丁烯内酯衍生物及其应用以及一种药物组合物的制作方法

1.本发明涉及药物技术领域，特别涉及丁烯内酯衍生物及其应用以及一种药物组合物。


背景技术：

2.近几年，一种新型冠状病毒引起的疾病
‑
新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid
‑
19)，简称“新冠肺炎”，开始在全球流行。新冠肺炎患者有发热、干咳、呼吸困难、肌痛、疲劳等症状，甚至会出现重症急性呼吸综合征。新冠肺炎传播性强，死亡率高，因而引发了全球关注。2020年1月12日，世界卫生组织(who)将该新型冠状病毒命名为2019新型冠状病毒(2019
‑
ncov)，随后，国际病毒分类学委员会于2月11日将新型冠状病毒正式命名为sars
‑
cov
‑
2。
3.冠状病毒是单链rna病毒，有四种类型(α、β、δ和γ)。由于sars
‑
cov
‑
2与sars和mers冠状病毒的序列相似度分别为79％和50％，因此被鉴定为β冠状病毒株。sars
‑
cov
‑
2感染宿主细胞后，其rna翻译表达出多聚蛋白前体，进一步被主蛋白酶(main protease,m
pro
)和木瓜样蛋白酶切割为多个非结构蛋白，这些非结构蛋白是冠状病毒重要的功能蛋白。m
pro
切割位点的特异性与微小rna病毒的3c蛋白酶很相似，因此m
pro
也被称为3c样蛋白酶(3cl
pro
)。m
pro
在β冠状病毒中高度保守，是冠状病毒复制的关键酶，在病毒将多肽加工成功能蛋白的过程中起着主导作用，而且人体内没有同源蛋白，因此，m
pro
被认为是一个理想的研发抗病毒药物的作用靶点，m
pro
抑制剂具有一定程度的广谱抗病毒能力。目前，已经证明以sars
‑
cov
‑
2m
pro
为作用靶点的新药研发策略是有效可行的。研究发现一些小分子(例如：依布硒、卡莫氟、伊维菌素)和天然产物(例如：紫草素、高三尖杉酯碱、吐根碱、千金藤素)对m
pro
具有良好的抑制作用，被证明是有潜力的抗sars
‑
cov
‑
2候选药物。天然产物具有结构多样性的特点，其在防治新冠肺炎方面也具有重要作用。
4.此外，通过产生细胞因子和趋化因子产生强烈的炎症反应，是新冠肺炎的一个特点，这也成为致命性肺炎的主要原因。因此，同时具有抗病毒和抗炎作用的药物在治疗新冠肺炎方面具有独特的优势。研究表明，许多中药不仅能抑制病毒的复制，还能缓解病毒引起的过度炎症反应。例如：由13种中草药组成的中医方剂连花清瘟，同时具有抗病毒和抗炎作用，被列入中华人民共和国国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》，并在新冠肺炎的临床治疗中发挥了积极作用。另外，最新的研究表明：用于治疗流感的传统中成药六神胶囊，显示出抗新冠病毒的活性，同时还具有抗炎作用。然而，这些中成药的成分复杂，其中的有效成分及作用机制仍不清楚。因此，从天然产物中寻找具有抗病毒和抗炎作用的靶向抑制剂，成为研发治疗新冠肺炎药物的有效的途径之一。
5.迄今，现有技术中并没有丁烯内酯衍生物作为有效成分的药物组合物的报道，也没有丁烯内酯衍生物抗病毒或抗炎作用的报道。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一类丁烯内酯衍生物及其应用以及一种药物组合物。本发明提供的丁烯内酯衍生物同时具有抗病毒和抗炎作用，能够用于制备抗病毒药物和抗炎药物，尤其是在治疗新冠肺炎的药物方面具有广阔的应用前景。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.丁烯内酯衍生物，具有式1～式12任意一项所示的结构：
[0009][0010][0011]
本发明提供了上述方案所述的丁烯内酯衍生物在制备抗病毒药物中的应用。
[0012]
优选的，所述抗病毒药物为抗新冠病毒肺炎的药物。
[0013]
本发明提供了上述方案所述的丁烯内酯衍生物在制备抗炎药物中的应用。
[0014]
优选的，所述抗炎药物用于治疗由炎症因子介导的疾病；所述炎症因子包括tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6和il
‑
8中的一种或几种。
[0015]
优选的，所述炎症因子介导的疾病包括痛风、ii型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病或肿瘤。
[0016]
本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的上述方案所述的丁烯内酯衍生物和药学上可接受的载体。
[0017]
本发明提供了一种丁烯内酯衍生物，具有式1～式12任意一项所示的结构。本发明提供的丁烯内酯衍生物同时具有抗病毒和抗炎作用，能够用于制备抗病毒药物和抗炎药物，尤其是在治疗新冠肺炎的药物方面具有广阔的应用前景。实施例结果表明，本发明提供
的丁烯内酯衍生物对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
具有抑制活性，说明其具有抗新冠病毒的作用，且本发明提供的丁烯内酯衍生物能够抑制nlrp3炎症小体的激活，从而阻断巨噬细胞焦亡，说明其具有抗炎作用。
附图说明
[0018]
图1为在10μm条件下，化合物1～12对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性；
