨基酸9
‑
22的靶向序列；(471)包含seq id no：77的氨基酸9
‑
20的靶向序列；(472)包含seq id no：77的氨基酸10
‑
22的靶向序列；(473)包含seq id no：77的氨基酸12
‑
20的靶向序列；(474)包含seq id no：81的氨基酸23
‑
36的靶向序列；(475)包含seq id no：81的氨基酸23
‑
34的靶向序列；(476)包含seq id no：81的氨基酸24
‑
36的靶向序列；(477)包含seq id no：81的氨基酸26
‑
34的靶向序列；(478)包含seq id no：87的氨基酸13
‑
26的靶向序列；(479)包含seq id no：87的氨基酸13
‑
24的靶向序列；或(480)包含seq id no：87的氨基酸14
‑
26的靶向序列；(481)包含seq id no：201的靶向序列；(482)包含seq id no：202的靶向序列；(483)包含与seq id no：203具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(484)包含与seq id no：204具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；(485)包含与seq id no：205具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白片段；(486)包含与seq id no：206具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白；或(487)包含与seq id no：207具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白片段。
[0224]
例如，靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0225]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0226]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0227]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约50％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0228]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0229]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约56％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约63％。
[0230]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0231]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约62％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0232]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0233]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约68％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0234]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0235]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的
氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约72％。
[0236]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0237]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约75％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0238]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0239]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约81％。
[0240]
靶向序列可以包含与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约90％。
[0241]
替代地，靶向序列可以由与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约81％同一性的氨基酸序列组成，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约90％。
[0242]
例如，靶向序列可以由以下组成：(a)由16个氨基酸组成的氨基酸序列，其与seq id no：1的氨基酸20
‑
35具有至少约43％同一性，其中与氨基酸25
‑
35的同一性为至少约54％；(b)seq id no：1的氨基酸1
‑
35；(c)seq id no：1的氨基酸20
‑
35；(d)seq id no：1；(e)seq id no：96；或(f)seq id no：120。
[0243]
在本文所述的任何融合蛋白中，融合蛋白可包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120和121具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0244]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120和121具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0245]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120和121具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0246]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120和121具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0247]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120和121具有100％同一性的氨基酸序列。
[0248]
在本文所述的任何融合蛋白中，融合蛋白可包含孢子外壁蛋白，其包含与seq id no：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少90％同一性的氨
基酸序列。
[0249]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白，其包含与seq id no：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0250]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白，其包含与seq id no：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0251]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白，其包含与seq id no：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0252]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白，其包含与seq id no：60、62、64、66、68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有100％同一性的氨基酸序列。
[0253]
在本文所述的任何融合蛋白中，融合蛋白可包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：203
‑
207中任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0254]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：203
‑
207中任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0255]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：203
‑
207中任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0256]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：203
‑
207中任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0257]
融合蛋白可以包含孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其包含与seq id no：203
‑
207中任一个具有100％同一性的氨基酸序列。
[0258]
融合蛋白可以包含将所述融合蛋白靶向至重组芽孢杆菌属细菌的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，其中所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段包含序列x1‑
x2‑
x3‑
x4‑
x5‑
x6‑
x7‑
x8‑
x9‑
x
10
‑
x
11
‑
x
12
‑
x
13
‑
x
14
‑
x
15
‑
x
16
，其中：
[0259]
x1是任何氨基酸或不存在；
[0260]
x2是苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)；
[0261]
x3是任何氨基酸；
[0262]
x4是脯氨酸(p)或丝氨酸(s)；
[0263]
x5是任何氨基酸；
[0264]
x6是亮氨酸(l)、天冬酰胺(n)、丝氨酸(s)或异亮氨酸(i)；
[0265]
x7是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；
[0266]
x8是甘氨酸(g)；
[0267]
x9是脯氨酸(p)；
[0268]
x
10
是苏氨酸(t)或脯氨酸(p)；
[0269]
x
11
是亮氨酸(l)或苯丙氨酸(f)；
[0270]
x
12
为脯氨酸(p)；
[0271]
x
13
是任何氨基酸；
[0272]
x
14
是任何氨基酸；
[0273]
x
15
是脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)或苏氨酸(t)；和
[0274]
x
16
是脯氨酸(p)、苏氨酸(t)或丝氨酸(s)
[0275]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可
在其羧基端包含氨基酸序列gxt，其中x是任何氨基酸。
[0276]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在对应于seq id no：1的氨基酸20的靶向序列位置处包含丙氨酸残基。
[0277]
在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段还可在紧邻所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的第一个氨基酸之前的氨基酸位置处或在所述靶向序列的对应于seq id no：1的氨基酸20的位置处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
[0278]
包含某些果胶酶的融合蛋白
[0279]
本发明提供了融合蛋白，其包含将所述融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及以下果胶酶。
[0280]
对于本文所述的果胶酶，通过以获得最佳匹配的方式对序列的整个长度进行比对来确定序列同一性，从而需要最少数量的编辑操作(例如插入、缺失和置换)，以将一个序列转化为被比对的另一个序列的精确拷贝。可通过美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(“ncbi”)网站获得的needleman
‑
w
ü
nsch蛋白质序列整体比对算法就是此类分析的一个实例。
[0281]
果胶酶可包含来自芽孢杆菌属种的果胶酸裂合酶。在该实施方案的一方面，果胶酸裂合酶来自枯草芽孢杆菌(seq id no：213或222)、解淀粉芽孢杆菌(seq id no：217或226)、地衣芽孢杆菌(seq id no：216或225)、沙福芽孢杆菌(seq id no：214或223)或短小芽孢杆菌(seq id no：215或224)。
[0282]
seq id no：214和seq id no：215具有93％的序列同一性。seq id no：214和seq id no：216具有66％的序列同一性。seq id no：215和seq id no：216具有62％的序列同一性。
[0283]
