一种美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记组合物及应用的制作方法

1.本发明属于生物分子技术领域，具体涉及一种美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记组合物及应用。


背景技术：

2.分子标记辅助育种是一种快速发展的新技术，通过在分子水平上对个体的遗传组成进行快速准确地分析来实现对基因型的直接选择，从而进行分子育种。
3.美洲南瓜(cucurbita maxima l.)是葫芦科(cucurbitaceae)南瓜属(cucurbita)一年生蔓生的草本植物，美洲南瓜又名西葫芦，原产北美洲南部，中国于19世纪中叶开始从欧洲引入栽培，世界各地均有分布。其果肉和籽粒均可食用，且具有栽培容易、产量高、营养价值丰富等优点；美洲南瓜有深绿茎和浅绿茎两种颜色，随着植株的生长，逐渐发生性状分离。茎颜色主要由叶绿素调控，在南瓜的不断生长过程中，叶绿素的积累出现差异，形成深色茎和浅色茎，而深绿色的茎颜色是南瓜重要的农艺性状之一，因此，对南瓜深绿色茎颜色性状的利用，选育出有深绿色茎颜色性状的美洲南瓜具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。
4.传统育种方法选育美洲南瓜深绿色茎过程中，由于苗期的茎均表现为浅绿状态，需要等待美洲南瓜长到开花时期才能辨别茎的颜色，存在选苗占地广和育种周期长等问题。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在南瓜遗传育种中是十分有效的方法，可以有效拓宽这一性状的应用，推动品质育种进程。因此，开发美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记，对于了解美洲南瓜茎颜色变化的分子机制具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了在美洲南瓜的苗期快速，高效鉴定美洲南瓜深绿茎性状，加速深绿茎南瓜选育进程。
6.本发明提供了一种美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记组合物，所述分子标记组合物为以下(a)或(b)或为(a)和(b)的组合：
7.(a)seq id no:1所示的核苷酸序列和seq id no:2所示的核苷酸序列；
8.(b)seq id no:3所示的核苷酸序列和seq id no:4所示的核苷酸序列。
9.进一步地限定，扩增所述(a)组核苷酸序列的引物为：seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列。
10.进一步地限定，扩增所述(b)组核苷酸序列的引物为：seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列。
11.本发明提供了一种鉴定美洲南瓜深绿茎性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的分子标记组合物。
12.进一步地限定，所述试剂盒还包括：10
×
buffer、dntp、dna模板、taq酶和ddh2o。
13.本发明一种鉴定美洲南瓜深绿茎性状的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤
为：
14.(1)提取待检测样品的dna；
15.(2)以步骤(1)所述的dna为模板，利用seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列进行pcr反应，再利用seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列进行pcr反应，如果扩增的条带为128nt和331nt，则待检测植株为纯合，如果扩增的片段大小为128nt和137nt或331nt和306nt，则待检测植株为杂合。
16.本发明提供了一种育种深绿茎美洲南瓜的方法，所述方法的具体步骤为：
17.1)以美洲南瓜深绿茎品系19为母本，以南瓜浅绿茎品系113为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得f1代与所述父本进行回交，得到后代bc1f1，分别利用seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列与seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描bc1f1群体，选择经seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列扫描后具有128nt和137nt核苷酸片段且经seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代bc2f1；
18.2)分别利用权利要求1所述的seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列与seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描bc2f1群体，选择经seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列扫描后具有128nt和137nt核苷酸片段且经seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代bc3f1；