[0019]
图2为化合物9在不同浓度下对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性；
[0020]
图3为化合物10在不同浓度下对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性；
[0021]
图4为化合物12在不同浓度下对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性；
[0022]
图5为在10μm条件下，化合物1～12的ldh释放率；
[0023]
图6为nlrp3炎症小体激活后，化合物10处理j774a.1细胞后的western blot分析和灰度分析(采用anti
‑
mouse
‑
caspase
‑
1)；
[0024]
图7为nlrp3炎症小体激活后，化合物10处理j774a.1细胞后的western blot分析和灰度分析(采用anti
‑
mouse
‑
il
‑
1β)；
[0025]
图8为化合物10处理j774a.1细胞后的焦亡细胞计数结果；
[0026]
图9为化合物10抑制j774a.1巨噬细胞焦亡的细胞染色图。
具体实施方式
[0027]
本发明提供了一种丁烯内酯衍生物，具有式1～式12任意一项所示的结构：
[0028]
[0029][0030]
在本发明中，所述丁烯内酯衍生物是从黄枝孢菌(cladosporium fulvum)的发酵物中提取得到，本发明对所述cladosporium fulvum的来源没有特殊限定，采用本市售的cladosporium fulvum或采用本领域技术人员熟知的方法从植物中进行提取均可，在本发明的具体实施例中，所述cladosporium fulvum从atcc购买得到，编号为44962。
[0031]
在本发明中，发酵物优选通过以下步骤得到：
[0032]
将菌株cladosporium fulvum接种于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基中，于30℃下培养3天，之后将培养基的ph值调节至6.5，然后进行灭菌，得到接种培养基；
[0033]
将所述接种培养基在200rpm，28℃的条件下培养4天，得到种子培养物；
[0034]
将种子培养物接种于大米和灭菌水的混合物中，在28℃下发酵30天，得到发酵物。
[0035]
在本发明中，所述种子培养物和大米的用量比优选为10ml：80g；所述种子培养物和灭菌水的体积比优选为10:120；所述发酵优选在费氏烧瓶中进行。
[0036]
在本发明中，所述丁烯内酯衍生物的提取过程优选包括以下步骤：
[0037]
(1)使用甲醇对发酵物进行提取，得到甲醇提取物；
[0038]
(2)将所述甲醇提取物进行mci柱层析划段，采用甲醇/水进行梯度洗脱，得到5个馏分段，按照馏分的流出顺序，依次记为a段～e段；
[0039]
(3)将所述a段进行经凝胶柱纯化，采用甲醇进行洗脱，得到7个亚组分，按照组分的流出顺序，依次记为a1～a7；
[0040]
(4)将a4进行反向c18柱纯化，采用含有0.5wt％甲酸的甲醇/水进行梯度洗脱，得到9个组分，按照组分的流出顺序，依次记为a4
‑
1～a4
‑
9；
[0041]
(5)采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
3进行高效液相色谱分离，得到具有式4和式5所示结构的化合物；
[0042]
(6)采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
4进行高效液相色谱分离，得到具有式10所示结构的化合物和具有式3所示结构的化合物；
[0043]
(7)采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
5进行高效液相色谱分离，得到具有式6所示结构的化合物和具有式12所示结构的化合物；
[0044]
(8)采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
6经半制备高效液相色谱分离，得到具有式1所示结构的化合物、具有式7所示结构的化合物和具有式2所示结构的化合物；
[0045]
(9)采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
7进行高效液相色谱分离，得到具有式11所示结构的化合物和具有式9所示结构的化合物；
[0046]
(10)将a6进行lh
‑
20凝胶柱纯化，采用甲醇进行洗脱，得到具有式8所示结构的化合物；
[0047]
所述步骤(4)～(10)没有时间顺序的限定。
[0048]
本发明使用甲醇对发酵物进行提取，得到甲醇提取物。在本发明中，所述甲醇的体积分数优选为90％，所述提取的温度优选为室温，料液比优选为1g：1ml，所述提取的次数优
选为3次，每次提取的时间优选为3天。
[0049]
得到甲醇提取物后，本发明将所述甲醇提取物进行mci柱层析划段，采用甲醇/水进行梯度洗脱(记为第一梯度洗脱)，得到5个馏分段，按照馏分的流出顺序，依次记为a段～e段。在本发明中，所述第一梯度洗脱优选为6个梯度，各梯度洗脱剂中甲醇和水的体积比优选依次为5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0；所述第一梯度洗脱的洗脱剂流速优选为1ml/min；洗脱过程中，将洗脱馏分经薄层色谱分析，并将相同的组分合并。
