FGL1/CAIX双靶点疫苗在治疗肾癌和肾癌肺转移中的应用的制作方法

fgl1/caix双靶点疫苗在治疗肾癌和肾癌肺转移中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及fgl1/caix双靶点疫苗在治疗肾癌和肾癌肺转移中的应用技术领域。


背景技术：

2.肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)简称肾癌，是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。2018年，肾癌导致超过175，000人死亡，其发病率在全球范围内不断增加。肾癌根治切除术是治疗早期肾癌的一种有效手段，然而不幸的是，25％至30％的肾癌患者在确诊时已经发生远处转移；同时，经手术切除后的肾癌患者大约有40％最终会复发。晚期肾癌的治疗主要以抗血管因子、细胞因子、单克隆抗体及激酶抑制剂等为主，但是存在花费高，副作用大，药物的耐药性高导致控制疾病的进程短等问题。因此，针对晚期肾癌的治疗急需发展新的药物与途径。
3.肿瘤免疫治疗在近几年发展迅速，治疗性肿瘤疫苗作为肿瘤免疫疗法的重要组成备受瞩目，可作为实体瘤治疗的重要突破口。其中在肿瘤疫苗占有重要地位的基因疫苗，成为了近年研究的热点之一。肿瘤基因疫苗是将编码肿瘤特异性抗原的基因负载到质粒载体上(常借助基因工程技术)，直接注射入人体，借助人体基因表达系统或者载体本身，持续引起特异性的细胞免疫和体液免疫，从而达到预防和治疗疾病的目的。肿瘤基因疫苗既具有减毒活疫苗的优点，又具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性，再加上其特异性高、针对性强，如今已经成为恶性肿瘤治疗的重要发展方向。因此，有效安全的肿瘤基因疫苗为治疗肾癌等恶性实体瘤提供了新的思路。
4.碳酸酐酶9(carbonicanhydraseix，caix)也称为g250，是碳酸酐酶家族异构体之一，是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，其对二氧化碳转化为碳酸氢盐进行催化，并参与细胞内外ph的调节，通过ph调节，caix减少癌细胞的粘附，促进其迁移和侵袭，从而增强其恶性行为。caix抗原在约90％的肾细胞癌中表达，而在正常肾组织中不表达，被称为肾癌相关抗原，可用作肾癌治疗的靶点。研究报道，基于caix抗原的各类疫苗能有效激起特异性免疫反应，抑制肾癌的生长。