或者或此外，果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列。
[0284]
例如，果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少75％同一性的氨基酸序列。
[0285]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0286]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0287]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0288]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0289]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0290]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0291]
果胶酸裂合酶可包含与seq id no：213
‑
217和222
‑
226中的任一个具有100％同一
性的氨基酸序列。
[0292]
例如，该酶可包含seq id no：213
‑
217和222
‑
226。
[0293]
或者，该酶可由seq id no：213
‑
217和222
‑
226组成。
[0294]
果胶酶可包含来自黑曲霉的多聚半乳糖醛酸内切酶。在一个实施方案中，多聚半乳糖醛酸内切酶来自黑曲霉atcc 9029。在该实施方案的一方面，该酶包含seq id no：210或227。seq id no：227与seq id no：210相同，只是在seq id no：210的羧基端添加了一个半胱氨酸残基。
[0295]
或者或此外，多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少60％同一性的氨基酸序列。
[0296]
或者或此外，多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少70％同一性的氨基酸序列。
[0297]
例如，多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少75％同一性的氨基酸序列。
[0298]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0299]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0300]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0301]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0302]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0303]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0304]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：210或227具有100％同一性的氨基酸序列。
[0305]
或者，该酶可由seq id no：210或227组成。
[0306]
在另一个实施方案中，果胶酶是来自芽孢杆菌属种菌株或来自简简单芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸内切酶。一方面，多聚半乳糖醛酸内切酶来自简单芽孢杆菌30n
‑
5，如khan，n.等人在“antifungal activity of bacillus species against fusarium and analyis of the potential mechanisms used in biocontrol，”frontiers in microbiology 9：2363(2018年)所记载的。
[0307]
例如，所述酶的氨基酸序列可包含seq id no：211
‑
212中的任一个。seq id no：211是来自简单芽孢杆菌30n
‑
5的多聚半乳糖醛酸内切酶。seq id no：212是来自另一种芽孢杆菌属种菌株的多聚半乳糖醛酸内切酶。seq id no：211和seq id no：212具有85％的序列同一性。
[0308]
或者或此外，多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列。
[0309]
例如，多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少75％同一性的氨基酸序列。
[0310]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0311]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0312]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0313]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0314]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0315]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0316]
多聚半乳糖醛酸内切酶可包含与seq id no：211
‑
212中的任一个具有100％同一性的氨基酸序列。
[0317]
或者，该酶可由seq id no：211
‑
212中的任一个组成。
[0318]
在另一个实施方案中，果胶酶是来自芽孢杆菌属种菌株的多聚半乳糖醛酸酶，在该菌株中，上述van pouderoyen(2003)中所记载的来自黑曲霉的多聚半乳糖醛酸内切酶i的催化残基是保守的。在该实施方案的一个特定方面，具有保守催化残基的多聚半乳糖醛酸酶来自地衣芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、高地芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。evangelista，d.等人在”biochemical characterization and low
‑
resolution saxs structure of an exo
‑
polygalacturonase from bacillus licheniformis，”new biotechnology 40：第268
‑
274页(2018年)中记载了来自地衣芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸外切酶。在另一方面，此类多聚半乳糖醛酸酶包含seq id no：218
‑
221中的任一个。seq id no：218是来自地衣芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸外切酶，如上述evangelista(2018)所记载的。seq id no：221是来自短小芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸酶。seq id no：219是来自沙福芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸酶。seq id no：220是来自高地芽孢杆菌的多聚半乳糖醛酸酶。seq id no：219和seq id no：220具有90％的序列同一性。seq id no：221与seq id no：219和seq id no：220各自具有约90％的序列同一性。seq id no：218与seq id no：219和seq id no：220各自具有约60％的序列同一性。
[0319]
或者或此外，多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少60％同一性的氨基酸序列。此外，所述氨基酸序列可包含与来自黑曲霉的多聚半乳糖醛酸内切酶i的那些(即asp186、asp207、asp208和his229)保守的催化残基。
[0320]
例如，多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少75％同一性的氨基酸序列。
[0321]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0322]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少85％同一性
的氨基酸序列。
[0323]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0324]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0325]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。
[0326]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0327]
多聚半乳糖醛酸酶可包含与seq id no：218
‑
221中的任一个具有100％同一性的氨基酸序列。
[0328]
或者，该酶可由seq id no：218
‑
221中的任一个组成。
[0329]
融合蛋白中任选包含信号肽
[0330]
在本文所述的任何融合蛋白中，果胶酶还可包含信号肽。
[0331]
当信号肽存在时，其优选存在于果胶酶的氨基末端。
[0332]
信号肽优选紧接在果胶酶的第一个氨基酸之前。
[0333]
当融合蛋白包含信号肽时，信号肽可存在于果胶酶的氨基末端。
[0334]
d.制备融合蛋白的方法
[0335]
可使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制备本文所述的任何融合蛋白。例如，可通过聚合酶链式反应(pcr)扩增编码目的蛋白或肽(例如本文所述的果胶酶，包括果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种)的基因，并将其连接到编码本文所述的任何靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的dna，以形成编码融合蛋白的dna分子。编码融合蛋白的dna分子可以克隆到任何合适的载体中，例如质粒载体。载体适当地包含多克隆位点，编码融合蛋白的dna分子可以容易地插入其中。载体还适当地包含选择性标记，例如抗生素抗性基因，使得用载体转化、转染或与载体交配的细菌可以容易地鉴定和分离。当载体是质粒时，质粒适当地还包含复制起点。替代地，可以将编码融合蛋白的dna整合到蜡样芽胞杆菌家族成员或形成孢子的细菌宿主的染色体dna中。
[0336]
e.融合蛋白中可包含的标签、标记物和接头
[0337]
本文所述的任何融合蛋白还可包含不是靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段或果胶酶的一部分的其他多肽序列。例如，融合蛋白可以包含标签或标记物，以促进融合蛋白的纯化或可视化(例如，多组氨酸标签或荧光蛋白，例如gfp或yfp)，或表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员孢子的可视化。
[0338]
使用本文所述的靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段，融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上的表达由于这些序列的氨基端缺乏二级结构而得到增强，这允许融合蛋白的天然折叠和活性的保留。通过在靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、孢子外壳蛋白和果胶酶之间包含短氨基酸接头，可以进一步增强适当的折叠。
[0339]
因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段与果胶酶之间包含氨基酸接头。
[0340]
接头可以包括聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。也可以使用包含丙氨酸和甘氨酸残
基的混合物的接头。聚丙氨酸接头的实例参见seq id no：208和209。
[0341]
例如，在靶向序列包含seq id no：1的融合蛋白中，融合蛋白可以具有以下结构之一：
[0342]
无接头：seq id no：1
‑
poi
[0343]
丙氨酸接头：seq id no：1
‑
a
n
‑
poi
[0344]
甘氨酸接头：seq id no：1
‑
g
n
‑
poi
[0345]
混合丙氨酸和甘氨酸接头：seq id no：1
‑
(a/g)
n
‑
poi
[0346]
其中a
n
、g
n
和(a/g)
n
分别是任意数量的丙氨酸、任意数量的甘氨酸或任意数量的丙氨酸和甘氨酸的混合物。例如，n可以为1至25，优选为6至10。当接头包含丙氨酸和甘氨酸残基的混合物时，可以使用甘氨酸和丙氨酸残基的任意组合。在上述结构中，“poi”代表“目的蛋白”，代表本文所述的果胶酶，包括果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。
[0347]
替代地或另外地，接头可以包含蛋白酶识别位点。包含蛋白酶识别位点允许在暴露于识别蛋白酶识别位点的蛋白酶时靶向去除本文所述的果胶酶，包括果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种。
[0348]
当融合蛋白包含接头和信号肽时，接头通常是信号肽的氨基端。例如，当融合蛋白包含seq id no：96、聚丙氨酸接头、信号序列和seq id no：210的多聚半乳糖醛酸内切酶时，这些元件在融合蛋白中通常按以下顺序排列，从融合蛋白的氨基端到羧基端：seq id no：96
