一种提高谷氨酸棒杆菌合成L-谷氨酸产量的方法与流程

一种提高谷氨酸棒杆菌合成l
‑
谷氨酸产量的方法
技术领域
1.本发明涉及一种提高谷氨酸棒杆菌合成l
‑
谷氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.l
‑
谷氨酸在氨基酸市场中作为风味添加剂被广泛使用，具有巨大的市场规模，年产量约为250万吨。l
‑
谷氨酸主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等，同时，l
‑
谷氨酸本身可用作药物，参与脑内蛋白质和糖的代谢，促进氧化过程，该品在体内与氨结合成无毒的谷酰胺，使血氨下降，减轻肝昏迷症状。
3.谷氨酸棒杆菌最开始作为一株l
‑
谷氨酸生产菌株而被分离，后面为了适应其他氨基酸的生产，逐渐通过代谢改造，用来实现精氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸等氨基酸的生产，并获得了显著的成果。转录调控因子是能够与特定dna序列进行结合的蛋白质，通常位于靶基因的5’端上游区域，以调节基因转录的速率，能够增强或者抑制靶基因的表达，在细胞的代谢过程中发挥着重要的作用。传统的谷氨酸棒杆菌高产菌株的选育主要从代谢工程改造、发酵条件优化、诱变育种、氨基酸转运蛋白的研究，很少有研究关注转录调控因子在高产菌株选育过程中发挥的重要作用。尤其是在发酵生产l
‑
谷氨酸过程中，几乎没有关注过转录调控因子在l
‑
谷氨酸发酵过程中所参与的相关调控作用。


技术实现要素：

4.鉴于目前l
‑
谷氨酸生产代谢网络的研究还不够透彻，不能很好地解决l
‑
谷氨酸生产的问题，本发明提出了利用转录调控因子ncl1124来调节l
‑
谷氨酸的合成代谢，并促进l
‑
谷氨酸的积累。启动子p
glna
是谷氨酰胺合成酶(glna)的启动子，能够启动glna的转录。glna能够将l
‑
谷氨酸转为谷氨酰胺，进而削弱l
‑
谷氨酸的积累。转录调控因子ncgl1124对于l
‑
谷氨酸的积累是一个正向的转录调控因子，ncgl1124能够与启动子p
glna
结合，进而抑制了下游基因l
‑
谷氨酸合成酶的表达，从而抑制了l
‑
谷氨酸的分解代谢，促进了l
‑
谷氨酸的积累。
5.本发明提供了一种重组菌，所述重组菌过表达谷氨酸棒杆菌来源的转录调控因子ncgl1124，所述谷氨酸棒杆菌来源的转录调控因子ncgl1124的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.在一种实施方式中，所述重组菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌g01。
7.在一种实施方式中，将编码所述转录调控因子ncgl1124的核苷酸连接至表达载体构建得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中，构建得到重组菌。
8.在一种实施方式中，编码所述转录调控因子ncgl1124的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在一种实施方式中，所述表达载体为pxmj19。
10.本发明提供了一种生产l
‑
谷氨酸的方法，利用所述重组菌以葡萄糖为底物生产l
‑
谷氨酸。
11.在一种实施方式中，反应体系中含有三水合磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、玉米浆、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰和尿素。
12.在一种实施方式中，将od
600
约7
‑
11的重组菌以1
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10％的量加入反应体系中，在25
‑
35℃，150
‑
250rpm，ph为6.5
‑
7.5下反应。
13.在一种实施方式中，在培养至od
600
为6
‑
8时加入iptg进行诱导，
14.本发明保护所述重组菌，或所述方法在制备l
‑
谷氨酸中的应用。
15.有益效果：本发明提供了一个转录调控因子ncgl1124，该转录调控因子能够与启动子pglna结合，并促进l
‑
谷氨酸的积累量。通过5
‑
l发酵罐流加发酵培养，重组谷氨酸棒杆菌g01/p19
‑
ncgl1124的l
‑
谷氨酸产量相对于对照菌株谷氨酸棒杆菌g01提高了22％，产量达到了165.3g/l；谷氨酰胺水平下降了90％。
附图说明
16.图1为转录因子ncgl1124与启动子p
glna
结合的结果图，泳道1为不含转录调控因子ncgl1124，只添加启动子p
glna
片段，作为空白对照；泳道2
‑
4为添加相同质量的启动子p
glna
片段并梯度添加转录调控因子ncgl1124蛋白；从左到右蛋白添加浓度逐渐提高。
具体实施方式
17.大肠杆菌(escherichia coli)jm109购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