技术实现要素：

5.为了提供更安全有效的肾癌治疗方法，本研究构建了plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix、plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗，通过体内外实验验证这种新型疫苗在肾癌中的治疗效果，并探讨plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix、plga/pei
‑
pfgl1/pcaix(在代表疫苗时该“/”表示“和”，也就是plga/pei
‑
pfgl1和plga/pei
‑
pcaix同时使用，也即联合免疫)疫苗在治疗肾癌中的作用机制，为肾癌的免疫治疗提供新的途径，也将为其临床应用奠定实验基础。
6.产品
7.一方面，本发明提供了一种fgl1核酸分子，所述核酸分子包括dna分子或其转录的
rna分子。
8.优选地，所述fgl1的dna分子的序列与seq id no.:1所示的核苷酸序列有至少90％的同源性。
9.优选地，所述fgl1的dna分子的序列如seq id no.:1所示。
10.另一方面，本发明提供了一种fgl1蛋白分子，所述fgl1蛋白分子的氨基酸序列与seq id no.:2所示的序列有至少90％的同源性。
11.优选地，所述fgl1蛋白分子的氨基酸序列如seq id no.:2所示。
12.另一方面，本发明提供了一种caix核酸分子，所述核酸分子包括dna分子或其转录的rna分子。
13.优选地，所述caix的dna分子的序列与seq id no.:3所示的核苷酸序列有至少90％的同源性。
14.优选地，所述caix的dna分子的序列如seq id no.:3所示。
15.另一方面，本发明提供了一种caix蛋白分子，所述caix蛋白分子的氨基酸序列与seq id no.:4所示的序列有至少90％的同源性。
16.优选地，所述caix蛋白分子的氨基酸序列如seq id no.:4所示。
17.优选地，本发明所述蛋白分子的序列与对应的dna分子转录翻译的氨基酸序列一致。
18.优选地，所述至少90％包括90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。
19.本发明所述的“核酸分子”是可以被化学修饰的。具体地，“化学修饰”是指与自然的dna相比，本发明提供的核酸分子可被化学修饰(chemical modification)。寡核苷酸的化学修饰是通过引入或除去任何化学基因而使其共价结构发生改变的现象或方法。核酸分子的化学修饰部位可发生在磷酸二酯键、核糖和碱基。核酸分子的化学修饰可发生在5’端或3’端，可在合成时或合成后进行。
20.另一方面，本发明提供了一种包含fgl1和/或caix核酸分子的载体。
21.优选地，所述核酸分子是dna分子。
22.优选地，所述载体包括表达载体。
23.优选地，所述载体是真核表达载体。
24.优选地，本发明所述的真核表达载体包括但不限于pcdna3.1、ppicz alpha a、gapzαa、pyes2.0、pbi121、pegfp
‑
n1、pegfp
‑
c1、ppic9k；具体地，本发明具体实施例所使用的载体为pcdna3.1。
25.优选地，所述载体还包括一种或多种调控元件。
26.优选地，所述调控元件包含启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。
27.优选地，所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、自杀型启动子或其任意组合。
28.另一方面，本发明提供了一种载体组合，所述载体组合中有包含fgl1和/或caix核酸分子的载体。
29.优选地，所述载体组合中有包含fgl1和caix的dna分子的载体。
30.优选地，所述载体是真核表达载体。
31.优选地，所述包含fgl1核酸分子的载体和包含caix核酸分子的载体可以是同一个载体，也可以不是同一个载体。
32.优选地，所述包含fgl1核酸分子的载体和包含caix核酸分子的载体不是同一个载体；也就是fgl1核酸分子和caix核酸分子在两个不同的载体上，所述两个不同的载体可以是相同的真核表达载体或者不同的真核表达载体。
33.另一方面，本发明提供了一种高表达fgl1和/或caix的宿主细胞。
34.优选地，所述宿主细胞是动物细胞；优选地，人的细胞；更优选地，人的免疫细胞。
35.优选地，所述免疫细胞包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞。
36.另一方面，本发明提供了一种治疗肾癌的疫苗，所述疫苗中含有fgl1和/或caix的核酸分子。
37.优选地，所述疫苗是核酸疫苗。
38.本发明所述“核酸疫苗(nucleic acid vaccine)”，也称基因疫苗(genetic vaccine)，是利用现代生物技术免疫学、生物化学、分子生物学等研制成的，分为dna疫苗和rna疫苗两种。
39.优选地，所述疫苗是dna疫苗。
40.优选地，所述核酸分子是dna。
41.优选地，所述疫苗是含有表达fgl1的载体和表达caix的载体的dna疫苗。
42.优选地，所述疫苗中还包括递送材料。
43.优选地，所述递送材料包括但不限于：高分子材料、类固醇(如胆固醇)、络和物、乳化物、免疫刺激复合物(iscoms)、脂质(如阳离子脂质和阴离子脂质)、病毒样颗粒、微球、环状多聚物、chitosan(壳聚糖)、liposomes(脂质体)。
44.优选地，所述高分子材料包括但不限于plga(聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物)、pei(聚乙烯亚胺)、pla(聚乳酸)、pga(聚乙醇酸)、ptmc(聚三亚甲基碳酸酯)、plcl、peg(聚乙二醇)。
45.优选地，所述递送材料是plga和pei的组合。
46.优选地，所述plga和pei的质量比是plga：pei＝7
‑
15：1。
47.优选地，所述plga和pei的质量比是plga：pei＝10：1。
48.优选地，所述疫苗中还可以包含药学上可接受或生理学可接受的药用辅料、载体、稳定剂、稀释剂、赋形剂、缓冲液、等渗剂、添加剂等。
49.应用
50.另一方面，本发明提供了提高fgl1和/或caix表达的物质在促进树突细胞成熟、增强cd8

t细胞的免疫反应、治疗肾癌、治疗肾癌转移中的应用。
51.另一方面，本发明提供了提高fgl1和/或caix表达的物质在制备促进树突细胞成熟、增强cd8

t细胞的免疫反应、治疗肾癌、治疗肾癌转移的产品中的应用。
52.优选地，所述提高fgl1和/或caix表达的物质包括核酸分子、蛋白分子、载体、载体组合、疫苗、宿主细胞。
53.优选地，所述肾癌转移包括肾癌骨转移，肾癌肝转移，肾癌肺转移，肾癌脑转移。
54.优选地，所述肾癌转移是指肾癌肺转移。
55.优选地，所述树突细胞是cd11c