‑
a
n
‑
信号序列
‑
seq id no：210。
[0349]
ii.作为宿主用于表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员和此类重组蜡样芽孢杆菌家族成员的发酵方法
[0350]
本发明还涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员。融合蛋白可以是上文第i部分所述的任何融合蛋白。
[0351]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包括能够产生孢子外壁的任何芽孢杆菌属物种。例如，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包括炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillus samanii、bacillus gaemokensis、bacillus weihenstephensis、bacillus toyoiensis或其任意组合。重组蜡样芽孢杆菌家族成员适当地包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
[0352]
为了产生表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员，可以使用本领域已知的标准方法(例如，通过电穿孔)用编码融合蛋白的载体缀合、转导或转化任何蜡样芽孢杆菌家族成员。然后可以通过本领域已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，在载体包含抗生素抗性基因的情况下，可以筛选细菌的抗生素抗性。替代地，可以将编码融合蛋白的dna整合到蜡样芽孢杆菌家族成员宿主的染色体dna中。然后可将重组蜡样芽孢杆菌家族成员暴露于诱导孢子形成的条件下。用于诱导孢子形成的合适条件是本领域已知的。例如，可将重组蜡样芽孢杆菌家族成员铺在琼脂平板上，并在约30℃的温度下培育数天(例如3天)。
[0353]
因此，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以是孢子的形式。
[0354]
也可以适当地使用任何上述物种的灭活菌株、无毒菌株或遗传操作的菌株。例如，可以使用缺少cry毒素的苏云金芽孢杆菌。替代地或另外地，一旦表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子已经产生，可以将它们灭活以防止在使用中进一步萌发。可以使用本领域已知的任何灭活细菌孢子的方法。合适的方法包括但不限于热处理、γ辐射、x射线
辐射、uv
‑
a辐射、uv
‑
b辐射、化学处理(例如用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或其任意组合处理)或其组合。替代地，可以使用源自非产毒性菌株或遗传或物理灭活菌株的孢子。
[0355]
因此，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以是孢子的形式，其中孢子被灭活。
[0356]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以共表达本文所述的任何融合蛋白中的两种或多种。例如，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以共表达至少一种包含果胶酸裂合酶的融合蛋白和包含多聚半乳糖醛酸酶的融合蛋白。
[0357]
许多蜡样芽孢杆菌家族成员菌株具有固有的有益属性。例如，一些菌株具有促进植物生长的作用。其他菌株是植物内生的。有些菌株既是植物内生的，又具有促进植物生长的作用。
[0358]
因此，本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员可包含促进植物生长的细菌菌株、植物内生的细菌菌株或既促进植物生长又植物内生的细菌菌株。
[0359]
促进植物生长的细菌菌株可以包括产生杀昆虫毒素(例如cry毒素)、产生杀真菌化合物(例如β
‑
1，3
‑
葡聚糖酶、壳聚糖酶、溶细胞酶或其任何组合)、产生杀线虫化合物(例如cry毒素)、产生杀细菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一种或多种自由复制的质粒、结合植物根部、定殖植物根部、形成生物膜、溶解营养物、分泌有机酸或其任何组合的细菌菌株。
[0360]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包括植物内生的细菌菌株。
[0361]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可包含其bcla基因、其cote基因或其coto基因中的失活突变(例如，bcla基因、cote基因或coto基因的敲除)。例如，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以在其bcla基因中包含失活突变(例如，bcla基因的敲除)。已经发现，在具有这种突变的重组蜡样芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白导致融合蛋白的表达水平增加。
[0362]
本发明的组合物包含本文所述菌株的培养物，例如全发酵液培养物。术语培养物是指在受控的实验室或生产条件下，在预定培养基中不存在其他物种的情况下生长的细胞群。本发明的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的生物学纯培养物可以根据本领域熟知的方法获得。
[0363]
常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。在发酵过程中，随着营养物的耗尽，细胞开始从生长阶段过渡到孢子形成阶段，因此发酵的最终产物主要是孢子、代谢物和残留的发酵培养基。孢子形成是蜡样芽孢杆菌家族成员自然生命周期的一部分，通常由细胞响应应激环境条件(如营养物限制)而启动。配置发酵以获得高水平的菌落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可直接使用或通过常规工业方法浓缩，如离心或过滤，如切向流过滤或深度过滤，以及蒸发。
[0364]
本发明的组合物包含本文所述的微生物培养方法的产物。在使用深层发酵作为培养方法的实施方案中，将产物称为“发酵液”或“全发酵液培养物”。如上所述，这种发酵液可以浓缩。浓缩的发酵液可以例如通过渗滤方法进行洗涤，以除去残留的发酵液和代谢物。本文所用的术语“发酵液浓缩物”是指如上所述已通过常规工业方法浓缩但仍保持液体形式的发酵液。本文所用的术语“发酵产物”是指发酵液或全发酵液培养物、发酵液浓缩物和/或干燥的发酵液或发酵液浓缩物。
[0365]
发酵液或发酵液浓缩物可在添加或不添加载体的情况下，使用常规干燥工艺或方
法进行干燥，例如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、转鼓干燥或蒸发。本文所用的术语“发酵产物”是指发酵液或全发酵液培养物、发酵液浓缩物和/或干燥的发酵液或发酵液浓缩物。
[0366]
所得干燥产物可进一步加工，如通过研磨或造粒，以达到特定的粒度或物理形式。也可在干燥后添加下文所述的载体。
[0367]
本发明菌株的发酵液的无细胞制剂可以通过本领域已知的任何方法获得，例如发酵液的提取、离心和/或过滤。本领域技术人员将理解，所谓的无细胞制剂可能并非没有细胞，而是很大程度上无细胞或基本上无细胞，这取决于用于去除细胞的技术(例如离心速度)。所得无细胞制剂可以干燥和/或与有助于其施用于植物或植物生长培养基的组分配制。上述发酵液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制剂。
[0368]
如下文第1v部分进一步所述，重组蜡样芽孢杆菌家族成员可包含允许从重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子收集包含融合蛋白的孢子外壁片段的突变或其他修饰。
[0369]
iii.用于在重组蜡样芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的启动子
[0370]
编码用于本文所述的重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段、制剂、植物种子和方法中的融合蛋白的dna适当地处于孢子形成启动子的控制之下，所述孢子形成启动子将引起融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁上表达(例如来自蜡样芽孢杆菌家族成员的天然bcla启动子)。
[0371]
因此，上文第i部分所述的任何融合蛋白可在孢子形成启动子或这种启动子的一部分的控制下在重组蜡样芽孢杆菌家族成员中表达，所述孢子形成启动子对融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白、或孢子外壁蛋白片段是天然的。
[0372]
任何融合蛋白都可以在高表达孢子形成启动子的控制下表达。
[0373]
高表达孢子形成启动子可以包含σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
[0374]
为了便于参考，可用于在重组蜡样芽孢杆菌家族成员中表达任何融合蛋白的启动子的示例性核苷酸序列及其seq id no在下面的表4中提供。表4还提供了许多启动子的示例性最小启动子序列。在表4中，启动子中的σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列用粗体和下划线文本表示。其中几个序列有多个相互重叠的σk序列。表格中的重叠部分用双下划线表示。启动子序列紧接地位于每个指定基因的起始密码子的上游。换句话说，在下表4所示的序列中，启动子序列的最后一个核苷酸紧接在编码指定蛋白的基因的编码区的起始密码子的第一个核苷酸之前。
[0375]
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
[0383]
[0384]
[0385]
[0386]
[0387][0388]
表4所示启动子序列中的σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列导致融合蛋白在孢子形成后期的高表达水平。σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列的共有序列为
catannntn(seq id no：200)；然而，该序列可以包含最多两个突变，并且仍然是功能性的。通常在核糖体结合位点(rbs)上游发现σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
[0389]
与上面表4中所示的任何序列具有高度序列同一性的启动子也可用于表达融合蛋白。
[0390]
例如，融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
[0391]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少85％同一性的核酸序列。
[0392]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
[0393]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
[0394]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。
[0395]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序列。
[0396]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。
[0397]
例如，融合蛋白可以在bcla启动子(例如seq id no：149、150、175、189或190)、coty启动子(例如seq id no：41、42或181)、exsy启动子(例如seq id no：37、38或180)或鼠李糖启动子(例如seq id no：185)或与这些启动子中任一个具有高度序列同一性的启动子的控制下表达。
[0398]
因此，例如，融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。
[0399]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少85％同一性的核酸序列。
[0400]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
[0401]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。
[0402]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。
[0403]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序
列。
[0404]
融合蛋白可在启动子的控制下表达，所述启动子包含与seq id no：37、38、41、42、149、150、175、180、181、185、189或190中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。
[0405]
融合蛋白可在包含σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列的启动子控制下表达，其中所述一个或多个σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列与seq id no：37
‑
42和123
‑
191中任一个的相应核苷酸具有100％同一性。
[0406]
