调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品、方法及用途。


背景技术：

2.人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,huc
‑
mscs)是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞，具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的多向分化潜能和强大的免疫调节作用。huc
‑
mscs因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子种类多，便于扩增和传代，同时无配型、排异等优点，成为临床研究和应用的理想mscs来源。经典的骨髓来源mscs存在年龄的差异和传代的老化等现象，脂肪组织来源的mscs的成骨分化能力较弱并且可以体外促进肿瘤的生长。huc
‑
mscs与其他来源的mscs具有相似的生物学特性，可以自我更新并保持多能性，且huc
‑
mscs不存在年龄的差异，另外脐带组织属于正常分娩的废弃物，也不存在伦理的问题，因此脐带组织来源的mscs应该是细胞治疗的良好来源，具有更广阔的临床应用前景。
3.免疫抑制功能是mscs独特的生物学特性和被应用与研究的基础。mscs强大的免疫调节作用体现在：1)mscs具有低免疫原性，其表面低表达mhc i类分子，不表达mhc ii类分子及共刺激分子cd40、cd80、cd86，可诱导免疫耐受，不引起自身反应性t细胞增殖，保证了移植后不引起宿主免疫排斥反应，可在宿主内存活并发挥功能。2)mscs具有较强的免疫调节功能，它可通过细胞间接触和分泌细胞因子抑制免疫细胞，如t淋巴细胞、b淋巴细胞和自然杀伤细胞的增殖和功能，抑制th1的分化，促进tregs分化，调控巨噬细胞由m1型向m2型极化，并在体内和体外调节抗原提呈细胞的活性，从而抑制机体的炎症反应，达到治疗自身免疫型糖尿病即i型糖尿病(type i diabetes mellitus,t1dm)、急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,agvhd)等炎性疾病的目的。
4.然而，目前对mscs的免疫调控机制的研究并不十分深入，在临床转化中其疗效亦不如预期。为了进一步探究mscs的免疫调控机制及其对t1dm的疗效的影响，目前国内外均未见tgfbi调控mscs发挥免疫抑制作用及其分子机制的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了一种新的免疫调节分子tgfbi介导人脐带间充质干细胞(huc
‑
mscs)调控t细胞增殖作用；并提供tgfbi在制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的产品中的应用。
6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
7.本发明发现tgfbi在脐带msc中高表达；通过将敲低tgfbi基因表达的huc
‑
mscs与t细胞共培养实验发现，tgfbi可以调控人脐带间充质干细胞抑制t细胞增殖作用。
8.基于此，本发明第一方面提供了tgfbi在制备调控脐带间充质干细胞免疫抑制作
用的产品中的应用。
9.进一步地，所述tgfbi敲低后脐带间充质干细胞免疫抑制作用显著降低。
10.进一步地，所述脐带间充质干细胞免疫抑制作用包括脐带间充质干细胞对t细胞增殖抑制作用。
11.在本发明中，所述tgfbi敲低的脐带间充质干细胞对t细胞增殖的抑制作用显著减弱。所述huc
‑
mscs中的tgfbi可以通过调节t细胞中的cyclind2的表达而抑制t细胞增殖。
12.第二方面，本发明提供了一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的制剂，所述制剂包括能够抑制或促进间充质干细胞中tgfbi表达的制剂。
13.进一步地，所述抑制间充质干细胞中tgfbi表达的技术包括小分子抑制剂，rna干扰和crispr/cas系统。
14.优选地，rna干扰技术。
15.进一步地，所述rna干扰包括采用tgfbi的shrna或sirna抑制tgfbi表达。
16.进一步地，所述tgfbi的shrna或sirna的干扰靶序列包括如seq id no:5～7所示的核苷酸序列，优选地，seq id no:6。
