常山酮衍生物及其药物组合物和用途的制作方法

1.本文涉及药物化学，特别是一种常山酮衍生物及其药物组合物和用途。


背景技术：

2.食管癌是我国第三常见的恶性肿瘤，死亡率位居第四位，其中，超过90%的食管癌病理类型为鳞状细胞癌（chen w, zheng r, baade pd, zhang s, zeng h, bray f et al. cancer statistics in china, 2015. ca cancer j clin 2016; 66: 115
‑
132.）。至今食管癌病因不明，由于其发病隐匿、早诊率低、解剖位置复杂等原因，大部分患者初诊时已处于中晚期，大多已失去最佳治疗时机。而且其进展较快，侵袭性强，以化疗及靶向治疗为主的综合治疗是其主要治疗手段，但患者总体五年生存率低（19%），预后较差（liao xy, liu cy, he jf, wang ls, zhang t. combination of checkpoint inhibitors with radiotherapy in esophageal squamous cell carcinoma treatment: a novel strategy. oncol lett 2019; 18: 5011
‑
5021）。食管鳞癌作为我国的特殊癌种，在我国主要有河北省涉县、河南省林州、河北省磁县等高发地（he yt, li dj, liang d, jin j, wen dg, chen wq et al. [estimated of esophageal cancer incidence and mortality in china, 2013]. zhonghua zhong liu za zhi 2017; 39: 315
‑
320），目前已成为严重危害我国人民生命健康的疾病之一。
[0003]
近年来，中医药在多种疾病的预防、治疗及抗肿瘤的作用逐渐受到重视。目前已有国内外多项研究和临床实践证实，从自然环境及动植物体内提取的多种天然产物中的活性成分，如姜黄素、杨梅素、香叶素和三烯醇(t3)等具有预防及抗肿瘤作用（subramaniam s, selvaduray kr, radhakrishnan ak. bioactive compounds: natural defense against cancerbiomolecules 2019; 9）。可以采用中西药联合的策略来共同发挥治疗肿瘤、增强免疫力、减少毒副作用、预防复发等治疗作用（lin wf, lu jy, cheng bb, ling cq. progress in research on the effects of traditional chinese medicine on the tumor microenvironment. j integr med 2017; 15: 282
‑
287.）。


技术实现要素：

[0004]
常山酮（halofuginone，hf）是一种最初从植物常山中分离的生物碱——常山碱的衍生物。近年来，由于其广泛的有益生物活性，引起了人们的关注。其中包括抗疟疾，癌症，纤维化相关的疾病和自身免疫性疾病等作用，但其毒副作用大。
[0005]
本技术的发明人将常山酮加以改造为peg化常山酮，减低毒性，应用于食管鳞癌细胞株及小鼠pdx模型中，观察其对食管鳞癌细胞活力、增殖、迁移能力的影响，并探究其作用机制，为开拓临床治疗癌症的新药提供思路。
[0006]
本技术提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，
式i其中m为1至4，n为1至10，a为h或检测标记物。
[0007]
在一些实施方案中，本技术提供了式ii的化合物或其药学上可接受的盐，式ii其中m、n和a的定义同上。
[0008]
在一些实施方案中，m是2，n是1、2、3、4、5、6或7。
[0009]
在一些实施方案中，m是2，n是3。
[0010]
在一些实施方案中，a为检测标记物，优选为同位素标记物、生物素标记物或荧光标记物，最优选为生物素标记物。
[0011]
在一些实施方案中，本技术提供了式iii的化合物或其药学上可接受的盐，式iii。
[0012]
本技术的第二方面提供了式i的化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：（1）式i化合物与式ii化合物反应，得到式iii化合物；
（2）式iii化合物与式iv化合物反应，得到式i化合物；得到式i化合物；在上述式ii、式iii和式iv中的m，式iv中的n以及a，同式（i）中相应的定义。
[0013]
在一些实施方案中，所述制备方法中式iv化合物可以通过如下方式制备：。
[0014]
在一些实施方案中，所述制备方法还包括使所得化合物形成盐的步骤。
[0015]
本技术的第三方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐作为整合素抑制剂，特别是作为整合素β4亚基的抑制剂的用途。更具体地，式i的化合物或其药学上可接受的盐能够降解整合素β4亚基。
[0016]
本技术的第四方面提供了包含式i的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0017]
本技术还提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，或者包含其的药物组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
[0018]
在一些实施方案中，所述癌症为食管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、鼻咽癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结直肠癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、黑色素
瘤、骨癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌。
[0019]
申请人发现，与常山酮相比，生物素标记的peg
‑
hf不仅明显改善小鼠的体重降低，还显著改善小鼠的肝肾功能损伤。
[0020]
本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书以及附图中所描述的方案来实现和获得。
附图说明
[0021]
附图用来提供对本技术技术方案的理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术的技术方案，并不构成对本技术技术方案的限制。
[0022]
图1为化合物iii的1h nmr图谱；图2为化合物iii的质谱图；图3a示出了用不同浓度的生物素标记的peg
‑
常山酮（bio
‑
peg
‑
hf）处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系72小时，对食管鳞癌细胞显著的杀伤效果。
[0023]
图3b是荷瘤小鼠体内给药实验肿瘤示意图，给药17天后可见bio
‑
peg
‑
hf组小鼠皮下肿瘤相较对照组显著缩小。
[0024]
图3c示出了图3b的荷瘤小鼠体内给药实验统计结果，显示肿瘤质量显著减轻，图3d的统计结果显示肿瘤体积显著缩小。
[0025]
图3e是对剥离的荷瘤小鼠皮下肿瘤进行免疫组化染色的结果图，可以发现hf及bio
‑
peg
‑
hf给药组小鼠皮下肿瘤ki67染色显著减轻，提示肿瘤增殖能力减弱。