树突状细胞；优选地，是人体内的cd11c

树突状细胞；更优选地，是患者体内的cd11c 树突状细胞。
56.优选地，所述增强cd8

t细胞的免疫反应包括促进t淋巴细胞增殖、提高ctl活性、cd8 t细胞的比例增加。
57.更优选地，cd8

t细胞包括tnf
‑
α

cd8

、il
‑2
cd8

、ifn
‑
γ

cd8

、tnf
‑
α

il
‑2
cd8

、tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

、il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

和tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞。
58.优选地，所述提高fgl1和/或caix表达的物质还可以与佐剂、抗肿瘤制剂、化疗药物、放疗制剂联合使用。
59.本发明所述的“佐剂(adjuvant)”具有下述活性(1)减少疫苗的接种次数；(2)延长疫苗的免疫持续期；(3)通过激动固有免疫应答促进体液免疫应答和细胞免疫应答；(4)扩展抗原诱导的交叉保护免疫应答；(5)增强弱免疫应答个体如老龄个体或免疫缺陷个体对抗原的免疫应答；(6)减少抗原的用量。所述佐剂可以在与所述疫苗相同的时间和相同的部位使用，或者在不同的时间施用，例如，作为加强剂使用。佐剂还可优选以与施用疫苗不同的方式和部位施用。
60.本发明所述的“化疗药物”是可以通过抑制、杀伤肿瘤细胞而治疗肿瘤的化学药物。本发明所指的化学药物包括但不限于烷化剂类、抗代谢类、抗微管制剂类、拓扑异构酶抑制剂类和细胞毒性抗生素类药物。
61.本发明所述的“放疗制剂”是可以产生射线的物质。采用放疗制剂治疗肿瘤的方法被称为化疗。本发明提供的寡核苷酸可以和放疗联合应用治疗肿瘤。用于放疗的物质是产生α、β、γ射线的放射性同位素。用于放疗的射线也可由机器产生，这类机器包括x射线治疗机或加速器。
62.本发明所述“治疗”包括应用本发明提供的寡核苷酸来阻止或延缓疾病(如肿瘤)的症状和并发症的出现。治疗也可以是预防性。对肿瘤的治疗也指在个体控制肿瘤的进展，延长肿瘤患者的生存期，改善生活质量，减轻症状，使肿瘤缩小甚至消除，使肿瘤转移受到遏制。在本发明中“肿瘤治疗”和“抗肿瘤作用”或“治疗肿瘤”有相同的含义。抗肿瘤作用包括对肿瘤的治疗，也包括对肿瘤发生、复发和转移的预防。本发明提供的寡核苷酸可被用于肿瘤的治疗。
63.制备疫苗的方法
64.另一方面，本发明提供了制备表达fgl1和/或caix的疫苗的方法，所述方法包括将fgl1和/或caix的核酸分子/蛋白分子与递送材料混合。
65.优选地，所述递送材料与前述一致。
66.优选地，所述递送材料是plga和pei的组合。
67.优选地，所述plga和pei的质量比是plga：pei＝7
‑
15：1。
68.优选地，所述plga和pei的质量比是plga：pei＝10：1。
69.优选地，所述纳米颗粒的制备方法是w/o/w双乳液溶剂蒸发法。
70.优选地，所述递送材料与质粒的比例为1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32。
71.优选地，所述递送材料与质粒的比例为1：4。
72.优选地，本发明所述“比例”皆是质量比。
73.优选地，所述方法还包括提取质粒(即前述载体)、制备递送材料
‑
pdna颗粒的步
骤。
74.在本发明中“p基因名称”即代表表达该基因的载体，例如“pfgl1”即代表表达fgl1的载体。
75.在本发明中“递送材料
‑
p基因名称”即代表表达该基因的疫苗及构成其的递送材料，例如“plga/pei
‑
pfgl1”即代表表达fgl1的疫苗，其递送物质是plga和pei。
76.治疗方法
77.另一方面本发明提供了一种促进树突细胞成熟、增强cd8 t细胞的免疫反应、治疗肾癌、治疗肾癌转移的方法，所述方法包括提高患者体内fgl1和/或caix的表达；
78.优选地，所述方法包括对患者施用前述核酸分子、蛋白分子、载体、载体组合、疫苗、宿主细胞。
79.优选地，所述施用的方式包括肠外、外用或吸入的给药途径。
80.优选地，所述肠外给药途径包括经静脉、腹膜、鞘内、肌肉、皮下、皮内、局部、瘤旁淋巴结、肿瘤组织直接注射和淋巴结内注射。
81.优选地，所述外用给药途径包括经皮肤、口、眼、耳和鼻。
82.优选地，所述吸入可经鼻粘膜和肺。
83.优选地，所述施用要进行至少一次；具体地，1次、2次、3次、4次、5次或更多次。
附图说明
84.图1为plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix与plga/pei
‑
pcdna3.1纳米颗粒在hek
‑
293t细胞内的转染效率及统计柱状图；a和b：plga/pei
‑
pfgl1与plga/pei
‑
pcdna3.1对比的转染效率及统计柱状图；c和d：plga/pei
‑
pcaix与plga/pei
‑
pcdna3.1对比的转染效率及统计柱状图。
85.图2为western blot检测caix和fgli蛋白表达量的结果图和统计分析图：a和c：fgl1的蛋白表达量和统计分析图；b和d：caix的蛋白表达量和统计分析图。
86.图3为hcaix
‑
renca稳转株筛选后的检测结果图，a是细胞筛选后流式细胞术的检测结果，b是百分比统计结果。
87.图4为对模型小鼠进行处理的流程图。
88.图5是对模型小鼠进行处理后的检测结果图；图a和b：小鼠皮下瘤体积检测情况及统计学分析；图c：实验终止时各组小鼠皮下瘤的照片；图d：实验终止时各组小鼠皮下瘤的重量统计图；图e：实验终止时各组小鼠皮下瘤的肿瘤抑制率图f：il
‑
6的检测结果图。
89.图6是对各实验组小鼠的肝脏、肾脏和心脏进行he染色并观察其形态。
90.图7是对各免疫组小鼠的脾细胞进行流式细胞术分析的结果图；图a是流式细胞术检测各免疫组小鼠脾细胞中cd11c