融合蛋白可以在启动子的控制下表达，所述启动子对融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段是天然的。因此，例如，当靶向序列来自bcla时，融合蛋白可以在天然bcla启动子(例如，seq id no：149、150、175、189或190)的控制下表达。
[0407]
表4还提供了示例性的最小启动子序列。融合蛋白可以在任何这些最小启动子序列下表达。
[0408]
此外，融合蛋白可以在上面表4中列出的任何启动子的一部分下表达，只要该启动子的部分包含σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。例如，融合蛋白可以在包含起始密码子上游的前25、50、100、150、200、250或300个核苷酸的启动子区域下表达，只要该区域包含σ
‑
k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
[0409]
iv.允许收集源自重组蜡样芽孢杆菌家族成员的游离孢子外壁和孢子外壁片段的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的突变和其他遗传改变
[0410]
如下文进一步所述，表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员可用于各种目的，包括递送目的蛋白或肽到植物、种子、植物生长培养基、或种子或植物周围的区域(例如，通过土壤浇灌、叶面施用或作为种子处理)，所述融合蛋白包含目的蛋白或肽(例如本文所述的果胶酶，包括果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸酶中的任一种)和靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将融合蛋白靶向至重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。然而，在某些情况下，活微生物的存在可能不是所希望的，相反，希望将活孢子与孢子外表面上的孢子外壁中的融合蛋白分离。例如，在某些施用中，希望增加酶的活性而不考虑孢子的完整性。在这种情况下，与使用在其孢子外壁上具有酶的活微生物相比，使用已经从孢子分离的孢子外壁片段可能是优选的。
[0411]
此外，对于某些用途，可能需要降低产品密度。在这种情况下，需要将致密孢子与孢子外壁(含有融合蛋白)分离。此外，在某些情况下，活孢子的存在会导致产品中细菌生长的可能性，这在某些施用中是不希望的。
[0412]
可以将突变或其他遗传改变(例如蛋白质的过表达)引入重组蜡样芽孢杆菌家族成员中，这允许游离的孢子外壁与重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子分离。该分离过程产生含有融合蛋白但基本上不含孢子本身的孢子外壁片段。“基本上不含孢子”是指一旦将游离的孢子外壁与孢子分离，就获得这样的制剂，其含有小于5体积％的孢子、优选小于3体积％的孢子、甚至更优选小于1体积％的孢子、最优选不含孢子或如果存在孢子则它们是无法检测到的。在本文所述的任何制剂、植物种子和方法中，这些孢子外壁片段可用于代替重组蜡样芽孢杆菌家族成员本身。
[0413]
源自重组蜡样芽孢杆菌家族成员孢子的孢子外壁片段可用于本文所述的任何制剂、植物种子和方法中。重组蜡样芽孢杆菌家族成员表达本文所述的任何融合蛋白。重组蜡样芽孢杆菌家族成员还包含突变或表达蛋白，其中与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌
家族成员中的蛋白表达相比，所述蛋白的表达增加。所述蛋白的突变或增加的表达导致蜡样芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的孢子外壁相比更容易从孢子中去除的孢子外壁。
[0414]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员：(i)可以包含cote基因中的突变；(ii)可以表达exsy蛋白，其中与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中exsy蛋白的表达相比，exsy蛋白的表达增加，并且其中所述exsy蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签；(iii)可以表达bclb蛋白，其中与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中bclb蛋白的表达相比，bclb蛋白的表达增加；(iv)可以表达yjcb蛋白，其中与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中yjcb蛋白的表达相比，yjcb蛋白的表达增加；(v)可以包含exsy基因中的突变；(vi)可以包含coty基因中的突变；(vii)可以包含exsa基因中的突变；或(viii)可以包含coto基因中的突变。
[0415]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包含cote基因中的突变，例如cote基因的敲除或cote基因的显性负型。cote基因的突变可以部分或完全抑制cote将孢子外壁附着在孢子上的能力。
[0416]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可表达exsy蛋白。exsy蛋白包含含有球状蛋白(例如绿色荧光蛋白(gfp)或其变体)的羧基端标签，并且与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中exsy蛋白的表达相比，exsy蛋白的表达增加。球状蛋白的分子量可以在25kda至100kda。包含含有球状蛋白的羧基端标签的exsy蛋白的表达可以抑制exsy蛋白与其在孢子外壁中的靶结合。
[0417]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可表达bclb蛋白。bclb蛋白的表达会导致形成脆弱的孢子外壁。与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中bclb蛋白的表达相比，bclb蛋白的表达可以增加。
[0418]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可表达yjcb蛋白。yjcb蛋白的表达可导致孢子外壁形成碎片而不是完整的结构。与在相同条件下的野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中yjcb蛋白的表达相比，yjcb蛋白的表达可以增加。
[0419]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包含exsy基因的突变，例如exsy基因的敲除。exsy基因的突变可以部分或完全抑制exsy完成孢子外壁形成或将孢子外壁附着于孢子的能力。
[0420]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包含coty基因的突变，例如coty基因的敲除。coty基因的突变可导致形成脆弱的孢子外壁。
[0421]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包含exsa基因的突变，例如exsa基因的敲除。exsa基因的突变可导致形成脆弱的孢子外壁。
[0422]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以包含coto基因的突变，如coto基因的敲除或coto基因的显性负型。coto基因的突变可导致孢子外壁形成条状。
[0423]
为便于参考，下文表5中提供了cote、exsy、bclb、yjcb、coty、exsa和coto的示例性序列描述。
[0424]
表5.可被突变或以其他方式进行遗传改变以允许收集游离的孢子外壁的蛋白质序列
[0425][0426]
孢子外壁片段可从这些重组蜡样芽孢杆菌家族成员中的任一种制备，并用于下文进一步描述的各种目的。当重组蜡样芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白时，孢子外壁片段将包含融合蛋白。从孢子中纯化含有融合蛋白的孢子外壁片段后，获得了无细胞蛋白制剂，其中融合蛋白通过与孢子外壁片段的共价键被稳定和支持。
[0427]
为了从具有允许收集游离的孢子外壁的突变或其他遗传改变的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子中除去孢子外壁，可对孢子的悬浮液或发酵液进行离心或过滤以产生与孢子分离的孢子外壁片段。当重组蜡样芽孢杆菌家族成员表达融合蛋白时，孢子外壁片段将包含融合蛋白。
[0428]
可以对包含孢子的悬浮液或发酵液进行离心，然后收集上清液。上清液包含孢子外壁的片段并且基本上不含孢子。
[0429]
替代地，可对包含孢子的悬浮液或发酵液进行过滤，然后收集滤液。滤液包含孢子外壁的片段并且基本上不含孢子。
[0430]
孢子的悬浮液或发酵液可以在离心或过滤之前进行搅拌或机械破碎。
[0431]
也可通过梯度离心、亲和纯化或让孢子从悬浮液或发酵液中沉淀出来，将孢子外壁片段与孢子分离。
[0432]
由于融合蛋白与孢子外壁片段之间的强共价键，融合蛋白变得耐热。与孢子外壁片段结合的融合蛋白的耐热性使其可用于需要耐热蛋白或酶的应用中。
[0433]
提供了源自重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。
[0434]
孢子外壁片段可以源自包含允许收集游离的孢子外壁的本文所述的任何突变或其他遗传改变的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员。
[0435]
孢子外壁片段可包含上文第i部分所述的任何融合蛋白。
[0436]
v.制剂
[0437]
提供了一种制剂。所述制剂包含本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员。所述制剂还包含农业上可接受的载体。
[0438]
提供了另一种制剂。所述制剂包含源自本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。所述制剂还包含农业上可接受的载体。
[0439]
vi.经处理的种子
[0440]
提供了一种经处理的植物种子。所述植物种子可用本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员处理。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以表达本文所述的任何融合蛋白。
[0441]
提供了另一种经处理的植物种子。所述植物种子可用本文所述的任何孢子外壁片段处理。所述孢子外壁片段可源自本文所述的任何蜡样芽孢杆菌家族成员。孢子外壁片段可以包含本文所述的任何融合蛋白。
[0442]
提供了又另一种经处理的植物种子。植物种子可用本文所述的任何制剂处理。
[0443]
在任何经处理的植物种子中，植物种子可以用重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂包被。
[0444]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂可用作种子处理剂，例如种子包衣或敷料(dressing)。种子包衣或敷料制剂可以是液体载体制剂、浆液制剂或粉末制剂的形式。
[0445]
可将种子包衣或敷料制剂与常规添加剂一起施用，提供所述常规添加剂以使种子处理剂具有粘性以粘着和包被种子。合适的添加剂包括：滑石、石墨、树胶、稳定聚合物、包衣聚合物、整理聚合物(finishing polymer)、用于种子流动和可种植性的滑爽剂、化妆品制剂和纤维素材料如羧甲基纤维素等。
[0446]
种子处理制剂还可包含着色剂和/或其他添加剂。
[0447]
可以将种子处理制剂在合适的载体如水或粉末中施用于种子。然后可以将种子干燥，并以传统的方式种植。重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段可以作为溶液直接施用到种子上，或与其他市售添加剂组合施用。例如，重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段可与幼苗可接受的载体(例如液体载体或固体载体)组合施用。
[0448]
可以将含有重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段的溶液喷洒或以其他方式施用于种子(例如，在种子浆液或种子浸泡液中)。
[0449]
含有重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段的固体或干燥材料也可用于促进早期幼苗建立期间的有效幼苗萌发、生长和保护。
[0450]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段可与增溶载体如水、缓冲液(例如柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液)、其他处理剂(例如醇或其他溶剂)和/或任何可溶性试剂一起使用。
[0451]
此外，少量的干燥剂增强剂，如低级醇等可用于种子包衣制剂。
[0452]
表面活性剂、乳化剂和防腐剂也可以以相对低的(例如，约0.5％w/v或更低)水平添加，以增强种子包衣产品的稳定性。
[0453]
可使用多种方法处理种子，包括但不限于将含有重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段的水溶液倾倒、泵送、淋洒或喷洒在种子上或种子上方；或者在使用或不使用传送系统的情况下将重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段喷洒或施用到种子层上。
[0454]
用于种子处理的混合装置包括但不限于转筒、混合盆、混合鼓和流体施用装置，所述流体施用装置包括用于在包衣时容纳种子的盆或鼓。