[0026]
图4a是显示bio
‑
peg
‑
hf可与整合素β4亚基存在相互作用的ip实验结果图，并且证明了bio
‑
peg
‑
hf可以降解整合素β4亚基。
[0027]
图4b：荧光共聚焦（confocal）实验显示bio
‑
peg
‑
hf与整合素β4亚基在细胞内存在共定位，且其可以减少整合素β4的膜定位。蓝色表示细胞核，红色表示整合素β4，绿色表示生物素/bio
‑
peg
‑
hf。
[0028]
图4c：使用sirna敲降 itg b4之后，bio
‑
peg
‑
hf对食管鳞癌的杀伤作用均有下降，证实整合素β4亚基是bio
‑
peg
‑
hf潜在靶点。
[0029]
图4d：使用bio
‑
peg
‑
hf处理kyse30及450细胞系，发现随着处理时间的延长，整合素β4亚基降解增加。
[0030]
图4e：剥离荷瘤小鼠皮下肿瘤，进行免疫组化染色，可以发现hf及bio
‑
peg
‑
hf组小鼠皮下肿瘤整合素β4染色显著减轻，提示肿瘤内整合素β4亚基表达减少。
[0031]
图5a示出了bio
‑
peg
‑
hf相较于常山酮可显著改善小鼠的体重减低。
[0032]
图5b示出了血清生化值，提示与常山酮组相比，bio
‑
peg
‑
hf组总蛋白与白蛋白减低有所改善。
[0033]
图5c显示bio
‑
peg
‑
hf对小鼠肾功能影响不显著。
[0034]
图5d显示bio
‑
peg
‑
hf对小鼠肝功能影响不显著。
[0035]
图5e显示bio
‑
peg
‑
hf未对小鼠肝肾细胞形态学造成破坏。
[0036]
图6a显示，通过检索数据库，我们发现在除了食管鳞癌以外的多种癌种中，整合素β4的高表达都预示着不良的预后，所以bio
‑
peg
‑
hf的抗肿瘤作用可扩展到多癌种中。
[0037]
图6b
‑
图6c示出了bio
‑
peg
‑
hf与顺铂联合用药的结果。图6b：顺铂 bio
‑
peg
‑
hf，kyse 30细胞系；图6c：顺铂 bio
‑
peg
‑
hf，kyse 450细胞系。联合用药实验提示bio
‑
peg
‑
hf与顺铂有协同作用（ci 值在 0.8 和 0.9 之间提示两个药物间是低度协同作用，ci 值在 0.6 和 0.8 之间提示两个药物间是中度协同作用，ci 值在 0.4 和 0.6 之间提示两个药物间是高度协同作用，ci 值在 0.2 和 0.4 之间提示两个药物间是强协同作用。）提示bio
‑
peg
‑
hf可以增敏顺铂。
具体实施方式
[0038]
为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0039]
本技术提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，式i其中m为1至4，n为1至10，a为h或检测标记物。
[0040]
在一些实施方案中，本技术提供了式ii的化合物或其药学上可接受的盐，式ii其中m、n和a的定义同上。
[0041]
在一些实施方案中，m是1，2，3或4。
[0042]
在一些实施方案中，m是2，同时，n为1、2、3、4、5、6或7。
[0043]
在一些实施方案中，m是2，且n是3。
[0044]
在一些实施方案中，a为检测标记物，优选为同位素标记物、生物素标记物或荧光标记物，最优选为生物素标记物。
[0045]
在一些实施方案中，本技术提供了式iii的化合物或其药学上可接受的盐，
式iii。
[0046]
在一些实施方案中，本技术化合物的药学上可接受的盐包括从药学上可接受的无机和有机酸和碱得到的那些盐。
[0047]
本技术的第二方面提供了式i的化合物的制备方法，其中m、n和a的定义同上，所述方法包括以下步骤：（1）式i化合物与式ii化合物反应，得到式iii化合物；得到式iii化合物；（2）式iii化合物与式iv化合物反应，得到式i化合物；得到式i化合物；在上述式ii、式iii和式iv中的m，式iv中的n以及a，同式i中的相应定义。
[0048]
在一些实例中，所述制备方法如下路线所示：
。
[0049]
在一些实施方案中，所述方法还包括使所得化合物形成盐的步骤。
[0050]
本技术的第三方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗癌症的药物的用途，其中m、n和a的定义同上。
[0051]
发明人发现，式i的化合物通过结合整合素（integrin，也被成为整联蛋白）的β4亚基并降解β4亚基来发挥抑癌作用。因此，式i的化合物可以作为整合素β4亚基的抑制剂，用于抑制例如：食管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、鼻咽癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、结直肠癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌。
[0052]
本技术还提供了包含式i的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中m、n和a的定义同上。
[0053]
在一些实施方案中，式i的化合物或其药学上可接受的盐，或者其药物组合物可以适于口服、鼻内、直肠内、舌下、经颊或胃肠道外施用，施用的剂量为0.1mg
‑
5g/次，可以每天一次或多次，也可以两天或三天一次。
[0054]
本技术的化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：口服、肠胃外（静脉内、肌肉内或皮下）和局部给药。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂混合，例如（a）填充剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇；（b）粘合剂例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；（c）保湿剂例如，甘油；（d）崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸和碳酸钠；（e）润湿剂例如鲸蜡醇和
单硬脂酸甘油酯；和（f）润滑剂例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂中，药物组合物还可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备。
[0055]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3
‑
丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，例如花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0056]
药物组合物也可包含例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0057]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0058]
所有的剂型可利用本领域已知的标准方法制备。
[0059]
本发明化合物可以单独给药，或者与药学上可接受的其他药物联合给药，用于治疗食管鳞癌、肾上腺皮质癌、肾透明细胞癌、肺腺癌、胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或肾癌。