[0050]
得到a段馏分后，本发明将所述a段进行经凝胶柱纯化，采用甲醇进行洗脱，得到7个亚组分，按照组分的流出顺序，依次记为a1～a7。本发明优选将洗脱的流出液中每50ml浓缩一次，并经薄层色谱分析，将相同组分合并。
[0051]
得到亚组分后，本发明将所述将a4进行反向c18柱纯化，采用含有0.5wt％甲酸的甲醇/水进行梯度洗脱(记为第二梯度洗脱)，得到9个组分，按照组分的流出顺序，依次记为a4
‑
1～a4
‑
9。在本发明中，所述第二梯度洗脱优选为6个梯度，各梯度洗脱剂中甲醇和水的体积比优选依次为5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0，且各个梯度的洗脱剂中均含有0.5wt％的甲酸；所述第二梯度洗脱的洗脱剂流速优选为1ml/min，洗脱过程中，将洗脱馏分经薄层色谱分析，并将相同的组分合并。
[0052]
得到组分a4
‑
1～a4
‑
9后，本发明采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
3进行高效液相色谱分离(记为第一hplc分离)，得到具有式4和式5所示结构的化合物。在本发明中，所述第一hplc分离用流动相中，乙腈、水和甲酸的体积比优选为8:12:0.1，流动相的流速优选为3ml/min；在本发明的具体实施例中，所述具有式4所示结构的化合物在5.9min时分离出，所述具有式5所示结构的化合物在第15.7min时分离出。
[0053]
本发明采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
4进行高效液相色谱分离(记为第二hplc分离)，得到具有式10所示结构的化合物和具有式3所示结构的化合物。在本发明中，所述第二hplc分离用流动相中，乙腈、水和甲酸的体积比优选为9:11:0.1，流动相的流速优选为3ml/min；在本发明的具体实施例中，所述具有式10所示结构的化合物在8.7min时分离出，所述具有式3所示结构的化合物在第9.3min时分离出。
[0054]
本发明采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
5进行高效液相色谱分离(记为第三hplc分离)，得到具有式6所示结构的化合物和具有式12所示结构的化合物。在本发明中，所述第二hplc分离用流动相中，乙腈、水和甲酸的体积比优选为10:10:0.1，流动相的流速优选为3ml/min；在本发明的具体实施例中，所述具有式6所示结构的化合物在9.1min时分离出，所述具有式12所示结构的化合物在第9.6min时分离出。
[0055]
本发明采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
6经半制备高效液相色谱分离，得到具有式1所示结构的化合物、具有式7所示结构的化合物和具有式2所示结构的化合物。在本发明中，所述半制备高效液相色谱分离用流动相中，乙腈、水和甲酸的体积比优选为11:9:0.1，流动相的流速优选为3ml/min；在本发明的具体实施例中，所述具有式1所示结构的化合物在12.6min时分离出，所述具有式7所示结构的化合物在第15.1min时分离出，所述具有式2所示结构的化合物在第16.2min时分离出。
[0056]
本发明采用乙腈/水/甲酸为流动相，将a4
‑
7进行高效液相色谱分离(记为第四hplc分离)，得到具有式11所示结构的化合物和具有式9所示结构的化合物。在本发明中，所述第四hplc分离用流动相中，乙腈、水和甲酸的体积比优选为14:6:0.1，流动相的流速优选
为3ml/min；在本发明的具体实施例中，所述具有式11所示结构的化合物在9.0min时分离出，所述具有式9所示结构的化合物在第12.2min时分离出。
[0057]
本发明将a6进行lh
‑
20凝胶柱纯化，采用甲醇进行洗脱，得到具有式8所示结构的化合物。本发明对所述lh
‑
20凝胶柱纯化的具体操作条件没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的条件即可。
[0058]
本发明还提供了上述方案所述的丁烯内酯衍生物在制备抗病毒药物中的应用，在本发明中，所述抗病毒药物优选为抗新冠病毒肺炎的药物；本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法，将所述丁烯内酯衍生物制备成各种剂型的药物即可。
[0059]
本发明还提供了上述方案所述的丁烯内酯衍生物在制备抗炎药物中的应用；在本发明中，所述抗炎药物用于治疗由炎症因子介导的疾病；所述炎症因子包括tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6和il
‑
8中的一种或几种；所述炎症因子介导的疾病包括痛风、ii型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病或肿瘤。本发明对所述应用的具体方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法，将所述丁烯内酯衍生物制备成各种剂型的药物即可。