[0455]
种子处理后，可将种子风干，或任选使用干燥空气流来帮助干燥种子包衣。
[0456]
含有重组蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子外壁片段的种子处理可以使用任何市售的种子处理机器来施用，或者也可以使用任何可接受的非商业方法来施用，例如使用注射器或任何其他种子处理装置。
[0457]
vii.刺激植物生长和/或促进植物健康的方法
[0458]
提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可包含本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员。重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以表达本文所述的任何融合蛋白。
[0459]
提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将孢子外壁片段施用到植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。孢子外壁片段可包含源自本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。孢子外壁片段可以包含本文所述的任何融合蛋白。
[0460]
提供了又另一种用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。所述方法包括将制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。所述制剂可包含本文所述的任何制剂。
[0461]
在本文所述的任何方法中，所述方法可进一步包括使重组蜡样芽孢杆菌家族成员灭活，然后将重组蜡样芽孢杆菌家族成员施用到植物生长培养基、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。
[0462]
在本文所述的任何方法中，所述方法可包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物生长培养基。
[0463]
在本文所述的涉及使用植物生长培养基的任何方法中，植物生长培养基可包含土壤、水、水溶液、沙子、砾石、多糖、覆盖物(mulch)、堆肥、泥煤苔、稻草、原木、粘土、豆粕、酵母提取物或其组合。
[0464]
植物生长培养基可以包含肥料。
[0465]
本文所述的任何方法可进一步包括用酶的底物补充植物生长培养基。合适的底物包括但不限于同型聚半乳糖醛酸(homogalacturonan)、果胶、果胶酸、多聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate)、寡聚半乳糖醛酸盐(oligogalacturonate)或其任意组合。
[0466]
在本文所述的任何方法中，所述方法可包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物。
[0467]
例如，所述方法可以包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用到植物的根部。
[0468]
替代地或另外地，所述方法可以包括叶面施用重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂。
[0469]
在本文所述的任何方法中，所述方法可包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物种子。
[0470]
当所述方法包括将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物
种子时，将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物种子可包括：(a)在种植时将重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂施用于植物种子；或(b)用重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂包被植物种子。
[0471]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可以表现出增加的生长。
[0472]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下未施用酶或微生物的种子相比，施用了重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂的种子可表现出提高的萌发率。
[0473]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出增加的营养物吸收。
[0474]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出对病原体的易感性降低。
[0475]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出对环境胁迫(例如干旱、洪水、高温、冷冻、盐、重金属、低ph、高ph或其任何组合)的易感性降低。
[0476]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出增加的营养物含量。
[0477]
所述营养物可包括，例如，多糖、寡糖、单糖、蛋白质、植酸、磷酸盐(phosphatate)、磷脂，或其任意组合。
[0478]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出增加的根结瘤。
[0479]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出更高的作物产量。在一个实施方案中，与在相同条件下但不经重组蜡样芽孢杆菌家族成员处理而产生的植物相比，本发明的重组蜡样芽孢杆菌家族成员使产量或总植物重量增加至少约0.5％，或至少约1％，或至少约2％，或至少约3％，或至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约11％，或至少约12％。在另一个实施方案中，与在相同条件下但不经重组蜡样芽孢杆菌家族成员处理而产生的植物相比，本发明的重组蜡样芽孢杆菌家族成员提高了植物活力的某些方面，如萌发，提高了至少约0.5％，或至少约1％，或至少约2％，或至少约3％，或至少约5％，或至少约6％，或至少约7％，或至少约8％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约11％，或至少约12％。
[0480]
在本文所述的任何方法中，与在相同条件下不存在酶或微生物的情况下生长的植物相比，在重组蜡样芽孢杆菌家族成员、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可以表现出改变的叶片衰老。
[0481]
viii.载体
[0482]
如上所述，本文所述的制剂包含农业上可接受的载体。
[0483]
农业上可接受的载体可以包括分散剂、表面活性剂(例如重石油、重石油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙二醇、烷基胺乙酸酯、烷基芳基磺酸酯、多元醇、磷酸烷基酯或其任意组合)、添加剂(例如油、树胶、树脂、粘土、聚氧乙二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、烷基磺酸酯、石油磺酸酯、醇硫酸酯、烷基丁烷二酸钠、硫代丁烷二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质材料或其任意组合)、水、增稠剂(聚乙二醇的长链烷基磺酸酯、聚氧乙烯油酸酯或其任意组合)、抗结块剂(例如钠盐、碳酸钙、硅藻土或其任意组合)、残渣分解产物、堆肥制剂、颗粒施用、硅藻土、油、着色剂、稳定剂、防腐剂、聚合物、包衣或其任意组合。
[0484]
当农业上可接受的载体包括表面活性剂时，所述表面活性剂可以包括非离子表面活性剂。
[0485]
当农业上可接受的载体包括添加剂并且所述添加剂包括蛋白质材料时，所述蛋白质材料可以包括乳制品、小麦粉、豆粕、血液、白蛋白、明胶、苜蓿粉、酵母提取物或其任意组合。
[0486]
当农业上可接受的载体包括抗结块剂并且所述抗结块剂包括钠盐时，所述钠盐可以包括单甲基萘磺酸酯的钠盐、二甲基萘磺酸酯的钠盐、亚硫酸钠、硫酸钠或其任意组合。
[0487]
农业上可接受的载体可以包括蛭石、木炭、糖厂碳化压榨泥、稻壳、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂、碳酸钙、面粉、明矾、淀粉、滑石、聚乙烯吡咯烷酮或其任意组合。
[0488]
本文所述的任何制剂可包括种子包衣制剂(例如用于施用于种子的水性或油基溶液或用于施用于种子的粉末或颗粒制剂)、用于施用于植物或植物生长培养基的液体制剂(例如浓缩制剂或即用型制剂)、或用于施用于植物或植物生长培养基的固体制剂(例如颗粒制剂或粉末剂)。
[0489]
农业上可接受的载体可以包括制剂成分。制剂成分可以是润湿剂、增量剂、溶剂、自发性促进剂、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂和/或佐剂。在一个实施方案中，制剂成分是润湿剂。
[0490]
本发明的组合物可以包括添加到本发明的组合物中以改善回收率、功效或物理性质和/或帮助加工、包装和给药的制剂成分。此类制剂成分可以单独或组合添加。
[0491]
可以将制剂成分添加到包含细胞、无细胞制剂和/或孢子外壁片段的组合物中，以改善功效、稳定性和物理性质、可用性和/或促进加工、包装和最终用途施用。此类制剂成分可包括惰性剂、稳定剂、防腐剂、营养物或物理性质改性剂，它们可单独或组合添加。在一些实施方案中，载体可以包括液体材料，例如水、油和其他有机或无机溶剂，以及固体材料，例如矿物质、聚合物或通过生物或化学合成获得的聚合物复合物。在一些实施方案中，制剂成分是促进组合物粘附到植物部分如叶、种子或根的粘结剂、佐剂或粘合剂。参见，例如taylor，a.g.，et al.，“concepts and technologies of selected seed treatments，”annu.rev.phytopathol.，28：321
‑
339(1990)。稳定剂可以包括抗结块剂、抗氧化剂、抗沉降剂、消泡剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养素可包括碳、氮和磷源，如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改性剂可以包括填充剂、润湿剂、增稠剂、ph改性剂、流变改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、成膜剂、水溶助长剂、助洗剂(builder)、防冻剂或着
色剂。在一些实施方案中，包含通过重组蜡样芽孢杆菌家族成员的发酵产生的细胞、无细胞制剂和/或孢子外壁片段的组合物可以在有或没有水作为稀释剂的情况下直接使用，而无需任何其他制剂制备。在一个特定的实施方案中，将润湿剂或分散剂添加到发酵产生的全发酵液的干燥浓缩物中，例如冷冻干燥或喷雾干燥的粉末。润湿剂提高了铺展性和渗透性，或分散剂提高了活性成分施用于表面时的分散性和溶解性(一旦稀释)。示例性的润湿剂是本领域技术人员已知的，包括磺基琥珀酸酯和衍生物，例如multiwet
tm mo
‑
70r(croda inc.，edison，nj)；硅氧烷，例如break
‑
(evonik，germany)；非离子型化合物，例如atlox
tm 4894(croda inc.，edison，nj)；烷基多苷，例如3001(huntsman international llc，the woodlands，texas)；c12
‑
c14醇乙氧基化物，例如15
‑
s
‑
15(the dow chemical company，midland，michigan)；磷酸酯，例如bg
‑
510(rhodia，inc.)；和烷基醚羧酸酯，例如emulsogen
tm ls(clariant corporation，north carolina)。
[0492]
如上所述，本文所述的任何制剂可包含农用化学品。
[0493]
ix.游离的酶
[0494]
本文所述的任何酶也可作为游离的酶或重组微生物中表达的酶来使用。
[0495]
x.植物
[0496]
在上述涉及植物的任何方法中，植物可以是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物或被子植物。
[0497]
同样，对于本文所述的任何种子，种子可以是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物或被子植物的种子。
[0498]
例如，当植物是双子叶植物或种子是双子叶植物的种子时，双子叶植物可以选自菜豆、豌豆、番茄、胡椒、南瓜、苜蓿、杏仁、茴香籽、苹果、杏、arracha、朝鲜蓟、鳄梨、斑巴拉花生、甜菜、佛手柑、黑胡椒、黑荆树、黑莓、蓝莓、苦橙、白菜、巴西坚果、面包果、花椰菜、蚕豆、抱子甘蓝、荞麦、卷心菜、亚麻荠菜、大白菜、可可、哈密瓜、葛缕子籽、刺菜蓟、角豆、胡萝卜、腰果、木薯、蓖麻子、菜花、块根芹、芹菜、樱桃、栗子、鹰嘴豆、菊苣、红辣椒、菊花、肉桂、香橼、柑橘、克莱门氏小柑橘、丁香、三叶草、咖啡、可乐果、油菜(colza)、玉米、棉花、棉籽、豇豆、海甘蓝、蔓越莓、水芹、黄瓜、红醋栗、番荔枝(custard apple)、鼓槌树、花生(earth pea)、茄子、苦苣、茴香、胡芦巴、无花果、榛子、亚麻、天竺葵、醋栗、葫芦、葡萄、葡萄柚、番石榴、大麻、大麻籽、指甲花、啤酒花、马豆、辣根、木蓝属植物、茉莉、菊芋、黄麻、羽衣甘蓝、木棉、洋麻、猕猴桃、大头菜、金桔、薰衣草、柠檬、扁豆、胡枝子、生菜、酸橙、甘草、荔枝、枇杷、羽扇豆、澳洲坚果、狼牙棒、柑橘、饲料甜菜、芒果、欧楂果(medlar)、甜瓜、薄荷、桑葚、芥菜、油桃、黑芝麻、肉豆蔻、秋葵、橄榄、鸦片、橙子、木瓜、欧洲防风草、豌豆、桃子、花生、梨、山核桃、柿子、木豆、开心果、车前草、李子、石榴、柚子、罂粟籽、马铃薯、红薯、西梅、南瓜、白雀木、温柏、金鸡纳属树木、藜麦、萝卜、苎麻、油菜籽、覆盆子、苎麻、大黄、玫瑰、橡胶、芜菁甘蓝、红花、红豆草、婆罗门参、人心果、温州蜜柑、鸦葱、芝麻、乳木果树、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、瑞典甘蓝、甜椒、橘子、茶、埃塞俄比亚画眉草、烟草、番茄、三叶草、油桐、芜菁、梵天花属、野豌豆、核桃、西瓜、马黛茶、山芥、荠菜(shepherd’s purse)、家独行菜、花椒、豆瓣菜、菥萁、八角、月桂、月桂树、桂皮、jamun、莳萝、罗望子、薄荷、牛至、迷