18.pet28a质粒和pxmj19质粒均购自biovector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心。
19.谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)g01记载于文献“efficient one
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step preparation ofγ
‑
aminobutyric acid from glucose without an exogenous cofactor by the designed corynebacterium glutamicum”中。
20.lb液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl 10g/l。
21.lb固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl 10g/l、琼脂15g/l。
22.lbg液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl 10g/l、5g/l葡萄糖。
23.lbg固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl 10g/l、5g/l葡萄糖、琼脂粉15g/l。
24.谷氨酸棒杆菌感受态培养基：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl 10g/l、5g/l葡萄糖、1g/l吐温
‑
80、3g/l甘氨酸。
25.种子培养基：25g/l葡萄糖、1.5g/l k2hpo4·
3h20、0.6g/lmgso4、30g/l玉米浆、2.5g/l尿素、0.005g/l feso4·
7h2o、0.005g/l mnso4·
4h2o，ph为7.0。
26.发酵培养基：葡萄糖140g/l、三水合磷酸氢二钾1.5g/l、七水合硫酸镁0.6g/l、玉米浆5.0g/l、七水合硫酸亚铁0.005g/l、一水合硫酸锰0.005g/l、尿素7.0g/l，ph为7.0。
27.2x结合缓冲液：40mm tris
‑
hcl(ph 7.5)、4mm mgcl2、100mm nacl、10％甘油、2mm二硫苏糖醇(dtt)、0.2mg/ml牛血清清蛋白(bsa)、1mm edta。
28.葡萄糖含量、l
‑
谷氨酸含量和糖酸转化率的测定：采用bio
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sba生物分析仪分析发酵液中葡萄糖和l
‑
谷氨酸的含量，吸取25μl的标准液sba进行标定，等待标定结束后，取1ml
发酵液进行一定倍数的稀释后，吸取25μl稀释后的发酵液进行测定，记录数据。
29.实施例1：转录调控因子ncgl1124的敲除
30.以谷氨酸棒杆菌g01基因组为模板，利用引物对ncgl1124
‑
l f/ncgl1124
‑
l r和ncgl1124
‑
r f/ncgl1124
‑
r r分别扩增出基因ncgl1124的上游和下游各500bp，而后分别以纯化得到的上、下游片段为模板，利用引物对ncgl1124
‑
l f/ncgl1124
‑
r r，经过重叠延伸pcr将上、下游片段融合并回收整合得到了的全长1000bp的同源臂。同时以质粒pk18为模板，利用引物对pk18 f/pk18 r反向pcr扩增出线性化载体pk18，回收后利用one
‑
step homologous recombination kit(购买于南京诺唯赞)与已经整合好的同源臂在30℃连接30分钟，而后将连接后的体系转化到大肠杆菌中，而后利用菌落pcr鉴定阳性转化子，并提质粒得到构建成功的重组敲除质粒pk18
‑
ncgl1124。构建成功重组敲除质粒经过电转化至谷氨酸棒杆菌g01中，经过两轮同源重组筛选以及菌落pcr鉴定、基因组pcr鉴定得到转录调控因子ncgl1124缺失重组菌g01δncgl1124。
31.ncgl1124
‑
l f：tcaagatcaaattcagccaagtgg，
32.ncgl1124
‑
l r：atcacctaccctagcctgct，
33.ncgl1124
‑
r f：agcaggctagggtaggtgatgggtttacttggagcgttttctc，
34.ncgl1124
‑
r r：attcgagtcggtaccgcttg，
35.pk18 f：gaattcgtaatcatgtcatagctgtttcc，
36.pk18 r：aagcttggcactggcc。
37.实施例2：转录调控因子ncgl1124过量表达
38.以谷氨酸棒杆菌g01基因组为模板，利用引物对ncgl1124 f/ncgl1124 r扩增出转录调控因子ncgl1124的核苷酸序列，并回收目标片段。并利用one
‑