[0060]
本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的上述方案所述的丁烯内酯衍生物和药学上可接受的载体；本发明对所述药学上可接受的载体没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的制药常用的载体即可。
[0061]
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0062]
实施例1
[0063]
1、仪器与材料
[0064]
旋转蒸发仪(日本东京理化n
‑
1300)；循环水式真空泵(巩义予华仪器shz
‑
d iii)；低温冷却液循环泵(巩义予华仪器dlsb
‑
5l)；核磁共振仪(德国布鲁克am
‑
400、aviii
‑
600)；旋光仪(美国鲁道夫rudolp autopol vi)；傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞世尔nicolet is10)；紫外分光光度计(日本岛津uv
‑
2401a)；高效液相色谱/质谱联用仪(美国安捷伦agilent 1100)；高效液相色谱仪(美国安捷伦agilent 1260，流速3ml/min)；zorbax sb
‑
c18色谱柱(9.4mm
×
250mm，5μm)；mci(日本东京三菱化学mitsubishi chemical,75～150μm)；rp
‑
18(德国默克，40～60μm)；sephadex lh
‑
20(瑞典通用电气健康护理生物科学股份公司ge healthcare bio
‑
sciencesab)；柱层析硅胶(青岛海洋200～300目)；薄层层析硅胶板(青岛海洋gf254)；柱层析用溶剂为重蒸的工业级溶剂。
[0065]
2、菌株发酵与丁烯内酯衍生物的提取分离，以下将具有式1～式12所示结构的化合物依次记为化合物1～化合物12。
[0066]
将菌株cladosporium fulvum接种于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基，于30℃培养3天。在500ml的锥形瓶中装入200ml pda培养基；将培养基的最终ph值调为6.5，并用高压灭菌锅灭菌。将100个接种培养基烧瓶在200rpm转速及28℃条件下，培养4天，以制备种子培养物。发酵在100个500ml的费氏烧瓶中进行，每个烧瓶含有80g大米和120ml灭菌h2o，冷却至室温后，向每个烧瓶接种10ml种子接种物，并在28℃下培养30天，得到发酵物。
[0067]
用90％的甲醇直接提取菌株的发酵物，室温条件浸提3次(料液比1:1)，每次3天，回收有机溶剂后，得到甲醇提取物97g。
[0068]
粗提物经mci柱层析划段，采用甲醇/水(5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0，v/v)梯度洗脱，流速1ml/min，经薄层色谱分析、合并，得到5个馏分段，依次记为a
‑
e。
[0069]
将a段(10g)进行凝胶柱纯化，以甲醇为洗脱剂，每50ml浓缩，经薄层色谱分析、合并，得到亚组分a1
‑
a7。
[0070]
a4经反向c18柱纯化，采用含有0.5％甲酸的甲醇/水(5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0，v/v)梯度洗脱，流速1ml/min，经薄层色谱分析、合并，得到a4
‑
1至a4
‑
9共九个组分。
[0071]
a4
‑
3(71mg)经高效液相色谱(hplc)分离，采用乙腈/水/甲酸(8:12:0.1,v/v/v)为流动相，流速3ml/min，得到化合物4(20mg,t
r
＝5.9min)和5(21mg,t
r
＝15.7min)。
[0072]
a4
‑
4(90mg)经hplc分离，采用乙腈/水/甲酸(9:11:0.1,v/v/v)为流动相，得到化合物10(9mg,t
r
＝8.7min)和3(9mg,t
r
＝9.3min)。
[0073]
a4
‑
5(33mg)经hplc分离，采用乙腈/水/甲酸(10:10:0.1,v/v/v)为流动相，得到化合物6(3mg,t
r
＝9.1min)和12(8mg,t
r
＝9.6min)。
[0074]
a4
‑
6(43mg)经半制备hplc分离，采用乙腈/水/甲酸(11:9:0.1,v/v/v)为流动相，得到化合物1(9mg,t
r
＝12.6min),7(3mg,t
r
＝15.1min)和2(10mg,t
r
＝16.2min)。
[0075]
a4
‑
7(130mg)经hplc分离，采用乙腈/水/甲酸(14:6:0.1,v/v/v)为流动相，得到化合物11(68mg,t
r
＝9.0min)和9(18mg,t
r
＝12.2min)。
[0076]
a6段经lh
‑
20凝胶柱纯化，采用甲醇洗脱，得到化合物8(37mg)。
[0077]
3、结果
[0078]
得到的丁烯内酯衍生物(化合物1
‑
12)的结构通过nmr,hrms,ir,uv数据进行确定。丁烯内酯衍生物(1
‑
12)的结构鉴定数据如下：
[0079]
表1化合物1
‑
4的1h nmr数据(δin ppm,j in hz)
[0080][0081]
注：检测频率400mhz，使用的溶剂为甲醇
‑
d4.