[0060]
本发明的化合物可以与例如顺铂、紫杉醇、依托泊苷、多柔比星、博来霉素等药物连用，或者用于新辅助化疗，在术前将肿瘤缩小至手术标准。
[0061]
实施例1 式iii化合物的合成和表征式iii化合物的合成路线如下所示。式iii化合物的合成路线如下所示。
[0062]
合成: a) 二氯甲烷（dcm）, 二碳酸二叔丁酯（boc2o）, 三乙胺（et3n）, r.t., 12 h; b) 二环己基碳二亚胺（dcc）, 4
‑
二甲氨基吡啶（dmap）, dcm, r.t., 24 h; c) dcm, 三氟乙酸（tfa）,
ꢀ‑
5℃, 3 h; d) 丁二酸酐, dcm, dmap, et3n, r.t., 36 h; e) 生物素
‑
peg
‑
nh2（biotin
‑
peg
‑
nh2）, 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（edcl）, dmap, dcm, r.t., 48 h.生物素
‑
peg
‑
nh2根据文献报道的方法合成（zhang, z., edwards, p. j., roeske, r. w., guo, l. synthesis and self
‑
alkylation of isotope
‑
coded affinity tag reagents, bioconjugate chem., 2005, 16, 458
‑
464.）。
[0063]
将常山酮(50 mg, 0.12 mmol)、丁二酸酐(18 mg, 0.18 mmol)、dmap (1.5 mg, 0.01 mmol)和et3n (0.025 ml, 0.18 mmol)溶解于20 ml dcm中，并搅拌反应混合物持续36小时，直到起始原料被消耗，消耗通过tlc分析监测。然后，将溶剂泵出，并通过快速柱分离残余物，以获得化合物2 (45 mg, 73%)。
[0064]
将化合物2 (44 mg, 0.09 mmol)、dmap (1.7 mg, 0.01 mmol)、生物素
‑
peg
‑
nh
2 (57 mg, 0.13 mmol)和edcl (26 mg, 0.13 mmol)溶解于20 ml dcm中，并搅拌反应混合物持续48小时，直到起始原料被消耗，消耗通过tlc分析监测。然后，将溶剂泵出，并通过快速柱分离残余物，以获得化合物3 (55 mg, 68%，白色固体)。
[0065]
1h光谱在bruker av400 mhz光谱仪上记录。化学位移以ppm报告。使用esi电离在waters xevo g2
‑
s tof premier上记录高分辨率质谱(hrms)。
[0066]
1h nmr (400 mhz, 氯仿
‑
d) δ 8.25 (d, j = 3.7 hz, 1h), 8.13 (dd, j = 13.0, 3.5 hz, 1h), 8.01
ꢀ‑ꢀ
7.94 (m, 1h), 7.23
ꢀ‑ꢀ
7.14 (m, 1h), 7.09
ꢀ‑ꢀ
6.93 (m, 1h), 6.45 (t, j = 10.5 hz, 1h), 5.85 (d, j = 8.0 hz, 1h), 5.19
ꢀ‑ꢀ
4.86 (m, 3h), 4.47 (dd, j = 7.7, 5.0 hz, 1h), 4.29 (dd, j = 8.0, 4.5 hz, 1h), 3.93
ꢀ‑ꢀ
3.87 (m, 1h), 3.85
ꢀ‑ꢀ
3.71 (m, 2h), 3.64
ꢀ‑ꢀ
3.58 (m, 6h), 3.53 (d, j = 9.8 hz, 4h), 3.46 (s, 2h), 3.30(d, j = 5.5 hz, 4h), 3.20
ꢀ‑ꢀ
3.14 (m, 1h), 3.12 (s, 1h), 2.85 (d, j = 5.1 hz, 2h), 2.72 (d, j = 12.6 hz, 3h), 2.60 (d, j = 9.9 hz, 1h), 2.46 (d, j = 6.8 hz, 1h), 2.17 (t, j = 7.4 hz, 2h), 2.06
ꢀ‑ꢀ
1.92 (m, 1h), 1.76 (t, j = 6.2 hz, 7h), 1.63 (d, j = 7.3 hz, 3h), 1.49 (d, j = 13.0 hz, 1h), 1.40 (dd, j = 14.0, 6.8 hz, 3h).ms (esi ) m/z c
40
h
58
brcln7o
10
s
理论值942.2832, 实测值: 942.2825.以下实施例考察了式iii化合物治疗食管鳞癌的效果、探索了抑癌机理。
[0067]
1 实验材料1.1 食管癌细胞系和培养条件本实验所用的人食管鳞癌细胞株kyse30、kyse450细胞由日本京都大学y. shimada博士赠与，本实验室保存。经鉴定为食管鳞癌kyse30、kyse450细胞株。食管鳞癌细胞株用rpmi 1640 10%胎牛血清（fetal bovine serum，fbs） 1%青霉素/链霉素（penicillin
‑
streptomycin，p/s）的培养基，培养于37
°
c、95%湿度、5%co2的孵箱中。
[0068]
1.2 实验动物无特定病原体（specific pathogen free，spf）级别的雌性balb/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养在带有密闭空气过滤装置的塑料笼里，笼具、垫料、
饮用水和标准饲料均经灭菌处理，饲养密度为6只/笼，可在笼里自由活动及进食。动物房温度控制在22
‑
26℃，相对湿度控制在40%
‑
60%，灯光每天控制12 h开灯/12 h黑暗循环，每天固定2个时间段环境紫外消毒半小时。实验前预先让小鼠适应环境3至5天，实验时动物一般为6
‑
8周龄，体重平均约为18
‑
20 g。所有动物实验中对动物的处置遵循《实验动物管理条例》规定。北京大学肿瘤医院动物伦理委员会审批通过了本研究中的动物实验，伦理号为eaec 2020
‑
08。
[0069]
1.3 主要仪器设备及耗材co2恒温培养箱thermoscientificii级生物安全柜thermoscientific超净工作台亚太科隆公司微量加样器eppendorf细胞计数仪invitrogen多通道移液器eppendorf电动移液器eppendorfika磁力搅拌器c
‑
mag超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技有限公司碎化冰块制冰机sanyo隔水式培养箱上海一恒科学仪器有限公司倒置光学显微镜leica正置光学显微镜leica酶标仪tecan稳压稳流电泳仪bio
‑
rad垂直电泳槽bio
‑
rad水平电泳槽bio
‑
rad低温高速离心机eppendorf电热恒温水浴箱thermoscientific电子天平ohaus涡旋振荡器scientificindustries液氮罐thermoscientific台式离心机eppendorf4℃冰箱海尔公司
‑
40℃低温冰箱海尔公司
‑
80℃超低温冰箱thermoscientific流式细胞仪bd公司激光扫描共聚焦荧光显微镜zeissamershamimager600成像仪ge石蜡切片机leica恒温摇床北方同正公司高压锅广东顺发五金制品有限公司
电磁炉苏泊尔台式玻片扫描仪leica游标卡尺北京精益恒源量具有限公司眼科剪、眼科镊上海科林医疗仪器技术有限公司8号灌胃针上海工具厂有限公司1ml及20ml注射器bd10cm、6cm细胞培养皿corning6孔/12孔/24孔/96孔细胞培养板corning0.22μm滤器millipore15ml、50ml无菌离心管corning冻存管corning1.5ml/2ml/5ml/7mlep管hyclone细胞计数板invitrogen转印滤纸bio