迭香、鼠尾草、刺果番荔枝、石莲花、红厚壳(calophyllum)、苦瓜、夏威夷核果、大溪地板栗、罗勒、越橘、木槿、西番莲、星苹果、黄樟、仙人掌、圣约翰草、金钱草、山楂、香菜、咖喱植物、猕猴桃、百里香、西葫芦、块根落葵、豆薯、水叶、刺猴橙、yellow mombin、杨桃、苋菜、山葵、日本胡椒、黄李子、mashua、香椿、新西兰菠菜、bower spinach、ugu、艾菊、繁缕、jocote、马来苹果(malay apple)、天神草、苦菜、中国马铃薯、马欧芹(horse parsley)、大蒜芥(hedge mustard)、剪秋罗属植物、玛瑙、cassod tree、蓟、地榆、star gooseberry、钾猪毛菜、厚岸草、酢浆草、凤冠草(silver lace fern)、羽衣甘蓝、报春花、驴蹄草、马齿苋、两耳草、笃耨香(terebinth)、树生菜(tree lettuce)、野生槟榔(wild betel)、西非胡椒、散塔草、龙蒿、欧芹、山萝卜、陆生水芹、茴芹(burnet saxifrage)、honeyherb、蜂斗菜、紫苏(shiso)、水蓼、紫苏(perilla)、苦豆、块茎酢浆草、kampong、中国芹菜、柠檬罗勒、泰国罗勒、水含羞草、欧洲没药、巨朱蕉、辣木、mauka、鸵鸟蕨、大叶石龙尾(rice paddy herb)、yellow sawah lettuce，、独活草、胡椒草、玛卡、葫芦(bottle gourd)、扁豆、空心菜、猫耳菊、fishwort、冲绳菠菜、星粟草、小花牛膝菊、刺芹、芝麻菜、刺菜蓟、caigua、mitsuba、chipilin、圣彼得草、mampat、ebolo、红瓜、卷心菜蓟、海甘蓝、驱虫苋、huauzontle、埃塞俄比亚芥、magenta spreen、亨利藜、epazole、羊腿藜(lamb’s quarters)、积雪草羽状鸡冠花、刺山柑、rapini、大白菜、日本沙拉菜、中国皱叶甘蓝、芥兰、芥菜(mustard greens)、木耳菜、莙荙菜、药蜀葵、羽叶金合欢、中国黄麻、红辣椒、胭脂树籽、绿薄荷、香薄荷、墨角兰、小茴香、洋甘菊、柠檬香蜂草、多香果、越橘、番荔枝、云莓、洋李子、火龙果、榴莲、接骨木果、费约果、菠萝蜜、阎浮树、枣、酸浆、紫山竹、红毛丹、红醋栗、黑醋栗、salal berry、无核小蜜橘、牙买加丑橘、赤小豆、黑豆、黑眼豆、borlotti bean、普通菜豆、四季豆、芸豆、利马豆、绿豆、海军豆、黑白斑豆、红花菜豆、嫩豌豆、甜豆、香豌豆、broccoflower、花茎甘蓝、荨麻、柿子椒、raddichio、萝卜、白萝卜、泽芹、tat soi、小西兰花、黑萝卜、牛蒡根、蚕豆、broccoli raab、扁豆、羽扇豆、胖大海、绒毛豆、四棱豆、豆薯、无脉相思树、紫苑草、伞形金合欢、tjuntjula、wakalpulka、witchetty bush、wiry wattle、芡欧鼠尾草、山毛榉坚果、桐树、药西瓜、蜜果、maya nut、mongongo、ogbono nut、天堂果和cempedak。
[0499]
当植物是单子叶植物或种子是单子叶植物的种子时，单子叶植物可以选自玉米、小麦、燕麦、稻、大麦、粟、香蕉、洋葱、大蒜、芦笋、黑麦草、粟、非洲小米(fonio)、raishan、nipa grass、姜黄、藏红花、高良姜、细香葱、小豆蔻、枣椰树、菠萝、大葱、韭菜、青葱、荸荠、ramp、job’s tears、竹子、鸭脚稗、spotless watermeal、arrowleaf elephant ear、大溪地菠菜、麻蕉、槟榔、珍珠粟、槟榔子、扫帚粟、扫帚高粱、香茅、椰子、芋头(cocoyam)、玉米、芋头(dasheen)、高粱(durra)、硬质小麦、edo、菲奎叶纤维、formio、生姜、果园草、芦苇草、苏丹草、guinea corn、马尼拉麻、赫纳昆纤维、杂交玉米、高粱(jowar)、柠檬草、龙舌兰、御谷、龙爪稷、狐尾粟、日本粟、proso millet、新西兰亚麻、燕麦、油棕、棕榈、西米棕榈、小糠草、剑麻、高粱、斯佩尔特小麦、甜玉米、甜高粱、甘蔗、芋头、埃塞俄比亚画眉草、梯牧草、黑小麦、香草、小麦和山药。
[0500]
当植物是裸子植物或种子是裸子植物的种子时，裸子植物可以来自选自下的科：南洋杉科(araucariaceae)、boweniaceae、十字花科(brassicaceae)、三尖杉科(cephalotaxaceae)、柏科(cupressaceae)、苏铁科(cycadaceae)、麻黄科(ephedraceae)、银杏科(ginkgoaceae)、买麻藤科(gnetaceae)、松科(pinaceae)、罗汉松科
(podocarpaceae)、紫杉科(taxaceae)、杉科(taxodiaceae)、百岁兰科(welwitschiaceae)和泽米科(zamiaceae)。
[0501]
当植物来自十字花科时，植物可以包括芸苔属(brassica)植物。例如，十字花科的植物可以包括甘蓝型油菜(brassica napus)、芜菁(brassica rapa)、芥菜型油菜(brassica juncea)、白芥(brassica hirta)、甘蓝(brassica oleracea)、萝卜(raphanus sativus)、sinapus alba或家独行菜(lepidium sativum)。
[0502]
本文所述的植物和植物种子可包括转基因植物或植物种子，例如转基因谷物(小麦、稻)、玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草、油菜和水果植物(苹果、梨、柑橘类水果和葡萄的果实，包括酿酒葡萄)。优选的转基因植物包括玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草、糖用甜菜、甘蔗和油菜。
[0503]
合适的转基因植物和种子的特征在于植物形成毒素，特别是来自苏云金芽孢杆菌遗传物质(例如，通过基因cryia(a)、cryia(b)、cryia(c)、cryiia、cryiiia、cryiiib2、cry9c、cry2ab、cry3bb、cryif或其组合)。植物中毒素的形成增加了植物对昆虫、蛛形纲动物、线虫、蛞蝓和蜗牛的抗性(以下简称“bt植物”)。例如，bt植物是市售的，以商品名yield(例如玉米、棉花、大豆)、(例如玉米)、(例如玉米)、(棉花)、(棉花)和(马铃薯)玉米品种、棉花品种、大豆品种和马铃薯品种。除草剂耐受植物包括商品名为roundup(草甘膦耐受，如玉米、棉花、大豆)、(如玉米)、liberty(草铵膦耐受，如油菜)、(咪唑啉酮耐受)和(磺酰脲耐受，如玉米)的植物。
[0504]
本文所述的植物种子可以是遗传修饰的(例如，产生遗传修饰的植物或植物部分的任何种子，所述植物或植物部分表达除草剂耐受性、对环境因素例如水胁迫、干旱、病毒和氮产生的耐受性、或对细菌、真菌或昆虫毒素的抗性)。合适的遗传修饰的种子包括油菜作物(cole crop)、蔬菜、水果、树木、纤维作物、油料作物、块茎作物、咖啡、花、豆类、谷物以及单子叶和双子叶物种的其他植物的种子。优选地，遗传修饰的种子包括花生、烟草、草、小麦、大麦、黑麦、高粱、稻、油菜籽、甜菜、向日葵、番茄、胡椒、菜豆、生菜、马铃薯和胡萝卜。最优选地，遗传修饰的种子包括棉花、大豆和玉米(甜玉米、田地、种子或爆米花)。
[0505]
可以根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化事件或转化事件的组合的植物，其例如在来自各个国家或地区监管机构的数据库中列出(参见例如http：//gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和http：//www.agbios.com/dbase.php)。
[0506]
已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求中限定的本发明范围的情况下，修改和变化是可能的。
实施例
[0507]
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
[0508]
实施例1.构建展示多聚半乳糖醛酸内切酶的蜡样芽孢杆菌家族成员
[0509]
为了构建展示seq id no：227的多聚半乳糖醛酸内切酶的蜡样芽孢杆菌家族成员，通过将puc57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒和cole1复制起点)与来自蜡样芽孢杆菌的pbc16
‑
1质粒(含有四环素抗性基因、repu复制基因和oriu复制起点)融合产生psuper质粒。
注意，seq id no：227与seq id no：210相同，只是seq id no：227在其羧基末端含有一个额外的半胱氨酸。该5.8kb质粒可在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制，并且可以通过赋予大肠杆菌对β
‑
内酰胺抗生素的抗性和芽孢杆菌属种对四环素的抗性来选择。通过插入pcr生成的片段对基础psuper质粒进行修饰，该片段将bcla启动子(seq id no：149)、起始密码子、bcla的氨基酸20
‑
35(seq id no：1的氨基酸20
‑
35)和丙氨酸接头序列与seq id no：227进行框内融合，分别产生了称为psuper
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：227的质粒。将该构建体转化到大肠杆菌中，并置于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的溶源性肉汤(lysogeny broth)平板，以获得单菌落。使用单个菌落接种溶源性肉汤加氨苄青霉素，并在37℃300rpm下培育过夜。使用商业质粒纯化试剂盒从所得培养物中提取质粒。通过分光光度法测定这些质粒提取物的dna浓度，并用限制性酶的适当组合对获得的质粒进行分析消化。通过琼脂糖凝胶电泳使所得消化模式可视化，以研究质粒大小和是否存在不同的质粒特征。通过sanger测序进一步研究了纯化的psuper衍生物的相关部分，如seq id no：227表达盒。通过电穿孔将验证的psuper质粒引入苏云金芽孢杆菌bt013a。通过在含有四环素(10μg/ml)的营养物肉汤平板上铺板分离单个转化菌落。使用单个阳性菌落接种含四环素(10μg/ml)的脑心浸液肉汤，并在30℃ 300rpm下孵育过夜。纯化所得培养物的基因组dna，并对psuper质粒的相关部分重新测序，以确认克隆序列的遗传纯度。经过验证的菌落在含有10μg/ml四环素的脑心浸液肉汤中生长过夜，并通过在基于酵母提取物的培养基中于30℃孵育48小时诱导形成孢子。
[0510]
苏云金芽孢杆菌bt013a也以与重组菌株相同的方式生长。bt013a的全发酵液培养物用作下述实施例中描述的植物生长促进和水分胁迫研究的对照。
[0511]
苏云金芽孢杆菌bt013a于2014年3月10日保藏于美国农业部(usda)农业研究处(ars)，其位于美国伊利诺伊州(邮编：61604)peoria市北部大学街1815号，并且指定其以下登录号：nrrl b
‑
50924。苏云金芽孢杆菌bt013a也被称为苏云金芽孢杆菌4q7。
[0512]
实施例2.加拿大油菜(canola)植物生长促进研究
[0513]
透明托盘(5
”×5”×
2 1/2”)覆盖有5
”×
5”versapak(anchor paper company，st.paul，mn)缓冲材料。在每个托盘中，使用无菌镊子放置五十粒加拿大油菜种子，并用50ml稀释的全发酵液处理，这样每个托盘至少接受2
×
107cfu的bt013a野生型菌株或展示多聚半乳糖醛酸内切酶负荷的重组菌株(“epg菌株”)，如实施例1中所述。未处理的对照托盘接受50ml无菌水。每个菌株测定一百粒种子，未处理的对照分别放在两个托盘中。将托盘以随机顺序放置在设置为450μmol m
‑2sec
‑1光合光子通量密度(ppfd)、14小时光照(28℃)/10小时黑暗(18℃)的生长室架中21天，并每天轮换以使位置影响最小。从第7天开始每天浇水，直到实验结束。没有使用肥料或生长改良剂。
[0514]
在种子处理后五天开始观察加拿大油菜幼苗的植物生长促进性状。在种子处理后的第5、7、14和21天，使用相机(nikon，tokyo，japan)获得带有颜色和尺寸校准器的托盘中幼苗的照片，该照片可使用easyleaf area软件进行植物图像分析(easlon，hm，&bloom，a.j.(2014).easy leaf area：automated digital image analysis for rapid and accurate measurement of leaf area.applications in plant sciences，2(7)，1400033)。与用野生型菌株处理的幼苗相比，用实施例1的epg菌株的全发酵液培养物处理的幼苗显示出15％的叶面积增加。此外，与未处理的幼苗相比，用实施例1的epg菌株的全发酵液培养物处理的幼苗显示出25％的叶面积增加。
[0515]
实施例3.玉米和大豆水分胁迫研究
[0516]
透明托盘(8
”×8”×
3”)填充沙子至距顶部约1英寸，并用150ml水进行水合，用约238ppm n(测量为每一百万中的份数的氮的肥料浓度)peters 20
‑
20
‑
20通用肥料(the scotts company，marysville，oh)进行改善。将16粒玉米和大豆种子种植在1英寸深的四行中，每行四粒。随后用50ml上述全发酵液样品浸透每个托盘，使得每个托盘接受至少2