[0082]
表2化合物5
‑
8的1h nmr数据(δin ppm,j in hz)
[0083][0084]
注：
a
频率为400mhz，使用的溶剂为甲醇
‑
d4.
b
频率为600mhz，使用的溶剂为甲醇
‑
d4.
[0085]
表3化合物1
‑
8的
13
c nmr数据(δin ppm)
[0086]
[0087][0088]
注：
a
频率为100mhz，使用的溶剂为甲醇
‑
d4.
b
频率为150mhz使用的溶剂为甲醇
‑
d4.
[0089]
化合物1：黄色固体；[α]28.2 d 0.53(c 0.09,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)197(3.79),336(3.36),375(3.35)nm；ir(kbr)ν
max 3411,2977,2926,1718,1599,1503,1432,1280,1099cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表1和表3；hresims m/z465.1908[m h]

(calcd for c
27
h
29
o7,465.1908).
[0090]
化合物2：黄色固体；[α]28.3 d
‑
3.51(c 0.09,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)198(3.77),335(3.41)nm；ir(kbr)ν
max 3419,2977,2929,1722,1603,1496,1431,1265,1088cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表1和表3；hresims m/z 465.1913[m h]

(calcd for c
27
h
29
o7,465.1908).
[0091]
化合物3：黄色固体；[α]28.1 d
‑
8.07(c 0.09,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)201(3.71),325(3.30),374(3.18)nm；ir(kbr)ν
max 3425,2979,2932,1723,1605,1497,1267,1142,1100cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表1和表3；hresims m/z481.1862[m h]

(calcd for c
27
h
29
o8,481.1857).
[0092]
化合物4：黄色固体；[α]27.8 d 10.62(c 0.10,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)199(3.74),325(3.37),374(3.25)nm；ir(kbr)ν
max 3422,2977,2932,1721,1602,1503,1434,1280,1120cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表1和表3；hresims m/z499.1965[m h]

(calcd for c
27
h
31
o9,499.1963).
[0093]
化合物5：黄色固体；[α]27.9 d 14.94(c 0.05,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)240(3.33),335(3.36),374(3.30)nm；ir(kbr)ν
max 3400,2974,2930,1721,1601,1504,1431,1261,1087cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表2和表3；hresims m/z 505.1835[m na]

(calcd for c
27
h
30
o8na,505.1833).
[0094]
化合物6：黄色固体；[α]27.1 d 5.17(c 0.07,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)339(3.47)nm；ir(kbr)ν
max 3390,2971,2927,1720,1599,1506,1429,1271,1089cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表2和表3；hresims m/z489.1884[m na]

(calcd for c
27
h
30
o7na,489.1884).
[0095]
化合物7：黄色固体；[α]27.0 d
‑
57.20(c 0.05,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)331(3.27)nm；ir(kbr)ν
max 3400,2974,2926,2854,1713,1606,1491,1384,1246,1088,966cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表2和表3；hresims m/z 465.1909[m h]

(calcd for c
27
h
29
o7,465.1908).
[0096]
化合物8：黄色固体；[α]23.5 d
‑
19.52(c 0.05,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)214(3.55),241(3.37),324(3.43),380(3.18)nm；ir(kbr)ν
max 3407,2967,2924,2854,1687,
1547,1432,1254,1168,1097,984cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表2和表3；hresims m/z 381.1330[m h]

(calcd for c
22
h
21
o6,381.1333).