step homologous recombination kit(购买于南京诺唯赞)将已经得到的目标dna片段及与已经利用ecori和bamhi双酶切并纯化得到线性化载体pxmj19在30℃连接30分钟，转化到大肠杆菌中，而后利用菌落pcr鉴定阳性转化子，并提质粒得到构建成功的重组质粒pxmj19
‑
ncgl1124。构建成功重组敲除质粒经过电转化至谷氨酸棒杆菌g01中，经过菌落pcr鉴定得到重组菌g01/pxmj19
‑
ncgl1124。
39.ncgl1124 f：agcttaaaggaggacaactaatgacaacaccacgatggct，
40.ncgl1124 r：gctcggtacccggggatcctttacagctctgccgcgc。
41.实施例3：转录因子ncgl1124与启动子p
glna
结合效果的验证
42.通过emsa试验来验证ncgl1124蛋白与启动子p
glna
的结合。
43.为了进行emsa试验，需要得到纯化后ncgl1124蛋白。首先，本发明利用大肠杆菌bl21为宿主，构建了重组菌e.coli/pet28a
‑
ncgl1124，异源表达来源于谷氨酸棒杆菌g01的转录调控因子ncgl1124。重组菌e.coli/pet28a
‑
ncgl1124在37℃，180rpm下培养至od
600
约为0.5～0.8时，添加0.5mm isopropylβ
‑
d
‑1‑
thiogalactopyranoside(iptg)并转移至16℃，180rpm条件下诱导蛋白表达。诱导表达10
‑
12h之后，离心收集细胞，并利用5ml tris
‑
hcl bufer(50mm，ph 7.4)重悬细胞，然后利用超声细胞破碎仪处理重悬的细胞，离心得到粗酶液。得到的粗酶液经过镍柱纯化后得到的纯酶液可以用来进行emsa实验。
44.以谷氨酸棒杆菌g01基因组为模板，利用引物对pglna f/pglna r克隆出启动子p
glna
基因片段(262bp)。而后纯化回收得到的启动子片段(序列如seq id no.3所示)分别与
梯度稀释的转录调控因子ncgl1124在2x结合缓冲液中混合，室温反应30min，制备反应体系。电泳使用的是浓度5％的活性page胶，点样之前，首先要在100v电压条件下进行预跑。制备完成的反应体系在4℃，100v的条件下进行电泳分析。结果显示(图1)，转录调控因子ncgl1124能够与启动子p
glna
结合。
45.pglna f：ggtgactcctcattgacatggg，
46.pglna r：acatgtagagggcggatact。
47.实施例4：重组菌5
‑
l发酵罐生产l
‑
谷氨酸
48.(1)种子培养
49.从活化平板上挑取实施例1和2制备得到的重组谷氨酸棒杆菌g01/pxmj19
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ncgl1124和野生谷氨酸棒杆菌g01单菌落接种于10ml lbg培养基中，30℃，200rpm培养24h，然后按照3％接种量转接至50ml种子培养基中，30℃，200rpm培养12h，种子液od
600
约为8
‑
10。
50.(2)5
‑
l发酵罐发酵培养
51.发酵条件：将上述培养好的种子液按5％接种量接种于含有2.5l发酵培养基的5
‑
l发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为350rpm，当葡萄糖残余浓度在40
‑
50g/l时开始恒速补料，补料速率为10g/(l
·
h)，当葡萄糖消耗速率低于5g/(l
·
h)时停止补料，并继续发酵至残留的葡萄糖被耗尽，发酵过程中ph通过添加无菌的50％氨水进行阶段调控以维持ph为7.0，并每隔6h取样测定残余葡萄糖浓度以及l
‑
谷氨酸产量。采用分光光度仪在a600下测定细胞od值，以确定加入诱导剂的时间，在od
600
为6
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8或者发酵生产6小时左右，添加终浓度为0.5mm的iptg进行诱导。
52.用生物传感分析仪测定(sba
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50，山东省科学院生物研究所)葡萄糖和l
‑
谷氨酸的含量。结果表明，在5
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l发酵罐水平，对照菌株谷氨酸棒杆菌g01的l
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谷氨酸产量为135.5g/l，谷氨酰胺水平为14.5g/l，重组谷氨酸棒杆菌g01/p19
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ncgl1124的l
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谷氨酸产量相对于对照菌株谷氨酸棒杆菌g01提高了22％，产量达到了165.3g/l，谷氨酰胺水平为1.6g/l，谷氨酰胺的水平下降了90％。
53.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。