‑
rad 1.4 实验相关试剂及配制1.4.1 细胞培养及相关实验试剂rpmi
‑
1640培养基hyclone胎牛血清hyclone100
×
青霉素/链霉素gibcopbs缓冲液粉末（ph7.3）中杉金桥0.25�ta胰蛋白酶gibco二甲基亚砜（dmso）sigma
‑
aldrichmtspromegapi/rnasestainingbufferbdannexinv
‑
fitc/pi凋亡试剂盒碧云天无血清细胞冻存液新赛美 1.4.2 western blot实验相关试剂100
×
蛋白酶抑制剂bimake磷酸酶抑制剂rocheripa裂解液普利莱ddh2o天津百特生物技术有限公司1.5mol/ltris.hcl(ph8.8)solarbio1.0mol/ltris.hcl(ph=6.8)solarbio1mtris
‑
缓冲液（ph7.4）meilunbio30%丙烯酰胺solarbio过硫酸铵福晨化学四甲基乙二胺（temed）sigma
‑
aldrichglycinelifesciencetrislifescience
sds国药集团化学试剂有限公司tween
‑
20lifesciencebca蛋白浓度测定试剂盒thermoscientific5
×
sds蛋白上样缓冲液ncm胎牛血清白蛋白（bsa）solarbio蛋白印迹化学发光试剂盒新赛美pvdf膜millipore无水乙醇北京化学试剂公司westernblotmarker金普来抗体稀释液新赛美proteina/gmagneticbeadsmcedynabeadsmyonestreptavidint1invitrogen磁力架mcenp40普利莱tris
‑
hclph8.0meilunbio脱脂牛奶biosharp 1.4.3 免疫组织化学试剂10%福尔马林固定液solarbio二甲苯北京化学试剂公司无水乙醇北京化学试剂公司30%过氧化氢溶液国药集团化学试剂有限公司edta抗原修复液（ph=8.0）中杉金桥山羊血清中杉金桥通用型鼠兔二抗检测试剂盒中杉金桥免疫组化蛋白笔ciriscdab试剂盒中杉金桥苏木素中杉金桥伊红中杉金桥浓盐酸北京化学试剂公司氨水国药集团化学试剂有限公司中性树脂北京金诺利华科技有限公司盖玻片sailbrand阳离子载玻片中杉金桥1.4.4 免疫荧光实验相关试剂4%多聚甲醛solarbiotriton
‑
x
‑
100北京金诺利华科技有限公司dapi中杉金桥罗丹明标记山羊抗兔igg（h l）中杉金桥1.4.5 质粒转染相关试剂
lb液体培养基北京金诺利华科技有限公司氨苄青霉素meilunbio嘌呤霉素solarbiolipofectamine2000转染试剂thermoscientific无内毒素质粒大提试剂盒天根生化科技(北京)有限公司1.4.6 实验相关药物配制常山酮（hf）、生物素标记的peg
‑
常山酮（式iii的化合物，bio
‑
peg
‑
hf）用dmso配制成10 mm，分装于灭菌1.5 ml ep管中，存储于
‑
40℃备用。
[0070]
1.4.7 主要试剂配制（1）10%过硫酸铵(aps)：过硫酸铵1 g溶解于去离子水10 ml，分装于1.5 ml ep管中，
‑
20℃保存。
[0071]
（2）1
×
pbs缓冲液：1包pbs粉末溶解于去离子水，定容至2000 ml，室温保存。
[0072]
（3）1
×
pbst缓冲液：在1
×
pbs溶液中加入0.1% tween
‑
20，充分搅拌混匀后，室温保存。
[0073]
（4）10
×
电泳缓冲液：将tris 30.3 g、glycine 144 g及sds 10 g溶解于去离子水，定容至1000 ml，室温保存。
[0074]
（5）1
×
电泳缓冲液：取10
×
电泳缓冲液100 ml，加入去离子水900 ml，配制成1
×
电泳缓冲液，室温保存。
[0075]
（6）10
×
电转缓冲液：将tris 30.3 g、glycine 144 g溶解于去离子水，定容至1000 ml，室温保存。
[0076]
（7）1
×
电转缓冲液：取10
×
电转缓冲液100 ml、甲醇溶液200 ml，加入去离子水700 ml，配制成1
×
电转缓冲液，室温保存。
[0077]
（8）bsa/脱脂牛奶封闭液（含5% bsa/脱脂牛奶的1
×
pbst缓冲液）：称量bsa粉末5 g，溶解于100 ml 1
×
pbst缓冲液中，4℃保存，用量以盖过膜面即可，可重复利用多次。
[0078]
（9）10
×
磷酸酶抑制剂：取一片磷酸酶抑制剂放入1.5 ml高压灭菌ep管中，加1 ml灭菌去离子水，反复震荡至溶解，分装后冻存于
‑
20℃备用。
[0079]
（10）蛋白裂解工作液：取10 ml ripa裂解液，加入100 μl蛋白酶抑制剂及1片磷酸酶抑制剂，混匀后4℃保存备用。
[0080]
（11）dab工作液：dab染色前，按照dab试剂盒的说明，按a液 : b液= 40 : 1的比例配制所需用量，混匀后避光备用，现用现配。
[0081]
（12）1%盐酸酒精：取1 ml浓盐酸加入99 ml 75%乙醇配制成1%盐酸酒精，室温保存。
[0082]
（13）1%氨水：取1 ml氨水加入99 ml去离子水配制成1%氨水溶液，室温保存。
[0083]
（14）5
×
nt2：取tris
‑
hcl（ph7.4）12.5 ml nacl（5 m）7.5 ml mgcl2（2 m）125 μl np
‑
40 125 μl，加入去离子水至50 ml，配制成5
×
nt2溶液，4℃保存。
[0084]
1.5 实验药物常山酮（hf）购自selleck chemicals。生物素化的peg
‑
常山酮（bio
ꢀ‑
peg
‑
hf）为实施例1制备的式iii化合物。食管癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。
[0085]
2 实验方法
2.1 细胞培养2.1.1 细胞复苏提前预热水浴锅至37℃，取出冻存于液氮中的细胞，立即放入水浴锅中，快速摇动冻存管，使其尽快融化。待融化后780 rpm，5 min离心，弃去上清，加入1 ml培养基吹打混匀，转移至10 cm细胞培养皿中，加入适量培养基，置于37℃、5%co2孵箱中培养。24 h后可根据情况用新鲜完全培养液替换旧培养液，继续置于细胞培养箱中培养。
[0086]
2.1.2 贴壁细胞换液应根据每种细胞的倍增时间及培养皿中细胞的密度，及时的给细胞更换新鲜的完全培养基，维持细胞的生命活动。提前将rpmi
‑
1640完全培养基于37℃恒温水浴锅中预热或置于室温使其温度恢复到室温。吸弃培养皿或孔板中的旧培养基，用pbs轻轻清洗1~2次，加入新鲜完全培养基，重新置于细胞培养箱中继续培养。
[0087]
2.1.3 细胞传代当细胞生长密度达80%
‑
90%时进行传代。弃去旧培养基，加入1
‑
2 ml胰酶，置于37℃孵箱中消化2
‑
3 min。消化期间于显微镜下观察，待细胞皱缩呈圆形，细胞间隙增大，部分细胞脱离皿底时，加入含有血清的完全培养基2 ml终止消化，并轻轻吹打使细胞脱离皿底使其成为单细胞悬液。将细胞悬液转移至15 ml离心管，780 rpm离心3 min后弃去上清，加入含血清的完全培养基，轻轻吹打重悬细胞，按1:2
‑
1:4分入新培养皿中，再加入培养基至8 ml，上下左右混匀使细胞均匀铺于培养皿中，置于37℃、5%co2孵箱中培养。
[0088]