[0097]
化合物9：c
27
h
28
o6；黄色固体；
[0098]1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ7.51(s,1h,h
‑
2'),7.47(s,1h,h
‑
2”),7.45(d,j＝2.2hz,1h,h
‑
6”),6.76(d,j＝8.2hz,1h,h
‑
5”),6.28(s,1h,h
‑
5'),6.24(s,1h,h
‑
5),5.31(t,j＝7.3hz,1h,h
‑
8”),3.27(d,j＝7.2hz,2h,h
‑
7”),2.70(t,j＝6.7hz,2h,h
‑
7'),1.77(t,j＝6.7hz,2h,h
‑
8'),1.74(s,3h,h
‑
10”),1.72(s,3h,h
‑
11”),1.28(s,6h,h
‑
10'and 11')；
[0099]
13
c nmr(100mhz,methanol
‑
d4)δ171.5(s,c
‑
1),164.3(s,c
‑
3),157.4(s,c
‑
4”),155.9(s,c
‑
4'),153.5(s,c
‑
6'),141.7(s,c
‑
4),133.4(s,c
‑
9”),133.2(d,c
‑
2”),131.1(d,c
‑
2'),130.7(d,c
‑
6”),129.8(s,c
‑
3”),126.0(s,c
‑
1”),123.6(d,c
‑
8”),116.1(d,c
‑
5”),114.7(s,c
‑
3'),110.7(s,c
‑
1'),108.8(d,c
‑
5),104.9(d,c
‑
5'),99.6(s,c
‑
2),75.7(s,c
‑
9'),34.0(t,c
‑
8'),29.2(t,c
‑
7”),27.1(q,c
‑
10'and11'),26.0(q,c
‑
11”),22.7(t,c
‑
7'),17.9(q,c
‑
10”).
[0100]
化合物10：c
27
h
28
o8；黄色固体；
[0101]1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ7.68(s,1h,h
‑
2”),7.52(s,1h,h
‑
2'),7.46(d,j＝8.3hz,1h,h
‑
6”),6.74(d,j＝8.2hz,1h,h
‑
5”),6.29(s,1h,h
‑
5'),6.27(s,1h,h
‑
5),4.62(t,j＝8.7hz,1h,h
‑
8”),3.73(dd,j＝7.4,5.2hz,1h,h
‑
8'),3.19(d,j＝8.9hz,2h,h
‑
7”),2.95(dd,j＝16.2,5.2hz,1h,h
‑
7'α),2.66(dd,j＝16.2,7.4hz,1h,h
‑
7'β),1.31(s,3h,h
‑
10”),1.25(s,3h,h
‑
11”),1.24(s,3h,h
‑
11'),1.21(s,3h,h
‑
10')；
[0102]
13
c nmr(100mhz,methanol
‑
d4)δ172.2(s,c
‑
1),167.1(s,c
‑
3),161.9(s,c
‑
4”),154.6(s,c
‑
4'),154.4(s,c
‑
6'),142.8(s,c
‑
4),132.3(d,c
‑
6”),131.0(d,c
‑
2'),129.6(s,c
‑
3”),127.9(d,c
‑
2”),127.4(s,c
‑
1”),113.2(s,c
‑
3'),112.0(s,c
‑
1'),110.2(d,c
‑
5”),107.8(d,c
‑
5),105.0(d,c
‑
5'),98.6(s,c
‑
2),91.1(d,c
‑
8”),78.3(s,c
‑
9'),72.5(s,c
‑
9”),70.7(d,c
‑
8'),31.6(t,c
‑
7'),31.2(t,c
‑
7”),25.9(q,c
‑
10”),25.4(q,c
‑
11”),25.2(q,c
‑
10'),21.2(q,c
‑
11').
[0103]
化合物11：c
27
h
28
o6；黄色固体；
[0104]1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ7.50(s,1h,h
‑
2'),7.44(m,2h,h
‑
2”and 6”),6.74(d,j＝8.9hz,1h,h
‑
5”),6.39(s,1h,h
‑
5'),6.22(s,1h,h
‑
5),5.28(q,j＝7.3hz,2h,h
‑
8'and 8”),3.25(d,j＝6.7hz,2h,h
‑
7”),3.18(d,j＝7.4hz,2h,h
‑
7'),1.71(s,3h,h
‑
11”),1.69(s,3h,h
‑
10”),1.68(s,3h,h
‑
11'),1.67(s,3h,h
‑
10')；
[0105]
13
c nmr(100mhz,methanol
‑
d4)δ171.5(s,c
‑
1),163.6(s,c
‑
3),157.3(s,c
‑
4”),157.0(s,c
‑
4'),153.0(s,c
‑
6'),141.6(s,c
‑
4),133.4(s,c
‑
9”),133.2(d,c
‑
2”),132.7(s,c
‑
9'),131.3(d,c
‑
2'),130.6(d,c
‑
6”),129.8(s,c
‑
3”),126.0(s,c
‑
1”),124.2(d,c
‑
8'),123.6(d,c
‑
8”),122.0(s,c
‑
3'),116.1(d,c
‑
5”),109.4(s,c
‑
1'),108.8(d,c
‑
5),103.7(d,c
‑
5'),100.1(s,c
‑
2),29.2(t,c
‑
7”),28.7(t,c
‑
7'),25.9(q,c
‑
11'and 11”),17.9(q,c
‑
10'),17.8(q,c
‑
10”).