和cd11b

cd11c

表达情况；图b是cd11c

，cd11b

cd11c

和cd11b
‑
cd11c

表达情况的统计；图c是流式细胞术检测各免疫组小鼠脾细胞中cd11c

cd80

、cd11c

cd86

或cd11c

mhc
‑
ii

表达情况。
91.图8为各免疫组小鼠脾细胞中cd11c

cd86

、cd11c

cd80

、cd11c

mhcii

表达情况的统计图，a：cd11c

cd86

，b：cd11c

cd80

，c：cd11c

mhcii

。
92.图9为edu法检测cd8 t细胞增殖情况的结果图和统计图。
93.图10为rtca实验检测各组小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤效果结果图和统计图。
94.图11为elispot法检测各组小鼠脾细胞中的t淋巴细胞分泌的ifn
‑
γ水平和统计图。
95.图12是流式细胞术检测表达ifn
‑
γ、il
‑
2或tnf
‑
α的cd8

t细胞的结果图。
96.图13是tnf
‑
α

cd8、il
‑2
cd8

和ifn
‑
γ

cd8

t细胞的比例并进行统计分析，a：tnf
‑
α

cd8

t，b：il
‑2
cd8

t，c：ifn
‑
γ

cd8

t，d：是统计分析。
97.图14是流式细胞术检测的检测结果图；图ab：各免疫组小鼠脾脏细胞中tnf
‑
α

il
‑2
cd8

，tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

，il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

和tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞的比例与数目，图cd是tils中tnf
‑
α

il
‑2
cd8

，tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

，il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

和
98.tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞的比例与数目；图e：cd8 t细胞消除实验中各组小鼠脾脏与tils中的cd8