19.3)利用权利seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列与seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描bc3f1群体，选择经分子标记seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列扫描后具有128nt和137nt核苷酸片段且经seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为bc3f2；
20.4)利用seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列与seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描bc3f2，选择经seq id no:5所示的核苷酸序列和seq id no:6所示的核苷酸序列扫描后具有128nt核苷酸片段且经seq id no:7所示的核苷酸序列和seq id no:8所示的核苷酸序列扫描后具有331nt核苷酸片段的植株，即为改良深绿茎自交系。
21.上述的分子标记组合物或上述的试剂盒在鉴定纯合美洲南瓜的深绿茎性状中的应用。
22.上述的分子标记组合物或上述的试剂盒在育种深绿茎或浅绿茎性状的美洲南瓜中的应用。
23.有益效果：本发明利用美洲南瓜深绿茎
‘
19’与浅绿茎
‘
113’杂交获得f1植株，f1植株自交获得1054株f2分离群体，通过表型分析确定了美洲南瓜深绿茎性状属于单基因控制的显性性状。后分别取f2分离群体每株嫩叶提取基因组dna，结合bsa
‑
seq的方法筛选与美洲南瓜深绿茎性状基因d紧密连锁的分子标记。利用bas
‑
seq重测序的分子标记，最终提供的两个与美洲南瓜深绿茎紧密连锁的分子标记，分别坐落在控制目标性状基因的两侧，两
标记遗传距离为61.58kb，便于深绿茎的分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记区分深绿茎和浅绿茎准确率分别为99％以上，可简便、快捷、高通量的应用与育种实践中。
24.本发明还提供了利用上述分子标记快速培育深绿茎性状美洲南瓜的应用。利用回交转育的方法，深绿茎
‘
19’作为非轮回亲本，浅绿茎
‘
113’为轮回亲本，利用本发明的两个分子标记seq id no:1所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因d连锁与seq id no:2所示的核苷酸序列，ra
‑
01引物(seq id no:5和seq id no:6)和ra
‑
02引物(seq id no:7和seq id no:8)扫描回交群体，根据pcr扩增产物，快速准确的改良浅色茎
‘
113’的茎颜色。indel分子标记具有高稳定特征，利用这些分子标记构建高密度遗传图谱和物理图谱，将有助于建立美洲南瓜深绿茎目标基因筛选的分子标记辅助育种系。
附图说明
25.图1为indel标记ra
‑
01和ra
‑
02和控制美洲南瓜深绿茎基因d紧密连锁，每一个叉号代表2个单交换事件；
26.图2为indel标记ra
‑
01p1，p2，f1，f2群体pcr产物的酶切条带，其中m为d2000marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，p1代表深绿茎品系
‘
19’，p2代表浅绿茎品系
‘
113’，f1为p1和p2的杂交第一代，f2为f1代自交后代，f2深绿茎群体和f2浅绿茎群体分别表示在f2群体中随机挑选的10株深绿茎和10株浅绿茎植株；
27.图3为indel标记ra
‑
02p1，p2，f1，f2群体pcr产物的酶切条带，其中m为d2000marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，p1代表深绿茎品系
‘
19’，p2代表浅绿茎品系
‘
113’，f1为p1和p2的杂交第一代，f2为f1代自交后代，f2深绿茎群体和f2浅绿茎群体分别表示在f2群体中随机挑选的10株深绿茎和10株浅绿茎植株。
具体实施方式
28.下面结合具体实施方法，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
29.深绿茎的标准：植株茎表皮叶绿素含量大于6mg/l范围内；
30.浅绿茎的标准：植株茎表皮叶绿素含量小于1mg/l范围内；
31.本发明提及的茎是指美洲南瓜开花时期基部茎段。
32.seq id no:1所示的核苷酸序列(该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因d连锁)与seq id no:2所示的核苷酸序列(该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因d连锁)是ra
‑
01分子标记；
33.seq id no:3所示的核苷酸序列(该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因d连锁)与seq id no:4所示的核苷酸序列(该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因d连锁)是ra
‑
02分子标记。
34.实施例1.美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记的筛选