17.第三方面，本发明提供了一种调控脐带间充质干细胞免疫抑制作用的方法，所述方法包括以下步骤：
18.(1)构建慢病毒sh
‑
tgfbi载体构建，并转染脐带间充质干细胞；
19.(2)将转染慢病毒sh
‑
tgfbi载体的间充质干细胞与t淋巴细胞共培养。
20.进一步地，所述步骤(2)中t淋巴细胞同时用anti
‑
cd3抗体刺激活化。
21.优选地，使用1μg/ml anti
‑
cd3抗体刺激活化t细胞。
22.在一具体的实施方案中，anti
‑
cd3抗体用pbs稀释为1μg/ml，加入到96孔板(50μl/孔)，转移至37℃孵育2h；弃掉96孔板的包被液，分别用pbs洗涤2次，按照msc：t＝1:5的比例分别加入经cfse染色的t淋巴细胞和sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs，共培养72h；
23.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
24.本发明发现转录生长因子诱导蛋白(tgfbi)在huc
‑
mscs中持续稳定高表达，并发现tgfbi可以调控huc
‑
mscs免疫抑制作用，并且是通过调控t细胞增殖实现。证实了tgfbi可以作为脐带msc新的免疫抑制分子，为临床使用脐带msc治疗系统性红斑狼疮、i型糖尿病、自身免疫性脑脊髓炎、骨关节炎等自身免疫性疾病提供了理论基础和治疗靶点。
附图说明
25.图1q
‑
pcr检测tgfbi在连续传代的huc
‑
mscs中表达情况。
26.图2a：流式细胞术检测3中shrna转染效率；b：q
‑
pcr验证3种shrna对huc
‑
mscs的敲低效率；c：荧光显微镜观察转染sh
‑
tgfbi的huc
‑
mscs绿色荧光蛋白表达；d：western blot检测经慢病毒敲低huc
‑
mscs的敲低效率；e：q
‑
pcr检测经慢病毒敲低huc
‑
mscs的敲低效率。
27.图3sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs抑制t细胞增殖；a：流式细胞术检测共培养后t细胞增殖比例；b：t细胞增殖比例统计结果。
28.图4a：q
‑
pcr检测共培养t细胞cyclind2的mrna表达差异；b：western blot检测共培养t细胞cyclind2的蛋白表达差异。
具体实施方式
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
30.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
31.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
32.实施例1 tgfbi在huc
‑
mscs持续稳定高表达
33.培养huc
‑
mscs细胞：首先按照常规方法从人脐带组织分离获取原代人脐带间充质干细胞(huc
‑
mscs)培养后，接种于15mlα
‑
mem 10％胎牛血清(fbs)的完全培养基中培养p1代huc
‑
mscs，细胞融合度达80％
‑
90％后，经0.125％胰酶消化传代。对p3代huc
‑
mscs进行连续传代至p10代，并采用trizol法分别提取不同代数的细胞总mrna，利用总rna 1μg、rna free water、oligo dt 1μl、random 1μl、5
×
m
‑
mlv buffer 4μl、dtt 2μl、dntp 1μl、m
‑
mlv 1μl、rnase inhibitor 1μl制备逆转录混合反应液20μl，在pcr扩增仪上进行逆转录反应(70℃，10min；42℃，1h；70℃，10min)，反应结束后，逆转录产物cdna置于冰上或储存于
‑
20℃保存。q
‑
pcr检测检测tgfbi的表达，并与内参gapdh以及huc
‑
mscs经典的免疫负调控分子tgf
‑
β进行基因表达差异分析，其中q
‑
pcr引物序列如seq id no:1
‑
4所示。反应体系：cdna 1μl，pcr上下游引物(10μm)1μl，pt
‑
pcr master mix 10μl和rna free water 8μl；反应条件：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。gapdh作为内参，数据采用法进行分析。
34.引物序列如下：