t细胞比例；图f
‑
h：cd8t消除实验中，各组小鼠肿瘤重量及体积监测情况，及肿瘤抑制率统计结果图。
99.图15为各免疫组小鼠肺组织形态。
100.图16为各免疫组小鼠肺组织转移结节数量。
101.图17为he染色观察各免疫组小鼠的肺组织形态。
102.图18为he染色观察各免疫组小鼠的统计肺部转移肿瘤数量。
103.图19为免疫组化检测小鼠肺组织中cd8

t细胞浸润情况的结果图。
104.图20为流式细胞术检测各免疫组小鼠肺组织中cd8

t细胞占浸润免疫细胞的比例。
105.图21为肺转移模型中的t细胞的检测结构图；a：edu法检测肺转移模型中各免疫组小鼠脾脏中cd8t淋巴细胞的增殖情况；b：elispot法检测各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌ifn
‑
γ的水平；c：rtca实验检测各免疫组小鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
106.图22为流式细胞术检测各免疫组小鼠脾脏细胞中tnf
‑
α

cd8

t，il
‑2
cd8

t，ifn
‑
γ

cd8

t，tnf
‑
α

il
‑2
cd8

t，tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

t，il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t和tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞比例的统计图。
具体实施方式
107.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
108.实施例1、plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix纳米疫苗的制备、体外转染效率及体内表达
109.pfgl1和pcaix是将核酸序列通过常规的分子生物学技术构建到pcdna3.1上，经测序确认载体构建成功。
110.纳米颗粒通过w/o/w双乳液蒸发法制备而成，纳米颗粒的平均粒径和平均表面电位(zeta电位)通过粒度分析仪测定，结果显示：plga、plga/pei、plga/pei
‑
pfgli、plga/pei
‑
pcaix和plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米颗粒的平均粒径分别为164.0nm、191.5nm、230.2nm、233.7mm和262.0nm；平均表面电位分别为
‑
13.2mv， 7.89mv， 5.83mv， 5.87mv和 3.14mv。
111.为了研究在何种比例下plga/pei(质量plga：pei＝10：1)纳米颗粒可以将质粒(pdna：pfgl1或pcaix)完全包裹，我们制备了不同比例(pei：pfgl1或pcaix质量比例为1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32，pfgl1：pcaix＝1：1)的plga/pei
‑
pdna纳米颗粒样本，并进行琼脂糖凝胶电泳实验，结果显示：当plga/pei纳米颗粒中pei：pdna为1：4时，plga/pei纳米颗粒可完全包裹pdna。
112.实验数据表明，我们成功制备了plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix纳米疫苗。
113.为了检测plga/pei
‑
pfgli、plga/pei
‑
pcaix纳米疫苗能否转染至细胞内且有效表达抗原蛋白，我们将plga/pe
‑
pfgli和plga/pei
‑
pcaix纳米疫苗转染至hek
‑
293t细胞并用流式细胞术检测其转染效率，结果显示：plga/pei
‑
pfgli纳米颗粒的转染效率为86.9％，plga/pei
‑
pcaix纳米颗粒的转染效率为：91.2％，对照组plga/pei
‑
pcdna3.1纳米颗粒的转染效率均为0％(图1)，差别具有统计学意义(p<0.0001)。
114.为了检测plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix纳米疫苗能否在体内表达抗原蛋白，我们在小鼠的股四头肌接种疫苗，然后提取肌肉组胞蛋白进行wb检测，结果显示：fgli与caix蛋白均能在体内有效表达(图2)，差别具有统计学意义(p<0.0001)。
115.综上所述，这些数据证明plga/pei
‑
pfgli和plgapei
‑
pcaix纳米颗粒可在体内高效表达抗原蛋白。图中数据用均数
±