[0106]
化合物12：c
27
h
30
o7；黄色固体；
[0107]1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ7.56(s,1h,h
‑
2'),7.49(s,1h,h
‑
2”),7.47(s,1h,
h
‑
6”),6.77(d,j＝8.0hz,1h,h
‑
5”),6.41(s,1h,h
‑
5'),6.24(s,1h,h
‑
5),5.32(t,j＝7.4hz,1h,h
‑
8”),3.28(s,2h,h
‑
7”),2.59(m,2h,h
‑
7'),1.75(s,3h,h
‑
11”),1.73(s,3h,h
‑
10”),1.71(m,2h,h
‑
8'),1.24(s,6h,h
‑
10'and11')；
[0108]
13
c nmr(100mhz,methanol
‑
d4)δ171.8(s,c
‑
1),165.0(s,c
‑
3),157.3(s,c
‑
4”),157.0(s,c
‑
4'),153.4(s,c
‑
6'),142.0(s,c
‑
4),133.4(s,c
‑
9”),133.2(d,c
‑
2”),131.2(d,c
‑
2'),130.6(d,c
‑
6”),129.8(s,c
‑
3”),126.1(s,c
‑
1”),123.6(d,c
‑
8”),122.9(s,c
‑
3'),116.1(d,c
‑
5”),109.9(s,c
‑
1'),108.3(d,c
‑
5),103.9(d,c
‑
5'),99.6(s,c
‑
2),71.6(s,c
‑
9'),45.1(t,c
‑
8'),29.2(t,c
‑
7”),29.1(q,c
‑
10'and11'),26.0(q,c
‑
11”),25.7(t,c
‑
7'),17.9(q,c
‑
10”).
[0109]
实施例2丁烯内酯衍生物(化合物1～12)对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制作用
[0110]
1、仪器与材料
[0111]
新型冠状病毒m
pro
/3cl
pro
抑制剂筛选试剂盒(增强型)(上海碧云天生物技术有限公司beyotime biotechnology)；二甲基亚砜(西陇化工有限公司)；多功能酶标仪spectra max i3x(美谷分子仪器有限公司molecular devices)。
[0112]
2、方法
[0113]
基于荧光共振能量转移方法，采用新型冠状病毒m
pro
/3cl
pro
抑制剂筛选试剂盒(增强型)进行sars
‑
cov
‑
2 m
pro
抑制活性评价。将化合物溶解在二甲基亚砜中配制成待测样品(浓度为200μm)。依次将92μlassay buffer、1μl sars
‑
cov
‑
2m
pro
/3cl
pro
、5μl待测化合物样品、2μl底物依次加入到黑色96孔板中，混匀。孵育5分钟后，在激发波长325nm和发射波长393nm的条件下，在多功能酶标仪spectra max i3上读取相对荧光值(relative fluorescence unit,rfu)。ebselen(1μm)作为阳性对照，同时设置空白对照组和100％酶活性对照组。计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，分别记录为rfu
空白对照
、rfu
100％酶活性对照
、rfu
阳性对照
、rfu
样品
。计算每个样品的抑制百分率，计算公式如下：
[0114]
抑制率(％)＝(rfu
100％酶活性对照
–
rfu
样品
)/(rfu
100％酶活性对照
–
rfu
空白对照
)
×
100％
[0115]
将化合物1～12分别溶解在二甲基亚砜中，配制成不同浓度待测样品。以上述方法检测不同浓度的化合物对sars
‑
ncov m
pro
的抑制率。用graphpad prism软件，通过非线性回归法拟合剂量反应曲线，计算出化合物对新型冠状病毒m
pro
抑制作用的ic
50
值。
[0116]
3、结果
[0117]
实验结果如图1～4所示，图1为在10μm条件下，化合物1～12对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性，ebselen(1μm)为阳性对照，**p<0.01；图2～4为化合物9～12在不同浓度下对sars
‑
cov
‑
2m
pro
的抑制活性，其中ic
50
值的剂量反应曲线通过非线性回归确定(n＝3)。
[0118]
根据图1可以看出，在10μm浓度条件下，丁烯内酯衍生物(化合物1～12)对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
表现出不同程度的抑制活性，其中丁烯内酯衍生物9，10和12的抑制率均大于50％。进一步研究了在不同浓度下丁烯内酯衍生物9，10和12对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