2.1.4 细胞冻存冻存前观察细胞状态，尽量取对数生长期的细胞进行冻存。弃去旧培养液以适量胰蛋白酶消化细胞后，加入完全培养基反复轻轻吹打，780 rpm离心3 min后弃去上清后，加入适量细胞冻存液重悬细胞。于每只冻存管内分别加入上述细胞悬液约1 ml，在冻存管上标明冻存的细胞株名称、冻存时间和冻存人。做好标记放入细胞冻存盒中， 于
‑
80℃冰箱过夜后即可移入液氮罐长期保存。
[0089]
2.2 mts法检测细胞活性（1）细胞铺板：按常规方法将处于对数生长期的细胞消化收集并计数，将细胞稀释至5000个/孔接种于96孔板，每孔共100 μl细胞悬液，预设空白对照孔（仅加培养基，不加细胞）和对照孔（细胞悬液中仅加培养基，不加药物），轻轻混匀，边缘孔以pbs填充，置于37
°
c、5% co2孵箱中培养。
[0090]
（2）药物处理：细胞贴壁后弃去旧培养基，用培养基稀释药物浓度，依次加入含有相应浓度药物的培养基，每个药物浓度设5个复孔，置于孵箱中培养24
‑
72 h。
[0091]
（3）测量前根据孔数按mts:培养基=1:9的比例配好工作液，弃去旧培养基，每孔加入100 μl工作液，轻轻混匀后置于孵箱中孵育1 h，分光光度仪读取490 nm光密度（od）值。加mts的过程中注意避光，注意孔内不要有气泡。
[0092]
（4）根据吸光度值计算药物浓度对应的抑制率：细胞增殖抑制率（fa）= [1
‑ꢀ
(a
实验组
‑
a
空白组
)/(a
对照组
‑
a
空白组
)]
ꢀ×
100%。
[0093]
（5）graphpad prism 7.0软件绘制细胞活力曲线。
[0094]
2.3 免疫荧光实验（1）铺板：在35 mm的玻底培养皿中加入2 ml培养液，于培养箱中放置15 min预培
养后，将对数期细胞30万接种于玻底培养皿上，过夜孵育。
[0095]
（2）加药处理：细胞中加入生物素和bio
‑
peg
‑
hf（2.5μm）处理，培养箱中孵育24 h。
[0096]
（3）固定：24 h后吸弃培养皿中培养基，1
×
pbs洗涤1次后，加入4%多聚甲醇固定15 min，1
×
pbs洗涤3次，每次5 min。
[0097]
（4）打孔：0.5% triton
‑
x
‑
100（pbs稀释）室温打孔15 min，1
×
pbs洗3次，每次5 min。
[0098]
（5）封闭：山羊血清工作液封闭30 min。
[0099]
（6）一抗：加入一抗（pbs稀释，mlkl 1:200），放入湿盒中，4℃孵育过夜。
[0100]
（7）二抗：孵育结束后，1
×
pbs洗涤3次，每次5 min，避光配制并加入罗丹明标记的二抗（pbs稀释，1:100），避光孵育1小时。注意：配制完后离心一下，底部部分弃掉。从加入荧光标记二抗开始，此后所有的实验均避光进行。
[0101]
（8）dapi 染色：1
×
pbs洗涤3次，每次5 min。dapi染核（pbs稀释，1:10000）5 min，1
×
pbs洗涤3次。
[0102]
（9）采用激光共聚焦显微镜进一步观测并记录试验结果。
[0103]
2.4 细胞系的瞬时转染（1）接种细胞使其汇合度约为70%，放入细胞培养箱中孵育过夜。
[0104]
（2）制备lipo2000
‑
sirna混合液：
①
lipo2000 opti
‑
mem /孔，1.5 ml ep管中轻柔混匀，室温孵育5 min
②
sirna opti
‑
mem /孔，1.5 ml ep管中轻柔混匀，室温孵育5 min
①

②
缓慢轻柔混匀，室温孵育20 min。
[0105]
（3）待细胞贴壁后，弃掉旧培养基，加入完全培养基，再轻柔将lipo2000
‑
sirna混合液加入细胞中，放入培养箱培养48 h。6
‑
8 h后更换完全培养基。
[0106]
表1 lipo2000转染规模培养容器培养基体积opti
‑
memsirnalipo2000质粒lipo200096孔100μl2
×
25μl0.5μl0.5μl0.1μg0.25μl12孔1ml2
×
100μl5μl5μl0.8μg2μl6孔2ml2
×
250μl10μl10μl2μg5μl60mm5ml2
×
0.5ml25μl25μl4μg10μl10cm15ml2
×
1.5ml50μl50μl10μg25μl2.5 western blot实验2.5.1 细胞总蛋白提取（1）按常规方法消化收集细胞于1.5 ml ep管中，用pbs洗涤一次，780 rpm，5 min离心，弃上清。
[0107]
（2）加入适量的含有1
×
蛋白酶抑制剂及1
×
磷酸酶抑制剂的ripa裂解液，充分震荡，置于冰上，每5 min震荡一次，共震荡2次。同时打开低温高速离心机，将温度调整至4℃。
[0108]
（3）离心，12000 g，15 min，4℃，取上清至新的1.5 ml ep管中，即为细胞总蛋白，冰上放置。待测量浓度后，加入5
×
loading buffer，混匀，100℃金属浴中煮10 min，
‑
20℃冰箱中保存备用。
[0109]
2.5.2 bca法测定蛋白浓度
（1）取一干净96孔板，除了第一个孔，在余下第一列的7个孔中分别加入25 μl pbs，于第一孔中加入25 μl浓度为2 mg/ml的bsa，第二孔加入25 μl浓度为2 mg/ml的bsa与pbs混匀后从中取25 μl加入第三孔，以此倍比稀释，得到浓度分别为2000，1000，500，250，125，62.5，31.25 μg/ml及0的bsa 标准液（最后一孔为阴性对照，不加入bsa）。样品孔的样品一般可以稀释10倍测定，即取2.5 μl细胞裂解液 22.5 μl pbs。
[0110]
（2）配制工作液（cu reagent:bca reagent=50:1）。取200 μl工作液分别加入至（1）中配制的标准品和待测蛋白孔中，置于37℃温箱中反应30 min后，酶标仪测定562 nm波长处的od值。
[0111]
（3）绘制标准曲线：x轴为bsa标准蛋白浓度（μg/ml)，y轴为各标准蛋白对应的od
570
值，拟合曲线并计算样品蛋白浓度。
[0112]
（4）以计算出的最低浓度的蛋白样品为标准，将其它蛋白样品用裂解液调整至该浓度，后加入5
×
sds蛋白上样缓冲液至终浓度为1
×
，100℃金属浴中煮沸10 min使蛋白变性，冻存于
‑
20℃冰箱备用。
[0113]
2.5.3 western blot蛋白印迹杂交（1）sds聚丙烯酰胺凝胶（sds
‑
page）电泳a. 将玻璃板用去污剂清洗干净，去离子水冲洗后晾干。将晾干的玻璃板垂直卡在架子上，注意卡紧。
[0114]
b. 配制相应浓度的sds
‑
page分离胶，检查两块玻璃板是否对合严密，小心将分离胶注入两块玻璃板的空隙中至距离矮玻璃板上缘约2
‑
3 cm，在其上层缓慢加入乙醇，以使液面平整并阻止空气对凝胶聚合的抑制作用。室温凝聚后弃去上层覆盖液体并用滤纸吸干残留液体。
[0115]
c. 配制5%的浓缩胶，轻轻注入分离胶上层，立即插入梳子并注意避免气泡的产生。室温放置至浓缩胶凝固。
[0116]
d. 在电泳槽中加入适量的1
×
电泳缓冲液，没过底下的铁丝。拔掉梳子，预先室温解冻待测蛋白样品，混匀吸取20 μg蛋白样品加入样品孔中，在样品旁留孔加入4 μl蛋白marker。
[0117]
e. 电泳：打开电源，开始将电压设为恒压90 v，当样品中的溴酚蓝进入分离胶后将电压调至140 v并继续电泳。当溴酚蓝移至分离胶下缘或使marker跑到想要的地方时停止电泳，并取出玻璃板。
[0118]
表2 分离胶的配制
注：所有成分体积单位均为ml表3 浓缩胶的配制注：所有成分体积单位均为ml（2）转膜a. 事先将pvdf膜在甲醇中浸泡几秒活化，轻轻取出凝胶，将凝胶、pvdf膜及海绵垫浸泡于1