35.tgfbi上游引物：5
’‑
cagaaggttattggcactaatagg
‑3’
，seq id no:1；
36.tgfbi下游引物：5
’‑
ctgatgactgttgatttgcca
‑3’
，seq id no:2。
37.gapdh上游引物：5
’‑
tcaagatcatcagcaatgcc
‑3’
，seq id no:3；
38.gapdh下游引物：5
’‑
cgatacc aaagttgtcatgga
‑3’
，seq id no:4。
39.结果如图1所示，q
‑
pcr检测tgfbi在连续传代的huc
‑
mscs中表达：huc
‑
mscs经过连续传代，以内参gapdh及huc
‑
mscs经典负调控分子tgf
‑
β为参照，说明huc
‑
mscs中tgfbi的mrna含量持续稳定高表达。
40.实施例2 sh
‑
tgfbi慢病毒载体转染huc
‑
mscs
41.利用慢病毒构建sh
‑
tgfbi载体感染huc
‑
mscs，获得稳定表达的sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs，所述慢病毒构建载体为gv493(吉凯基因)。所述sh
‑
tgfbi的靶序列包括如下三组：
42.tgfbi
‑
rnai(85681
‑
11)：5
’‑
caccactatcctaatgggatt
‑3’
，seq id no:5；
43.tgfbi
‑
rnai(85682
‑
1)：5
’‑
tgccaaggaacttgccaacat
‑3’
，seq id no:6；
44.tgfbi
‑
rnai(85683
‑
1)：5
’‑
gccctaccactctcaaacctt
‑3’
，seq id no:7。
45.将复苏的huc
‑
mscs p2代细胞接种至六孔板中，接种细胞数为1
×
105。用含有4μl/ml hitransg p(revg005，吉凯基因)的10％fbs的α
‑
mem完全培养基换液，加入病毒悬液，(滴度为moi＝10，转染病毒量为1
×
107/ml)，转染24h后更换培养基为2ml含10％fbs的α
‑
mem完全培养基，并进行扩增培养，转染48h后加入嘌呤霉素(2μmol/ml)进行药物抗药基因筛选72h，更换新鲜培养基进行细胞扩增，待细胞融合度达80％
‑
90％左右，胰酶消化后传代扩增培养。首先通过流式细胞术及q
‑
pcr验证3种shrna转录效率及敲低效率。结果如图2a，三种shrna的转染效率均在90％以上。图2b显示，tgfbi
‑
rnai(85682
‑
1)对tgfbi的敲低效率
最高，故应用于后续实验中。进一步对huc
‑
mscs转染空载病毒及敲减tgfbi的慢病毒，使用荧光显微镜观察转染空载病毒的huc
‑
mscs(sh
‑
nc
‑
mscs)以及转染敲减tgfbi慢病毒的huc
‑
mscs(sh
‑
tgfbi
‑
mscs)绿色荧光蛋白表达情况。
46.结果如图2c所示，通过荧光显微镜观察转染sh
‑
nc
‑
mscs及sh
‑
tgfbi
‑
mscs，可见大量绿色荧光蛋白表达，说明慢病毒成功转染进huc
‑
mscs。
47.进一步，使用western blot和q
‑
pcr检测经慢病毒敲低huc
‑
mscs的敲低效率。结果显示，转染空载慢病毒的huc
‑
mscs总蛋白中tgfbi高表达，而转染敲减tgfbi慢病毒的huc
‑
mscs总蛋白中tgfbi的表达显著降低，说明成功利用慢病毒载体在蛋白水平敲减huc
‑
mscs中的tgfbi(图2d)。转染空载慢病毒的huc
‑
mscs总rna中tgfbi高表达，而转染敲减tgfbi慢病毒的huc
‑
mscs总rna中tgfbi的表达显著降低，说明成功利用慢病毒载体在mrna水平敲减huc
‑
mscs中的tgfbi(图2e)。
48.所述western blot方法：收集细胞，pbs洗2遍，细胞裂解液4℃裂解细胞15min，13000rpm 4℃离心10min，bca蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取30μl蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，经10％sds
‑
page分离后，转移到pvdf膜上，含5％脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗(cell signaling technology#3741)，用tbst洗膜3次，加入二抗室温孵育1h，再用tbst洗膜3次，ecl化学发光显影。