的抑制活性，研究结果(图2～4)表明，化合物9、10、12对sars
‑
cov
‑
2 m
pro
具有显著的抑制活性，ic
50
值分别为10.31
±
0.64、9.36
±
0.63和7.66
±
0.65μm。
[0119]
实施例3丁烯内酯衍生物(化合物1
‑
12)的抗炎作用
[0120]
1、实验材料
[0121]
j774a.1购于中科院昆明细胞库、预染marker(thermo scientific)、蛋白质印迹
化学发光底物(thermo scientific)、opti
‑
mem减血清培养基(invitrogen)、胎牛血清(fbs)(gibco)、脱脂奶粉(cell signaling technology)、过硫酸铵(aladdin)、goat anti
‑
mouse igg hrp(thermo scientific)、anti
‑
mouse
‑
il
‑
1β(r&d)、anti
‑
mouse
‑
caspase
‑
1(p20)(adipogen)、hoechst33342(aladdin)、30％丙烯酰胺(aladdin)、乳酸脱氢酶(ldh)非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega)、dmem高糖培养基(gibco)、donkey anti
‑
goat igg hrp(r&d)、lps(o111:b4)(sigma
‑
aldrich)、碘化丙啶(pi)(aladdin)、十二烷基硫酸钠(sds)(aladdin)、四甲基乙二胺(temed)(aladdin)、三羟甲基氨基甲烷(tris)(aladdin)、尼日利亚菌素(invivogen)、二甲基亚砜(dmso)(西陇化工)。
[0122]
2、方法
[0123]
2.1nlrp3炎症小体激活
[0124]
j774a.1细胞铺板，将细胞接种在24孔板中，每孔2
×
105个细胞。次日，弃去过夜培养基，并用含有lps(100ng/ml)的无血清opti
‑
mem培养基对j774a.1细胞进行3h的预刺激。弃去培养基，并加入含有不同浓度的mcc950(阳性对照)和丁烯内酯衍生物(化合物1
‑
12)的opti
‑
mem培养基，孵育30min。最后，用尼日利亚菌素(nigricin,10μm)刺激1h。收集细胞培养上清液，并根据制造商的说明书进行ldh释放水平分析。
[0125]
2.2细胞渗透性测定
[0126]
nlrp3炎症小体激活后，将细胞用pi混合物(3μg/ml pi和0.5μg/ml hoechst3342)染色15分钟。并立即通过倒置荧光显微镜(axio observer 3,zeiss)观察并拍照。
[0127]
2.3蛋白质印迹法分析
[0128]
nlrp3炎症小体激活后提取上清蛋白质。将上清蛋白质样品进行sds
‑
page电泳，在12％sds
‑
page凝胶上分离，使用湿转移系统将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在室温条件下，将膜在5％脱脂牛奶(溶剂为1
×
tbst)中封闭1h，1
×
tbst洗膜3次。加入相应一抗，4℃孵育过夜。第二天，回收一抗，1
×
tbst洗膜3次。将膜加入由5％脱脂牛奶(溶剂为1
×
tbst)配制的hrp偶联二抗，在室温条件下摇床孵育1h。1
×
tbst洗膜4次，使用蛋白质印迹化学发光底物曝光膜。
[0129]
3、结果
[0130]
实验结果如图5～9和表4所示。图5为在10μm条件下，化合物1～12的ldh释放率，mcc950(100nm)作为阳性对照，ldh释放水平低于50％的化合物用箭头标记，**p<0.01；图6～7为nlrp3炎症小体激活后，化合物10处理j774a.1细胞后的western blot分析和灰度分析(图6采用anti
‑
mouse
‑
caspase
‑
1，图7采用anti
‑
mouse
‑
il
‑
1β)；图8为化合物10处理j774a.1细胞后，焦亡细胞计数，***p<0.001；图9为化合物10抑制j774a.1巨噬细胞焦亡的细胞染色图，其中死细胞用pi染色(红色)，细胞核用hoechst 33342染色(蓝色)，比例尺为20μm。
[0131]
表4化合物1～2、5～12的ldh抑制率的ic
50
值
[0132][0133][0134]
根据图5可以看出，12个丁烯内酯衍生物(1～12)化合物，除了化合物3和4，均能够抑制巨噬细胞中ldh的释放，化合物1～2、5～12的ic
50
值为0.74～7.43μm。此外，根据图6～9可以看出，化合物10以剂量依赖的方式降低nigericin诱导的j774a.1细胞pi染色比率，并且化合物10能够显著减少细胞焦亡。在免疫印迹分析中，化合物10还降低了caspase
‑
1和il
‑
1β的表达。总之，这些结果表明化合物10能够显著抑制nlrp3炎症小体的激活，从而阻断巨噬细胞焦亡。
[0135]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。