标准差表示；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***<0.001，****<0.0001。
116.实施例2、纳米疫苗在小鼠皮下瘤模型中的治疗效果
117.按照图4所示的流程图构建模型小鼠，具体步骤如下：
118.雌性、4～6周龄的balb/c小鼠，重量约20
‑
30g，购自维通利华实验动物有限公司(中国，北京市)，公司许可证号：scxk(京)2019
‑
0006。购买后于无特异病原体(specificpathogenfree，spf)级的屏障系统内饲养，饲养条件：恒温(22℃～25℃)、恒湿，co60辐照实验鼠维持小鼠饲料和灭菌水，供动物自由饮食，每4～5天更换一次垫料。
119.制备hcaix
‑
renca细胞悬液，放置以备接种使用(流式细胞仪检测纯度如图3所示)。购买的balb/c小鼠在spf屏障内适应性喂养1周，观察小鼠状态：饮食、生长正常，无明显不适后方可接种hcaix
‑
renca细胞。
120.当所有小鼠皮下瘤体积长至100mm3左右(接种hcaix
‑
renca细胞约7～10天)时，将小鼠随机分成4组，每组5只，各分组为：
121.①
空白对照组(plga/pei
‑
vector(mock)组)，注入不表达抗原的pcdna3.1疫苗作对照；
122.②
plga/pei
‑
pfgl1单疫苗治疗组，肌肉注射表达pfgl1抗原的疫苗作为单用治疗组；
123.③
plga/pei
‑
pcaix单疫苗治疗组，肌肉注射表达pcaix抗原的疫苗作为单用治疗组；
124.④
联合免疫组(plga/pei
‑
pfgl1/pcaix组)：肌肉注射皆能表达pfgl1和pcaix抗原的疫苗作为联合治疗组，接种的疫苗中均含有100μg质粒计算，联合组疫苗中含有pfgl1和pcaix各50μg。
125.分别于接种肿瘤细胞第10、20、30天对小鼠进行上述疫苗的注射。接种肿瘤细胞第7天开始对小鼠肿瘤体积的进行监测，每隔2
‑
3天测量1次，测量方法：游标卡尺测肿瘤最长
径与最短径，每只小鼠肿瘤测量3次并取其平均值。肿瘤体积以此公式计算：体积(mm3)＝长径(mm)
×
短径(mm)
×
短径(mm)/2。至接种肿瘤细胞第42天，终止实验，手术切除小鼠皮下肿瘤，测量重量并计算各组小鼠的肿瘤抑制率，计算公式：肿瘤抑制率＝(1
‑
治疗组瘤重量/对照组瘤重量)
×
100％。
126.小鼠接种肿瘤细胞第42天，颈椎脱臼法处死鼠，超净台内解剖取小鼠脾脏、肿瘤组织、心脏、肝脏及肾脏等用于后续试验。
127.实验结果：
128.图5c是每组小鼠的代表性肿瘤图片。肿瘤体积监测的结果显示：plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠的肿瘤体积明显小于plga/pei
‑
pcaix单一免疫组小鼠(图5a
‑
3b)，差别具有计学意义(p<0.001)。
129.小鼠肿瘤重量和肿瘤抑制率的结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组小鼠相比plga/pei
‑
pfgli/pcaix联合免疫组小鼠的肿瘤重量显著降低、肿瘤抑制率明显增加(图5d
‑
e)，差别具有统计学意义(p<0.01)。
130.为了研究plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗的毒副作用，对各组小鼠的心脏、肝脏、肾脏进行he染色，结果显示：各免疫组小鼠的肝脏和心脏内细胞形态完整，无明显的细胞核缩小聚集，各组小鼠肾脏内肾小球体积及细胞数目无明显改变，毛细血管腔及球囊腔可见，肾小球系膜基质完整(图6)。
131.综上所述，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗可以有效地防止肾癌的恶化，且无明显的毒副作用。
132.实施例3、纳米疫苗对树突状细胞成熟的影响
133.为了研究纳米疫苗对体内dc成熟的影响，我们收集了皮下瘤模型中各免疫组小鼠的脾脏细胞并进行相关检测。
134.流式细胞术检测结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgli/pcaix免疫组小鼠牌脏细胞中的cd11c 树突状细胞的比例显著增加，cd11b

cd11c

树突状细胞比例显著增加(图7a
‑
b)；cd11c

cd8

、cd11c

cd86

以及cd11c

mhcii

的细胞比例显著增加(图7c
‑
8)，差别具有统计学意义(p<0.01)。这些结果表明，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗可以促进体内cd11c