49.所述q
‑
pcr检测方法参照实施例1所述的q
‑
pcr检测方法。
50.实施例3 sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs与t细胞共培养
51.分别将huc
‑
mscs，sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs,sh
‑
nc
‑
huc
‑
mscs与小鼠t淋巴细胞共培养，同时用anti
‑
cd3刺激t细胞活化，cfse染料标记两组淋巴细胞，流式细胞术检测t细胞增殖。具体步骤如下：
52.a)小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离t淋巴细胞；
53.b)anti
‑
cd3抗体用pbs稀释为1μg/ml，加入到96孔板(50μl/孔)，转移至37℃孵育2h；
54.c)弃掉96孔板的包被液，分别用pbs洗涤2次，分别加入经cfse染色的t淋巴细胞(2.5
×
104/孔)，同时按照msc：t＝1:5的比例，及5
×
103/孔分别加入huc
‑
mscs，sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs,sh
‑
nc
‑
huc
‑
mscs，共培养72h；
55.d)收集共培养的t淋巴细胞，流式细胞术检测t淋巴细胞增殖比例。
56.结果如图3所示，未与huc
‑
mscs共培养(without mscs)的t细胞增殖比例最高；与huc
‑
mscs( huc
‑
mscs)及转染空载慢病毒载体的huc
‑
mscs( sh
‑
nc
‑
mscs)共培养的t细胞，增殖比例显著降低，说明huc
‑
mscs可以抑制t细胞增殖；与敲减tgfbi的huc
‑
mscs( sh
‑
tgfbi
‑
mscs)共培养后，t细胞的增殖比例相较于与huc
‑
mscs及sh
‑
nc
‑
mscs共培养组显著增高，说明敲减tgfbi的huc
‑
mscs对t细胞增殖的抑制作用显著减弱。
57.综上说明，tgfbi可以作为脐带msc调控t细胞增殖的重要免疫分子，tgfbi敲低后脐带msc免疫抑制能力显著降低。
58.实施例4 tgfbi通过调控周期蛋白cyclind2抑制t细胞增殖
59.分别将huc
‑
mscs，sh
‑
tgfbi
‑
huc
‑
mscs,sh
‑
nc
‑
huc
‑
mscs与小鼠t淋巴细胞共培养，同时用anti
‑
cd3刺激t细胞活化，共培养72h，利用q
‑
pcr及western blot检测t细胞增殖相关cyclind2基因及蛋白表达差异。
60.引物序列如下：
61.cylind2上游引物：5
’‑
tcctatttcaagtgcgtgc
‑3’
，seq id no:8；
62.cylind2下游引物：5
’‑
ctcacagacctctagcatcc
‑3’
，seq id no:9。
63.gapdh上游引物：5
’‑
actcttccaccttcgatgc
‑3’
，seq id no:10；
64.gapdh上游引物：5
’‑
ccgtattcattgtcataccagg
‑3’
，seq id no:11。
65.q
‑
pcr检测结果如图4a所示，未与huc
‑
mscs共培养(without mscs)的t细胞cyclind2的mrna表达最高；与huc
‑
mscs( huc
‑
mscs)及转染空载慢病毒载体的huc
‑
mscs( sh
‑
nc
‑
mscs)共培养的t细胞，cyclind2的mrna表达显著降低，说明huc
‑
mscs可以抑制t细胞中cyclind2的表达。与敲减tgfbi的huc
‑
mscs( sh
‑
tgfbi
‑
mscs)共培养后，t细胞中cyclind2的表达相较于与huc
‑
mscs及sh
‑
nc
‑
mscs共培养组显著增高，说明huc
‑
mscs中的tgfbi可以通过调节t细胞中的cyclind2的表达而抑制t细胞增殖。
66.western blot检测结果如图4b所示，在蛋白水平验证huc
‑
mscs中的tgfbi通过调节t细胞中的cyclind2的表达而抑制t细胞增殖。
67.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。