×
转膜缓冲液中，按照“（正极）海绵垫
‑
滤纸
‑
pvdf膜
‑
凝胶
‑
滤纸
‑
海绵垫（负极）”的顺序装好，赶走膜与滤纸之间的气泡。
[0119]
b. 关上转移盒并放入转膜槽中，槽中注入1
×
转膜缓冲液并装入冰袋。将整个转膜装置放于冰浴中，连接好电极并打开电源，根据不同分子选择不同转膜时间，一般可选稳流350 ma转膜2 h。
[0120]
（3）封闭及抗原抗体反应a. 用镊子将pvdf膜取出，做好正反面标记后将膜浸入5%的牛奶（pbst配制）中轻轻摇动，室温封闭1 h。
[0121]
b. 封闭结束后取出pvdf膜，充分浸泡于用封闭液稀释的一抗中，于摇床上缓慢摇动，4℃孵育过夜。
[0122]
c. 回收一抗，于摇床上用pbst洗涤pvdf膜3次，每次15 min。
[0123]
d. 将pvdf膜浸泡于兔/鼠二抗中（pbst稀释，浓度为1:5000），于室温下轻轻摇动1 h，后用pbst洗涤3次，每次10 min。
[0124]
（4）显色a. 将a、b液等体积混合，配制适量的ecl发光液。
[0125]
b. 平头镊取膜，用吸水纸吸去膜上多余液体，膜蛋白面朝上，将发光液滴加至pvdf膜正面，使其均匀覆盖。
[0126]
c. 放入amersham imager 600成像仪中，根据实际情况选择程序自动发光。
[0127]
2.6 免疫沉淀（immunoprecipitation，ip）实验（1）取ip珠子（protein a/g magnetic beads、dynabeads myone streptavidin t1）40 μl加入1.5 ml ep管中，用nt
‑
2 buffer洗2次，用磁力架吸着吸去上清。加入100 μl nt
‑
2 buffer，加入2 μg抗体或按说明书比例加入，置于4℃转盘孵育1 h。
[0128]
（2）用常规方法消化洗涤收集细胞沉淀于1.5 ml ep管中，加入含有1
×
蛋白酶抑制剂及1
×
磷酸酶抑制剂的np
‑
40裂解液，充分震荡，置于冰上，每10 min震荡一次，共震荡30 min。同时打开低温高速离心机，将温度调整至4℃。
[0129]
（3）离心，12000 g，10 min，4℃，取上清至新的1.5 ml ep管中。
[0130]
（4）取上清10 μl 40 μl np
‑
40裂解液 12.5 μl loading buffer（input），100℃金属浴煮10 min，保存于
‑
20℃。
[0131]
（5）将（1）中ep管取出，用磁力架吸着吸去上清，用nt
‑
2 buffer洗3次留下磁珠，加入蛋白裂解液，加nt
‑
2 buffer补至250 μl，4℃转盘上孵育过夜。
[0132]
（6）用nt
‑
2 buffer洗5次留下磁珠，加入30 μl np
‑
40裂解液 7.5 μl loading buffer，100℃金属浴煮10 min，保存于
‑
20℃。
[0133]
2.7 体内实验2.7.1 食管鳞癌pdx小鼠模型建立（1）选取6~8周龄的nsg小鼠，温度（22
±
1）℃、湿度（50%
±
1%）、白昼12h/黑夜12h，条件下养殖。
[0134]
（2）腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）麻醉小鼠，将手术收集的新鲜肿瘤组织切成3~5mm3体积，植入小鼠侧腹部皮下。
[0135]
（3）当肿瘤组织长至150 mm3大小时下述方法给药，2次/周观测肿瘤及体重变化，4周后牺牲动物。
[0136]
2.7.2 食管癌移植瘤模型建立（1）根据实验分组，计算所需细胞数，提前订购足够数量的6
‑
8周龄的雌性裸鼠。
[0137]
（2）注射当天，胰酶消化收集细胞，重悬于一定量的10% matrix胶pbs中使其终浓度达5
×
107/ml。
[0138]
（3）用1 ml无菌注射器吸取100 μl吹打均匀的细胞悬液，注射到已用酒精棉球消毒的裸鼠右腋下，注射完毕迅速拔出针头。注射过程中，不断晃动或吹打细胞悬液，确保细胞不黏连。
[0139]
（4）细胞注射约1周后，小鼠背部可见白色略硬团块。注意观察，用游标卡尺测量肿瘤长径（l）和短径（w），按公式v=(w2×
l)/2计算肿瘤体积，达100
‑
150 mm3左右时，根据肿瘤大小排序，随机将小鼠分成4组，包括空白对照组、生物素 peg对照组、hf用药组、bio
‑
peg
‑
hf用药组，每组6只小鼠，并剪脚趾进行编号。
[0140]
2.7.3 移植瘤体内给药
（1）分组当天开始用药，小鼠给药方案设计如下。
[0141]
表4 移植瘤模型小鼠给药方案（2）用药后每周2次用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短径及小鼠体重，根据测量的结果计算出肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
[0142]
（3）用药结束、动物濒临死亡或肿瘤体积超过2000 mm3时，眼球取血后静置10min，1000r/min离心10min。取血清置于冰上，送北京兰博泰斯生物科技有限公司检测小鼠肝肾功能及生化指标。
[0143]
（4）将荷瘤小鼠麻醉后脱颈处死，剥离肿瘤并拍摄离体瘤块照片后，切取肿瘤及心脏、肝、肾组织，用10%福尔马林固定过夜后包埋蜡块。剩余组织冻存于
‑
80℃冰箱备用。
[0144]
2.8 免疫组织化学实验2.8.1 免疫组化操作步骤（1）切片及烤片：石蜡包埋小鼠组织4 μm连续切片，将恒温干燥箱调至65
°
c，切片架放入干燥箱，烘烤1h。
[0145]
（2）切片脱蜡水化：将烤片放入二甲苯i中脱蜡10 min，二甲苯ii脱蜡10 min。然后依次将片子放入100%乙醇5 min
→
95%乙醇5 min
→
85%乙醇5 min
→
75%乙醇5 min
→
去离子水5 min
×
3次。
[0146]
（3）内源性过氧化物酶清除：将切片放入3% h2o2中，室温下摇床孵育10 min，pbs清洗5 min
×
3次。
[0147]
（4）抗原热修复：将切片放入盛有1
×
edta抗原修复液的锅中，高温煮沸后，将电磁炉调至800 w，高压修复10 min，快速冷却至室温。取出切片，pbs摇床清洗5 min
×
3次。
[0148]
（5）抗原封闭：擦干切片上残余水分，用免疫组化笔沿组织外侧画圈，滴加山羊血清工作液覆盖于组织上，室温封闭1 h。
[0149]
（6）滴加一抗：封闭结束后甩去切片上残留封闭液，将一抗滴于组织上。切片置于湿盒中，4℃孵育过夜。一抗稀释浓度分别为：ki
‑
67 (1:200)、整合素β4 (1:100)。
[0150]
（7）滴加二抗：取出湿盒置于室温下复温20 min，pbs清洗5 min
×
3次。滴加hrp标记的兔/鼠通用型二抗工作液，室温孵育1 h。
[0151]
（8）dab显色：切片用pbs清洗5 min
×
3次，吸水纸擦净残留液体。取现配制的dab工作液滴加到切片上，显微镜下观察显色强度或肉眼可见变色时，去离子水终止，并去离子水清洗5 min
×
3次。
[0152]
（9）复染及返蓝：苏木素复染2 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化（几秒），1%氨水返蓝（几秒）。
[0153]
（10）脱水封片：将片子依次置入75%乙醇1 min
→
85%乙醇1 min
→
95%乙醇1 min
→
100%乙醇1 min
→
二甲苯i 1 min
→
二甲苯ii 1 min，通风橱中风干后滴加中性树胶，盖玻片封片保存。
[0154]