树突状细胞的增加并促进其成熟。
135.实施例4、纳米疫苗对t淋巴细胞增殖及ctl效应的影响
136.大多数肿瘤疫苗都可以增强cd8 t细胞的免疫反应。为了评估plga/pei
‑
pfgl1、plga/pei
‑
pcaix、plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗能否增强特异性cd8 t细胞免疫反应，我们对不同免疫组小鼠脾脏细胞的淋巴细胞增殖效果、ctl活性和功能性cd8 t细胞的比例进行了相关实验。
137.edu结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组小鼠相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组的cd8t细胞增殖显著增强(图9)，差别具有统计学意义(p<0.0001)。
138.rtca实验结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组的杀伤曲线下降更快，96h左右基本杀完肿瘤细胞(细胞指数更低)(图10)，差别具有统计学意义(p<0.0001)。
139.elispot实验结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组比较，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠脾细胞中的t淋巴细胞分泌ifn
‑
γ的水平显著升高(图11)，差别具有
统计学意义(p<0.001)。
140.小鼠脾脏细胞的流式结果显示：plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组的tnf
‑
α

cd8、il
‑2
cd8

和ifn
‑
γ

cd8

t细胞比例明显高于plga/pei
‑
pcaix单一免疫组(图12
‑
13)。
141.综上所述，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix纳米疫苗可以促进体内t淋巴细胞增殖和ctl效应并提高体内的cd8

t细胞数量。
142.实施例5、皮下瘤模型中plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗的抗肿瘤效应与多功能cd8 t细胞介导的免疫反应之间的关系
143.多功能cd8t细胞可以分泌多种细胞因子如tnf
‑
α、il
‑
2和ifn
‑
γ，因此它们被认为是免疫系统保护性免疫的关键效应细胞。
144.为了进一步评估肿瘤疫苗的免疫效果，对各免疫组小鼠的脾脏淋巴细胞和tils(肿瘤浸润性淋巴细胞)进行了特异性多功能cd8

t细胞反应的检测。流式结果显示：与plga/pei
‑
caix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠脾脏淋巴红细胞和tils中的tnf
‑
α

il
‑2
cd8

、tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

、il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

和tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞的比例显著增加(图14a
‑
d)，差别具有统计学意义(p<0.05)。
145.为了确定plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗诱导的抗肿瘤活性是否依赖于多功能cd8

t细胞免疫反应，我们使用cd8

t细胞单克隆抗体对小鼠进行了体内cd8

t细胞的消除。
146.实验结果显示：与未消除组小鼠相比较，消除组小鼠的肿瘤体积和重量显著升高，肿瘤抑制率显著下降，脾脏细胞和tils中cd8t细胞的比例显著下降(图14e
‑
h)，差别具有统计学意义(p<0.001)。
147.图上plga/pei
‑
pfgli/pcaix

ctrlab组(对照组)：组内每只小鼠在接种plga/pei
‑
pfgli/pcaix纳米疫苗的前1天注射200μl对照抗体(ctrl ab)；plga/pei
‑
pfgli/pcaix

anti
‑
cd8ab组：组内每只小鼠在接种plga/pei
‑
pfgli/pcaix纳米疫苗的前1天注射200μl anti
‑
cd8ab。
148.这些结果表明，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗有效地增强了小鼠体内的特异性多功能cd8

t细胞免疫反应，且plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗诱导的抗肿瘤反应依赖于体内的cd8