35.1.f2群体的构建
36.本实例选取美洲南瓜高代自交系深绿茎
‘
19’和浅绿茎
‘
113’为亲本，构建f2群体。利用这两个亲本配制了杂交组合所获得f1代为深绿茎，f1代自交产生f2代分离群体，在田间鉴定1054个f2代个体中的深/浅绿茎表型，用卡方分析进行验证，得出美洲南瓜深绿茎性状
为单基因控制的显性性状，通过构建六世代群体进行遗传分析，发现深绿茎性状为显性，并将深绿茎基因命名为dor(d)。
37.2.深绿茎连锁indel标记的筛选
38.①
南瓜基因组dna的提取
39.用ctab法提取亲本及f2分离群体的叶片总dna。方法为：取两片真叶展开时的叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于2.0ml的离心管中；加入预热的1000μl ctab提取缓冲液，65℃水浴1h；取出后冷却至室温，12000r/min 4℃离心17min，吸取800μl上清液至新2.0ml的离心管中；加入等体积氯仿异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min 4℃离心13min；吸取700μl上清液至新2.0ml的离心管中；继续加入等体积氯仿异戊醇，混匀后12000r/min 4℃离心13min；取600μl上清液至新1.5ml的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻混匀，
‑
20℃冰箱存放1h；12000r/min 4℃离心10min；倒去上清液，用体积分数为70％的乙醇吹打洗涤沉淀两次，干燥后，加入40μlddh2o溶解后，加入10μg/ml的rna酶去除rna，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λdna为标准，估计所得dna的浓度，存于
‑
20℃备用。
40.②
分子标记的获得
41.根据f2代群体田间调查结果随机选取30株深绿茎与浅绿茎单株，构建深绿茎池与浅绿茎池进行bsa
‑
seq，接着利用indel
‑
index标记关联分析，将南瓜深绿茎d基因定位到第15号染色体关联区域。
42.实施例2.鉴定深绿茎美洲南瓜的方法
43.1.分析美洲南瓜基因组重测序得到的indel结果并设计indel标记引物。以深绿茎亲本、浅绿茎亲本和f
1 dna为模板，分别以seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物(扩增分子标记ra
‑
01)；seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物(扩增分子标记ra
‑
02)进行pcr扩增，上述引物由华大基因合成。pcr扩增体系程序如下：
44.表1 pcr反应体系
[0045][0046]
pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min；35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。
[0047]
2.indel分子标记扫描f2分离群体
[0048]
利用上述开发的两对indel引物扫描两个亲本及上述f2群体，寻找标记型与性状表现型的差别单株，获得与目标区段的交换单株。
[0049]
本发明中所述的扫描是指利用上述引物扩增相对应的分子标记，根据分子标记扩增结果进行茎颜色性状的判定。所述扫描过程采用的pcr体系、pcr程序同本实施例步骤1所
述。pcr产物通过聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，通过聚丙烯酰胺凝胶成像系统观察成像结果。
[0050]
结果：分子标记ra
‑
01部分扫描结果见图2，深绿茎植株均呈现出128nt或128nt和137nt的条带。浅绿茎植株呈现出137nt的条带。分子标记ra
‑
02部分扫描结果见图3，深绿茎植株均呈现出331nt或331nt和306nt的条带，浅绿茎植株呈现出331nt的条带。
[0051]
以上2个分子标记经过1054株f2分离群体进行验证，结果表明2个分子标记，ra
‑
01和ra
‑
02可以较好的区分深绿茎和浅绿茎植株，均与深绿茎基因d紧密连锁，且分别坐落于d基因两侧，两标记遗传距离为61.58kb(图1)其中，分子标记ra
‑
01中seq id no.1所示的序列与美洲南瓜深绿茎基因d连锁，seq id no.2所示的序列与浅绿茎基因d连锁；分子标记ra
‑
02中seq id no.3所示序列与美洲南瓜深绿茎基因d连锁，seq id no.4所示序列与浅绿茎基因d连锁。
[0052]
标记ra
‑
1、标记ra
‑
2与d基因各存在7个和2个单交换事件，均与目标区段紧密连锁。indel分子标记具有高稳定特征，利用这些分子标记构建高密度遗传图谱和物理图谱，将有助于建立美洲南瓜深绿茎目标基因筛选的分子标记辅助育种系。
[0053]
3.多态性片段测序
[0054]
以深色茎亲本
‘
19’和浅色茎亲本
‘
113’基因组dna为模板，分别以seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物(扩增分子标记ra
‑
01)；seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物(扩增分子标记ra
‑
02)进行pcr扩增进行pcr扩增。pcr反应总体系为20μl：10
×