2.8.2免疫组化结果判定标准组织切片染色结果由病理科两位医生在未知该研究背景下，根据如下标准独立进行阳性判断：根据样本的阳性肿瘤细胞的百分比，可评分为0
‑
4分，其中，0分代表<5%的区域是阳性显色，1分代表5
‑
25%的区域是阳性显色，2分代表26
‑
50%的区域是阳性显色，3分代表51
‑
75%的区域是阳性显色，4分代表> 75%的区域是阳性显色。而依据样本染色的强弱程度，也可评分为0
‑
3分，其中，0分代表阴性，1分代表弱阳性，2分代表中阳性，3分代表强阳性。以两者得分的乘积为最后评分（h
‑
score）。两位医生意见不一致时，则请第三方阅片，最终决定结果。
[0155]
3 统计方法实验结果以平均值
±
sd表示，采用spss 21.0软件进行统计分析。体外实验中，组间差异分析使用非配对t检验或单因素方差分析。体内实验中，组间肿瘤生长差异使用重复测量的方差分析。临床病理学特征间的关系采用χ2检验。所有的统计分析采用双侧检验，p<0.05被认为差异具有统计学意义。
[0156] 实施例2 式iii化合物治疗食管鳞癌根据上述实验方法2.2分别使用生物素、生物素标记的peg
‑
常山酮（bio
‑
peg
‑
hf），设置浓度梯度0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10μm，分别处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系72小时后，mts检测细胞活力。实验结果（图3a）显示生物素标记的peg
‑
常山酮在体外实验中对食管鳞癌细胞系有显著的杀伤作用，半数杀伤浓度（ic 50）分别为：kyse30 生物素标记的peg
‑
常山酮 6.67μm；kyse450 生物素标记的peg
‑
常山酮 5.50μm。
[0157]
根据上述实验方法2.7.2，建立移植瘤小鼠模型，并在构建成功后将小鼠随机分为4组。空白对照组：生理盐水；溶剂对照组：生物素（1mg/kg） peg（1mg/kg）；常山酮组：常山酮（1mg/kg）；生物素标记的peg
‑
常山酮组（以下也简称为peg
‑
常山酮组）：bio
‑
peg
‑
常山酮（1mg/kg）。按此给药方案每日一次，灌胃给药，每次100μl。根据上述实验方法2.7.3，进行肿瘤生长检测。
[0158]
实验结果（图3b）显示，在给药17天后，常山酮与peg
‑
常山酮组小鼠肿瘤体积显著缩小，平均体积大小分别为255.7mm3与211.3mm3，与空白对照组（平均大小637.1mm3）和溶剂对照组（平均592.0mm3大小）存在显著差异（图3d）。
[0159]
肿瘤重量方面，给药17天后，空白对照组、溶剂对照组、常山酮组、peg
‑
常山酮组肿瘤平均重量分别为0.664g、0.657g、0.224g、0.186g。常山酮及peg
‑
常山酮给药组肿瘤重量显著低于空白对照组和溶剂对照组（图3c）。
[0160]
随后，我们将剥离的小鼠肿瘤按上述实验方法2.8进行免疫组化染色分析。实验结果（图3e）显示，4组小鼠移植瘤中ki67的免疫组化染色h
‑
score平均评分分别为空白对照组14.4分，溶剂对照组15.2分，常山酮组9分，peg
‑
常山酮组8分。常山酮及peg
‑
常山酮给组小鼠移植瘤中ki67的免疫组化染色显著低于空白对照组和溶剂对照组。提示其肿瘤增殖能力显著降低。
[0161]
以上实验结果证实了常山酮及peg
‑
常山酮组在小鼠体内具有显著的抗肿瘤作用。
其中peg
‑
常山酮组抗肿瘤效果优于常山酮给药组。
[0162] 实施例3 抑癌机理图4a至图4e示出了式iii化合物治疗食管鳞癌的潜在机理。
[0163]
使用生物素标记的peg
‑
常山酮（5μm）处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系24小时后，根据上述实验方法2.6进行免疫共沉淀（ip）实验。图4a展示的结果显示，生物素标记的peg
‑
常山酮与整合素β4亚基可以形成免疫共沉淀，存在相互作用。且在使用生物素标记的peg
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常山酮处理后，整合素β4亚基表达量减少，提示生物素标记的peg
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常山酮对其存在降解作用。
[0164]
使用生物素标记的peg
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常山酮（5μm）处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系24小时后，根据上述实验方法2.3进行荧光共聚焦（confocal）实验。如图4b所示，生物素标记的peg
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常山酮与整合素β4亚基存在共定位。且在使用生物素标记的peg
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常山酮处理后，整合素β4亚基的细胞膜定位减少，提示生物素标记的peg
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常山酮与整合素β4亚基存在相互作用且对其存在降解作用。
[0165]
根据上述实验方法2.4，在kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系中敲除itg b4基因，提取细胞蛋白验证整合素β4亚基敲除成功后，细胞实验中使用药物的半数杀伤浓度（ic 50）：生物素标记的peg
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常山酮（5μm）处理各组细胞。72小时后根据上述实验方法2.2检测各组细胞活力。实验结果（图4c）显示在敲除整合素β4亚基后生物素标记的peg
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常山酮对细胞的杀伤作用显著减弱，可能造成了脱靶效应，证实了整合素β4亚基是生物素标记的peg
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常山酮潜在作用靶点。
[0166]
使用生物素标记的peg
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常山酮（5μm）处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞。在第0、6、12、24小时分别收集细胞蛋白进行western blot实验检测整合素β4亚基表达水平。实验结果（图4d）显示生物素标记的peg
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常山酮可使整合素β4亚基的蛋白表达水平降低，降解增加。
[0167]
将实施例2动物体内实验中剥离的小鼠肿瘤按上述实验方法2.8进行免疫组化染色分析。如图4e所示，实验结果显示，4组小鼠移植瘤中整合素β4亚基的免疫组化染色h
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score平均评分分别为空白对照组7.25分，溶剂对照组8分，常山酮组3.83分，生物素标记的peg
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常山酮组3.5分。常山酮及生物素标记的peg