t细胞介导的免疫反应。
149.实施例6、plgapei
‑
pfgl1/pcaix疫苗在小鼠肺转移模型中的治疗效果
150.建立小鼠肾癌细胞肺转移模型，方法如下：
151.实验动物及小鼠肾癌hcaix
‑
renca细胞与上述实验相同。在接种肿瘤细胞前的10天(第
‑
10天)，对小鼠进行随机分组，每组5只小鼠：
152.①
空白对照组(plga/pei
‑
vector(mock)；
153.②
plga/pei
‑
pfgl1单疫苗治疗组；
154.③
plga/pei
‑
pcaix单疫苗治疗组；
155.④
联合免疫组(plga/pei
‑
pfgl1/pcaix组)。
156.在第
‑
10、0、10、20天，对各组实验小鼠提前注射相应纳米疫苗给予初次免疫(各组注射的疫苗同皮下瘤模型分组)。初次免疫10天后(第0天)，所有balb/c鼠经尾静脉注射1
×
106个hcaix
‑
renca细胞，具体步骤：1)固定小鼠，用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其尾部静脉扩张；2)找到小鼠尾静脉后，用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定；3)左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，在距尾尖1/4或1/3处进针(此处皮肤较薄，血管清晰，进针容易)，并
通过看有无回血来测试针是否在静脉内，有回血则可进行注射hcaix
‑
renca细胞；4)注射结束，用医用棉球止血。
157.于接种肿瘤细胞后第28天颈椎脱臼处死小鼠。并进行如下实验：1)解剖小鼠取出肺脏，拍照、计数肿瘤病灶数、he染色和免疫组化检查；2)解剖出脾脏组织，制备单细胞悬液，按常规方法进行免疫细胞群体检测、特异性多功能性cd8

t细胞检测、brdu增殖实验、rtca杀伤实验和elispot检测。
158.实验结果：
159.在接种肿瘤细胞的第28天处死全部小鼠，取出肺组织，并计算肺转移灶。结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠的肺组织上的转移灶数量明显减少(图15
‑
16)，差别具有统计学意义(p<0.01)。
160.免疫组化实验检测各免疫组小鼠的肺组织中cd8

t细胞浸润情况，结果显示：与其他免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠的肺组织切片中棕黄色颗料cd8

t细胞明显增多；流式细胞术检测肺组织，结果显示：plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠的肺组织中的cd8 t细胞比例明显高于plga/pei
‑
pcaix单一免疫组(图19
‑
20)，差别具有统计学意义(p<0.01)对各组小鼠肺组织进行he染色，在显微镜下观察并统计肺组织中肿瘤数量，结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠的肺部转移肿瘤的数量显著降低(图17
‑
18)，差别具有统计学意义(p<0.001)。这些结果表明，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗可增强cd8

t细胞介导的免疫反应，且可以治疗肺转移肾癌。
161.实施例7、plga/pei
‑
pfgl1/pcaix疫苗在肺转移模型中的抗肿瘤效应与多功能cd8 t细胞介导的免疫反应之间的关系
162.edu法检测各免疫组小鼠脾细胞中t淋巴细胞的增殖情况，结果显示：与plga/pei
‑
pcaix单一免疫组相比，plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组中t淋巴细胞的增殖显著增加(edu

cd8

t细胞比例显著升高)(图21a)，差别具有统计学意义(p<0.01)。
163.为了评估plga/pei
‑
pfgl1pcaix疫苗的治疗效应与多功能cd8

t细胞介导的免疫反应之间的关系，用caix蛋白对各免疫组的脾细胞刺激后，过行流式细胞术检测，结果显示：plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠脾脏中tnf
‑
α

cd8

、il
‑2
cd8

、ifn
‑
γ

cd8

、tnf
‑
α

il
‑2
cd8

、tnf
‑
α

ifn
‑
γ

cd8

、il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

和tnf
‑
α

il
‑2
ifn
‑
γ

cd8

t细胞的比例明显高于plga/pei
‑
pcaix单一免疫组小鼠(图22)，差别具有统计学意义(p<0.01)。
164.elispot实验结果显示：plga/pei
‑
pfgli/pcaix联合免疫小鼠脾脏中淋巴细胞分泌ifn
‑
γ的水平明显高于plgapei
‑
pcaix单一免疫组(图22b)，差别具有统计学意义(p<0.01)。
165.rtca结果显示：plga/pei
‑
pfgl1/pcaix联合免疫组小鼠脾脏细胞的细胞指数明显低于plga/pei
‑
pcaix单一免疫组差别具有统计学意义(p<0.01)(图22c)。
166.这些结果表明，plga/pei
‑
pfgli/pcaix疫苗可以增强肾癌肺转移模型中肿瘤特异性多功能cd8 t细胞介导的免疫反应。