×
107cfu的bt013a野生型菌株或epg菌株的全发酵液培养物。未处理的对照托盘接受50ml无菌水。将托盘以随机顺序放置在设置为450μmol m
‑
2 sec
‑
1 ppfd(光合光子通量密度)、14小时光照(28℃)/10小时黑暗(18℃)的生长室架中14天，并每天轮换以使位置影响最小。种植后八天每天浇水，然后暂停两天以实现水分胁迫，重新开始浇水直至种植后第十四天，以使植物在水分限制条件之后恢复。
[0517]
在浸透种子十四天后观察玉米和大豆幼苗的植物生长促进性状。种植后五天记录种子萌发。收获地上组织和根组织，在设定为75℃的烘箱中干燥，并在五天后称重。用epg菌株的全发酵液培养物处理的玉米幼苗的干重比用野生型菌株处理的幼苗高41％，比未处理的幼苗高18％。用epg菌株全发酵液培养物处理的大豆幼苗的干重小于用野生型菌株处理的幼苗，但略高于未处理的幼苗。
[0518]
实施例4.构建展示seq id no：211
‑
212的多聚半乳糖醛酸内切酶和seq id no：219
‑
220的多聚半乳糖醛酸酶的蜡样芽孢杆菌家族成员
[0519]
以与上述实施例1中针对seq id no：227的相同的方式制备编码含有多聚半乳糖醛酸内切酶或多聚半乳糖醛酸酶序列的融合蛋白的psuper构建体。因此，每个构建体都含有与起始密码子融合的bcla启动子(seq id no：149)、bcla的氨基酸20
‑
35(seq id no：1的氨基酸20
‑
35)的编码序列和丙氨酸接头，其与多聚半乳糖醛酸酶(seq id no：211、212、219和220)的编码序列同框。
[0520]
此外和或者，上述psuper质粒的衍生质粒的产生如下所示。上述psuper质粒的pbc片段(包含bcla/多聚半乳糖醛酸酶表达盒的psuper的pbc16
‑
1衍生部分)通过pcr扩增，随后通过平端连接环化。
[0521]
将这些携带四环素抗性的pbc质粒连接物通过电穿孔引入苏云金芽孢杆菌bt013a。通过在含有四环素(10μg/ml)的营养物肉汤板上铺板来分离单个转化的菌落。使用单个阳性菌落来接种含有四环素(10μg/ml)的脑心浸液肉汤，并在30℃、300rpm下孵育过夜。纯化所得培养物的基因组dna，并对pbc质粒的相关部分进行重新测序，以确认克隆序列的遗传纯度和正确的连接位点。经验证的菌落在含有10μg/ml四环素的脑心浸液肉汤中培养过夜，并在基于酵母提取物的培养基中于30℃诱导48小时以形成孢子。
[0522]
实施例5.从表达多聚半乳糖醛酸内切酶的蜡样芽孢杆菌家族成员中构建和纯化孢子外壁片段
[0523]
敲除(ko)突变体：为了制备苏云金芽孢杆菌bt013a的exsy敲除(ko)突变菌株bt013aexsyko，构建了质粒pkoki穿梭和整合载体，该载体含有能够在大肠杆菌中复制的puc57骨架以及来自pe194的复制起点和红霉素抗性盒。该构建体能够在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制。制备含有与exsy基因上游区域相对应的1kb dna区域和与exsy基因下游区域相对应的1kb区域的构建体，这两个区域均为苏云金芽孢杆菌bt013a的pcr扩增产物。对于每个构建体，然后使用同源重组将两个1kb区域剪接在一起，彼此之间和与pkoki质粒之
间有重叠区域。该质粒构建体通过消化和dna测序验证。筛选克隆的红霉素抗性。
[0524]
克隆在脑心浸液肉汤中在高温(40℃)下传代。将单个菌落挑到含有5μg/ml红霉素的lb琼脂平板上，在30℃下生长，并通过菌落pcr筛选整合到染色体中的pkoki质粒的存在。具有整合事件的菌落通过传代而持续，以筛选失去红霉素抗性的单菌落(表明通过重组丢失质粒并去除exsy基因)。通过染色体靶区域的pcr扩增和测序来确认已验证的缺失。最后，将每个含有编码多聚半乳糖醛酸酶的基因(如上文实施例4所述)的pbc质粒转化到bt013a的exsy突变菌株中。
[0525]
对于表达seq id no：211
‑
212或219
‑
220的多聚半乳糖醛酸酶的每个exsy突变体，过夜培养物在具有抗生素选择的带挡板烧瓶中于30℃、300rpm在脑心浸液培养基中生长。将一毫升这种过夜培养物接种到带挡板烧瓶中的基于酵母提取物的培养基(50ml)中，并在30℃下生长2天。取出孢子的等分试样，并通过涡旋搅动孢子。在8,000xg下离心10分钟收集孢子，将含有孢子外壁片段的上清液通过0.22μm过滤器过滤以去除任何残留的孢子。滤液中未发现孢子。
[0526]
实施例4和5中描述的重组菌株描述于下表6中。
[0527]
表6
[0528]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员的简称质粒bt013a
‑
pbc211pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：211bt013a
‑
pbc212pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：212bt013a
‑
pbc219pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：219bt013a
‑
pbc220pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：220bt013aexsyko
‑
pbc211pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：211bt013aexsyko
‑
pbc212pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：212bt013aexsyko
‑
pbc219pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：219bt013aexsyko
‑
pbc220pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：220
[0529]
实施例6.用来自芽孢杆菌属物种的epg和多聚半乳糖醛酸酶进行加拿大油菜植物生长促进研究
[0530]
透明托盘(5
”×5”×
21/2”)覆盖有5
”×
5”versapak(anchor paper company，st.paul，mn)缓冲材料。在每个托盘中，放置50粒油菜籽并用50ml稀释的全发酵液处理，使得每个托盘接受(i)至少1
×
105cfu的bt013a野生型菌株或(ii)至少1
×
105cfu的如下表7中所示的重组bt013a菌株，或(iii)与如下表7中所示的重组bt013aexsyko菌株的全发酵液培养物(包含至少1
×
105cfu)体积相等的孢子外壁片段制剂。(选择此体积是为了获得与(ii)中使用的全发酵液样品中的酶量相当的酶量，因为在用于将孢子外壁片段与细胞分离的离心和过滤过程中损失的液体非常少，并且假设bt013a
‑
pbc2xx和bt013aexsyko
‑
pbc2xx的全发酵液培养物在其孢子外壁上显示相似量的酶。)未处理的对照托盘接受50ml无菌水。每个菌株测定了200粒种子，未处理的对照分别放在四个托盘中。将托盘以随机顺序放置在设置为450μmol m
‑2sec
‑1光合光子通量密度(ppfd)、14小时光照(28℃)/10小时黑暗(18℃)的生长室架中14天，并每天轮换以使位置影响最小。没有使用肥料或生长改良剂。除了在试验开始时给予的浇水之外，没有提供额外的浇水。
[0531]
在种子处理后7天开始观察加拿大油菜幼苗的植物生长促进性状。在种子处理后
的第7、11和14天，使用相机(nikon，tokyo，japan)获得带有颜色和尺寸校准器的托盘中幼苗的照片，该照片可使用easy leaf area软件进行植物图像分析(easlon，hm，&bloom，a.j.(2014).easy leaf area：automated digital image analysis for rapid and accurate measurement of leaf area.applications in plant sciences，2(7)，1400033)。
[0532]
表7
[0533][0534]
＊2xx与“处理”列中显示的seq id no相对应。
[0535]
实施例7.构建展示果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶的蜡样芽孢杆菌家族成员
[0536]
如上文实施例1中针对seq id no：227所述，制备编码含有果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶序列的融合蛋白的psuper构建体。因此，每个构建体都含有与起始密码子融合的bcla启动子(seq id no：149)、bcla的氨基酸20
‑
35(seq id no：1的氨基酸20
‑
35)的编码序列和丙氨酸接头，其与果胶酸裂合酶(seq id no：222、223、224、225和226)或多聚半乳糖醛酸外切酶(seq id no：218)的编码序列同框。
[0537]
如实施例4所述，将上述psuper构建体的携带四环素抗性的pbc部分转化到野生型苏云金芽孢杆菌bt013a中。如实施例4所述，产生了基于野生型苏云金芽孢杆菌bt013a菌株的表达菌株的全发酵液培养物。将上述psuper构建体的携带四环素抗性的pbc部分进一步转化到来自实施例5的苏云金芽孢杆菌bt013a的exsy敲除突变体中。如实施例5所述，产生了基于苏云金芽孢杆菌bt013a的exsy ko突变体的表达菌株的孢子外壁片段制剂。
[0538]
实施例7中描述的重组菌株描述于下表8中。
[0539]
表8
[0540]
重组蜡样芽孢杆菌家族成员的简称质粒bt013a
‑
pbc218pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：218bt013a
‑
pbc222pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：222bt013a
‑
pbc223pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：223bt013a
‑
pbc224pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：224bt013a
‑
pbc225pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：225bt013a
‑
pbc226pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：226bt013aexsyko
‑
pbc218pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：218
bt013aexsyko
‑
pbc222pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：222bt013aexsyko
‑
pbc223pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：223bt013aexsyko
‑
pbc224pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：224bt013aexsyko
‑
pbc225pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：225bt013aexsyko
‑
pbc226pbc
‑
bcla 20
‑
35
‑
seq id no：226
[0541]
实施例8.用果胶酸裂合酶和多聚半乳糖醛酸外切酶处理玉米种子导致植物高度增加
[0542]
根据实施例7，分别制备bt013a
‑
pbc218、bt013a
‑
pbc222、bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc224、bt013a
‑
pbc225、bt013a
‑
pbc226的含有果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶的全发酵液样品和bt013aexsyko
‑
pbc218、bt013aexsyko
‑
pbc222、bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc224、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226的含有果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶的孢子外壁片段制剂(培养物孢子形成率：约99％；最终孢子浓度：每毫升1.1
‑
1.7
×
108个孢子)并以每粒种子0.72μl的使用率施用于玉米种子(beck’s玉米杂种5765yh)。在重复试验中研究处理过的种子，每个试验重复3次，每次重复中每次处理18粒种子。将包衣种子直接播种到39.7cm3的盆中，盆中含有2.54cm2深度的砂壤土表土，每盆两粒种子。种植后，每盆加入50ml室温水使其萌发。将盆放在人工照明的生长室中，在13/11光照/日周期和21℃白天/15℃夜间温度范围内接受大约300μmol m
‑2s
‑1(可见光光子)。所有植物都接受相同的浇水和施肥方法。种植后十天(dap)测量植物高度。将平均植物高度测量值归一化至各次重复中用等体积的水(而非全发酵液样品或孢子外壁片段制剂)处理的种子长出的植物的平均植物高度，随后在试验的全部重复中进行平均。获得的结果报告在下表9中。通过利用假设样本间方差相等的双尾t检验获得p值。
[0543]
表9.果胶酸裂合酶和多聚半乳糖醛酸外切酶对玉米植物高度的影响，种子处理
[0544][0545][0546]
用每粒种子施用0.72μl果胶酸裂合酶(bt013a
‑
pbc222、bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc224、bt013a