buffer 2μl，dntp 2μl，dna模板1.2μl，上下引物各0.8μl，taq酶0.2μl，ddh2o 13μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。
[0055]
20μl pcr扩增产物中加入bioteke sybr green i核酸染料5μl，室温静置10分钟使染料与dna结合，2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用takara minibest agarose gel dna extraction kit分别回收纯化dna片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编号9762。将纯化片段送由华大基因有限公司测序，测序结果通过dnaman软件分析。其中以深绿茎
‘
19’为模板利用seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物扩增的片段大小为128nt，扩增序列见seq id no.1。以浅绿茎亲本
‘
113’为模板利用seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物扩增的片段大小为137nt，扩增序列见seq id no.2。以深绿茎
‘
19’为模板利用seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物，扩增的片段大小为331nt，扩增序列见seq id no.3。以浅绿茎亲本
‘
113’为模板利用seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物，扩增的片段大小为306nt，扩增序列见seq id no.4。
[0056]
鉴定绿茎性状的美洲南瓜
[0057]
提取待检测的美洲南瓜真叶的dna，进行pcr鉴定出在苗期植株的绿茎性状是否纯合。
[0058]
计算准确率的公式为：植株由分子标记鉴定的基因型/植株表现型。
[0059]
纯合的深绿茎植株利用seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物扩增的片段大小为128nt，再利用seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物，扩增的片段大小为331nt，准确率为99.23％。
[0060]
杂合深绿茎植株利用seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物扩增的片段大小为128nt和137nt，准确率为99.26％。
[0061]
杂合深绿茎植株利用seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物，扩增的片段大小为331nt和306nt，准确率为99.44％。
[0062]
实施例3.纯合深绿茎美洲南瓜的育种方法
[0063]
本实施例利用回交转育的方法，以深绿茎
‘
19’作为非轮回亲本，浅绿茎
‘
113’为轮回亲本，定向改良浅绿茎优良品系
‘
113’的茎颜色性状，具体操作步骤如下：
[0064]
(1)深绿茎
‘
19’和浅绿茎
‘
113’进行杂交，所得f1代与浅绿茎
‘
113’进行回交得到后代bc1f1，利用本发明的两个分子标记ra
‑
01和ra
‑
02扫描bc1f1群体，即以bc1f1群体中每个植株dna为模板，分别利用seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物；以及seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物进行pcr扩增。pcr反应体系、pcr反应条件同实施例1中
②
所述。选择经分子标记ra
‑
01扫描后具有128nt和137nt核苷酸片段且经分子标记ra
‑
02扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株，与浅绿茎
‘
113’进行回交得到后代bc2f1。
[0065]
(2)利用本发明的分子标记ra
‑
01和ra
‑
02扫描bc2f1群体，继续选择经标记ra
‑
01具有128nt和137nt核苷酸片段且经分子标记ra
‑
02扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株，再与浅绿茎
‘
113’进行回交得到回交三代bc3f1。
[0066]
(3)利用本发明的分子标记ra
‑
01和ra
‑
02扫描bc3f1，继续选择经分子标记ra
‑
01扫描后具有128nt和137nt核苷酸片段且经分子标记ra
‑
02扫描后具有331nt和306nt核苷酸片段的植株,自交得到后代bc3f2。
[0067]
(4)利用本发明的分子标记ra
‑
01和ra
‑
02扫描bc3f2群体，选择经分子标记ra
‑
01扫描后具有128nt核苷酸片段且经分子标记ra
‑
02扫描后具有331nt核苷酸片段的植株，即为改良深绿茎自交系。定植该自交系并调查从授粉当天起到45d成熟时期茎颜色。成熟时期茎叶绿素含量为7.8mg/l，符合深绿茎标准，表明改良后的自交系具有深绿茎性状，并且其他农艺性状与
‘
113’相似。说明利用本发明的分子标记ra
‑
01和ra
‑
02可对美洲南瓜茎颜色进行快速准确的改良。
[0068]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。