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常山酮组小鼠移植瘤中整合素β4亚基的免疫组化染色显著低于对照组。提示常山酮及生物素标记的peg
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常山酮可以使肿瘤内整合素β4亚基表达减少。
[0168]
以上实验结果证实了生物素标记的peg
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常山酮与整合素β4亚基存在直接相互作用，且生物素标记的peg
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常山酮可以降解整合素β4亚基，使其表达减少，从而达到抑制肿瘤发生发展的作用。
[0169] 实施例4 相较于常山酮，生物素标记的peg
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常山酮可显著降低毒性图5a至图5e示出了生物素标记的peg
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常山酮相较于常山酮可显著降低体内毒性。将小鼠分为8组，每组6只，按上述实验方法中表4进行分组给药。用药后每周2次测量小鼠体重，根据测量的结果绘制体重曲线。如图5a所示，实验结果显示常山酮的3个剂量组小鼠在给药17天后体重均显著低于对照组，而生物素标记的peg
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常山酮组小鼠低剂量（0.25、0.5mg/kg）组小鼠体重与对照组相比无显著差异，高剂量（1mg/kg）组小鼠虽发生体重降低但也均高于常山酮组小鼠。
[0170]
给药17天后，对小鼠施行眼球取血，静置10min，1000r/min离心10min。取血清置于冰上，送北京兰博泰斯生物科技有限公司检测小鼠肝肾功能及生化指标。图5b展示的血清生化值提示与常山酮组相比，生物素标记的peg
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常山酮组总蛋白下降显著减少，1mg/kg用药组小鼠，生物素标记的peg
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常山酮组比常山酮组白蛋白下降减少。
[0171]
血清中肌酐及尿素的水平反应小鼠肾功能的损伤情况，常山酮组小鼠血清中肌酐及尿素相较于对照组显著升高（图5c），提示发生肾功能损伤，药物具有肾毒性。而生物素标记的peg
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常山酮组小鼠肌酐及尿素水平相较于对照组升高不显著，相同浓度组相较于常山酮组均处于较低水平，提示生物素标记的peg
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常山酮药物肾毒性低于常山酮。
[0172]
血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、直接胆红素及γ
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谷氨酰转移酶的水平反应小鼠肝功能的损伤情况，如图5d所示，常山酮组小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、直接胆红素及γ
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谷氨酰转移酶相较于对照组均显著升高，提示发生肝功能损伤，药物具有肝毒性。而生物素标记的peg
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常山酮组小鼠谷草转氨酶、谷丙转氨酶、直接胆红素及γ
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谷氨酰转移酶水平相较于对照组也有小幅升高，但同相同浓度组常山酮组比较均处于较低水平，提示生物素标记的peg
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常山酮药物肝毒性低于常山酮。
[0173]
处死动物后，取给药小鼠肝肾组织进行he染色后，进行形态学观察。实验结果（图5e）显示常山酮及生物素标记的peg
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常山酮均未对小鼠肝肾组织形态造成破坏。
[0174]
以上实验结果显示相较于常山酮，生物素标记的peg
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常山酮体内肝肾毒性显著降低，具有更好的安全性。
[0175]
实施例5通过检索数据库，我们发现在除了食管鳞癌以外的多种癌种（如：肾透明细胞癌、胶质瘤、肺腺癌、肺癌、头颈鳞癌、卵巢癌等）中，整合素β4的高表达都预示着不良的预后（图6a）。发明人预期生物素标记的peg
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常山酮的抗肿瘤作用可扩展到多种癌种中。
[0176]
使用生物素标记的peg
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常山酮，设置浓度梯度0.25、0.5、1、2.5、5μm，分别与2.5、5、10、20μm浓度顺铂联用，处理kyse30、kyse450食管鳞癌细胞系72小时后，根据上述实验方法2.2 mts检测细胞活力。
[0177]
图6b
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图6c示出了联合用药实验的结果。联合用药实验提示生物素标记的peg
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常山酮与顺铂有协同作用（ci 值在 0.8 和 0.9 之间提示两个药物间是低度协同作用，ci 值在 0.6 和 0.8 之间提示两个药物间是中度协同作用，ci 值在 0.4 和 0.6 之间提示两个药物间是高度协同作用，ci 值在 0.2 和 0.4 之间提示两个药物间是强协同作用。）提示生物素标记的peg
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常山酮可以增敏顺铂。2.5~5μm浓度生物素标记的peg
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常山酮与2.5~5μm浓度顺铂联用，显示出了最好的协同效果。
[0178]
本技术描述了多个实施例，但是该描述是示例性的，而不是限制性的，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在本技术所描述的实施例包含的范围内可以有更多的实施例和实现方案。尽管在附图中示出了许多可能的特征组合，并在具体实施方式中进行了讨论，但是所公开的特征的许多其它组合方式也是可能的。除非特意加以限制的情况以外，任何实施例的任何特征可以与任何其它实施例中的任何其他特征结合使用，或可以替代任何其它实施例中的任何其他特征或要素。