‑
pbc225、bt013a
‑
pbc226、bt013aexsyko
‑
pbc222、bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc224、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226)或多聚半乳糖醛酸外切酶(bt013a
‑
pbc218、bt013aexsyko
‑
pbc218)处理玉米种子，导致对v2(第二叶茎期，10dap)玉米植物产生了积极的生长益处。在三重复试验中进行比较，与水处理的对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103的bt013aexsyko
‑
pbc223的孢子外壁片段制剂使平均植物
高度显著(p≤0.005)增加了 13.9％。与水处理的对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103、pel
‑
22和pel的全发酵液样品(bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc224、bt013a
‑
pbc226)使平均植物高度分别显著(p≤0.05)增加了 5.7％、 6.4％、 6.0％。在三重复试验中进行比较，与水处理的对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
22和pela、pel的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc224、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226)导致平均植物高度显著(p≤0.05)增加了 6.9％、 8.7％和 11％。与水处理的对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pelc和pela的全发酵液样品(bt013a
‑
pbc222、bt013a
‑
pbc225)和含有果胶酸裂合酶pelc的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc222)导致植物高度分别增加 6.0％、 3.4％、和 3.3％。
[0547]
实施例9：用果胶酸裂合酶和多聚半乳糖醛酸外切酶处理大豆种子对萌发、植物生长、冠层覆盖和生物量的影响
[0548]
根据实施例7，分别制备bt013a
‑
pbc218、bt013a
‑
pbc222、bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc224、bt013a
‑
pbc225、bt013a
‑
pbc226的含有果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶的全发酵液样品和bt013aexsyko
‑
pbc218、bt013aexsyko
‑
pbc222、bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc224、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226的含有果胶酸裂合酶或多聚半乳糖醛酸外切酶的孢子外壁片段制剂(培养物孢子形成率：约99％；最终孢子浓度：每毫升1.1
‑
1.7
×
108个孢子)并以每粒种子0.5μl的使用率施用于大豆种子(beck’s大豆品种366l4)。对照种子用等体积的水处理。在重复试验中研究处理过的种子，每个试验重复3次，每次重复中每次处理18粒种子。将包衣种子直接播种到39.7cm3的盆中，盆中含有2.54cm2深度的砂壤土表土，每盆两粒种子。种植后，每盆加入50ml室温水使其萌发。将盆放在人工照明的生长室中，在13/11光照/日周期和24℃白天/20℃夜间温度范围内接受大约300μmol m
‑2s
‑1(可见光光子)。所有植物都接受相同的浇水和施肥方法。种植后十四天记录出苗计数(表10)。出苗率定义为直到种植后十四天从土壤表面出苗的所有幼苗的百分比。此外，在种植后十四天的vc(子叶期)测定植物高度(表11)和绿冠层覆盖分数(fgcc)(表12)，并与从仅接受水处理的种子长出的十四天大的植物进行比较。fgcc是用于估计绿色冠层面积的诊断参数。canopeo(matlab，mathworks，inc.，natick，ma)作为fgcc的测量工具，基于确定红绿(r/g)和蓝绿(b/g)的颜色比，使得能够补偿多余的绿色指数和背景。fgcc的范围从0(0％绿冠层覆盖)到1(100％绿冠层覆盖)。绿冠层的分类基于以下标准：
[0549]
r/g＜p1和b/g＜p2和2g
‑
r
‑
b＞p3[0550]
其中p1和p2是接近数值1的参数，用于对绿色波段范围(500
‑
570nm)中的像素进行分类，p3是设置最小多余绿色植被并允许背景去除的参数。使用canopeo的默认参数(p1＝0.95、p2＝0.95和p3＝20)。
[0551]
种植后四到五周，获得干生物量的测量值并与从水处理的种子生长的对照植物进行比较。表13总结了54粒种子试验中每个处理的归一化生物量结果。
[0552]
表10果胶酸裂合酶对大豆萌发的影响，种子处理
[0553]
[0554][0555]
相对于从水处理的对照种子长出的植物，用每粒种子施用0.5μl的果胶酸裂合酶(bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225)处理大豆种子提高了萌发百分比。与水处理的对照种子相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103和pela的全发酵物样品(bt013a
‑
pbc223、bt013a
‑
pbc225)使萌发分别增加了 9％和 7％。与水处理的对照种子相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103和pela的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225)分别使大豆植物的萌发增加了 5％和 2％。
[0556]
表11.果胶酸裂合酶和多聚半乳糖醛酸外切酶对大豆植物高度的影响，种子处理
[0557][0558][0559]
用每粒种子施用0.5μl果胶酸裂合酶(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225)或多聚半乳糖醛酸外切酶(bt013aexsyko
‑
pbc218)处理大豆种子，导致对vc(子叶期；14dap)大豆植物产生了积极的生长益处。在三次18粒种子的重复中，与水处理的种子长
出的植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103和pela的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225)使大豆植物高度显著(p≤0.05)增加了 12.4％和 10.8％。与水处理的对照植物相比，含有多聚半乳糖醛酸外切酶exopg的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc218)显示出平均植物高度的生长增加 4.6％。
[0560]
表12.果胶酸裂合酶对大豆的fgcc的影响，种子处理
[0561][0562][0563]
用每粒种子施用0.5μl果胶酸裂合酶(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226)或多聚半乳糖醛酸外切酶(bt013aexsyko
‑
pbc218)处理大豆种子，导致对vc(子叶期；14dap)大豆植物的冠层覆盖产生了积极的影响。在三次18粒种子的重复中，与水处理的对照种子长出的植物相比，分别含有果胶酸裂合酶pel
‑
103、pela和pel(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226)和多聚半乳糖醛酸外切酶exopg(bt013aexsyko
‑
pbc218)的孢子外壁片段制剂使平均植物冠层覆盖率分别增加了 52.2％、 31.3％、 20.2％和 20.0％。
[0564]
表13.果胶酸裂合酶对大豆中干重的影响，种子处理
[0565][0566][0567]
在54粒种子试验中，用每粒种子施用0.5μl用果胶酸裂合酶(bt013aexsyko
‑
pbc223、bt013aexsyko
‑
pbc224、bt013aexsyko
‑
pbc225、bt013aexsyko
‑
pbc226)和多聚半乳糖醛酸外切酶(bt013aexsyko
‑
pbc218)处理大豆种子，导致对4
‑
5周龄大豆植物的生物量产生了积极的影响。与水处理的种子长出的植物相比，含有果胶酸裂合酶pel的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc226)使每株植物的平均干总生物量、平均干地上生物量和平均干根生物量分别增加了 23.9％、 26.5％和 21.0％。与对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
22的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc224)使每株植物的平均干总生物量、干地上生物量和干根生物量分别增加了 15.7％、 23.2％和 2.6％。与对照植物相比，含有果胶酸裂合酶pel
‑
103的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc223)导致每株植物的平均干总生物量和干根生物量分别增加了 4.6％和 14.0％。与水处理的对照植物相比，在孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc225)中提供给种子的果胶酸裂合酶pel a使每株植物的平均干总生物量、干地上生物量和干根生物量分别增加了 8.8％、 2.2％和 21.3％。与水处理的对照植物相比，作为种子处理施用的含有多聚半乳糖醛酸外切酶exopg的孢子外壁片段制剂(bt013aexsyko
‑
pbc218)使平均干地上生物量增加了1.3％。
[0568]
鉴于以上所述，将会看到实现了本发明的几个目的并且获得了其他有利的结果。
[0569]
由于可以在不偏离本发明范围的情况下对上述产品、制剂和方法进行各种改变，
因此上述描述中包含的所有内容均应被解释为示例性的而非限制性的。
[0570]
实施方案
[0571]
为了进一步说明，本发明公开的另外的非限制性实施方案在下面阐述。
[0572]
实施方案1是一种融合蛋白，其包含在下表14的第2列中描述的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段和第1列中描述的酶。
[0573]
表14.融合蛋白
[0574][0575]
实施方案2是实施方案1的任何融合蛋白，该融合蛋白在靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段与酶之间具有氨基酸接头。
[0576]
实施方案3是实施方案2的任何融合蛋白，其中所述接头包含聚丙氨酸接头、聚甘
氨酸接头或包含丙氨酸和甘氨酸残基两者的混合物的接头。
[0577]
实施方案4是表达实施方案1
‑
3的任何融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员。
[0578]
实施方案5是实施方案4的重组蜡样芽孢杆菌家族成员，其中所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员包括苏云金芽孢杆菌bt013a。
[0579]
实施方案6是实施方案4的重组蜡样芽孢杆菌家族成员，其具有突变，该突变导致蜡样芽孢杆菌家族成员孢子具有与野生型孢子的孢子外壁相比更容易从孢子中除去的孢子外壁。具体而言，具有突变的重组蜡样芽孢杆菌家族成员可以具有以下突变之一：
[0580]
(i)cote基因中的突变；
[0581]
(ii)表达exsy蛋白，其中在相同条件下与野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中exsy蛋白的表达相比，exsy蛋白的表达增加，并且其中exsy蛋白包含羧基端标签，该标签含有球状蛋白；
[0582]
(iii)表达bclb蛋白，其中在相同条件下与野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中bclb蛋白的表达相比，bclb蛋白的表达增加；
[0583]
(iv)表达yjcb蛋白，其中在相同条件下与野生型蜡样芽孢杆菌家族成员中yjcb蛋白的表达相比，yjcb蛋白的表达增加；
[0584]
(v)包含exsy基因中的突变；
[0585]
(vi)包含coty基因中的突变；
[0586]
(vii)包含exsa基因中的突变；或者
[0587]
(viii)包含coto基因中的突变。
[0588]
实施方案7包含实施方案6的重组蜡样芽孢杆菌家族成员，其具有exsy或coty基因中的突变。
[0589]
实施方案8包含来自实施方案6和7中任一项的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁片段。
[0590]
实施方案9包含实施方案4和5中任一项的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的全发酵液培养物。
[0591]
实施方案10包含实施方案6和7中任一项的重组蜡样芽孢杆菌家族成员的全发酵液培养物或其他发酵产物。
[0592]
实施方案11包含来自实施方案10的全发酵液培养物的孢子外壁片段。
[0593]
实施方案12包含实施方案4和5中任一项的重组蜡样芽孢杆菌家族成员和农业上可接受的载体。
[0594]
实施方案13包含实施方案9的全发酵液培养物或其他发酵产物和农业上可接受的载体。
[0595]
实施方案14包含实施方案8或实施方案11的孢子外壁片段和农业上可接受的载体。