一种具备二次交联特性的水凝胶材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及高分子水凝胶的制备技术领域，具体是一种具备二次交联特性的水凝胶材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.外伤或手术造成的皮肤切口在手术缝合后容易出现增生或凹陷型瘢痕，影响美观。使用组织胶水替代手术缝线可以减少皮肤的瘢痕产生。目前已经有一些免缝组织胶水产品用于外科及美容术伤口缝合时辅助粘合护理。如蓝灵组织胶水(histoacryl tissue adhesive)、3m组织胶水(vetbond)，这些组织胶水主要由由2
‑
氰基丙烯酸正丁酯(恩布酯)、和稳定剂(对苯二酚、二氧化硫、磷酸)组成。此类组织胶水存在一定的缺点：
①
需要医生手工涂在切口表面，手工难以实现均匀的涂敷；
②
需要几分钟等待使胶水从溶液变成固体；
③
胶水的基质材料生物相容性欠佳。因此，如何制备一种能够被预先交联成型、又能再次与皮肤紧密黏附的水凝胶材料是临床急需解决的问题。
3.在组织工程研究中，由于组织工程微组织能够实现种子细胞的均匀负载，微组织的构建成为热门的新兴领域，但是目前的研究中多把微组织直接置于组织缺损部位，尚未实现对微组织的有序拼装。因此，如果能首先使用水凝胶制备成微组织、再利用水凝胶的二次交联特性使不同种类微组织有序排列，有望解决微组织的拼装难题，为组织工程研究提供新的思路。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明提供一种具备二次交联特性的水凝胶材料及其制备方法和应用，制备得到的水凝胶材料可以二次交联，实现水凝胶与组织之间的黏附或不同形状水凝胶之间的拼接。
5.本发明提供的技术方案：一种具备二次交联特性的水凝胶材料，所述水凝胶材料是在明胶、海藻酸盐、透明质酸中任一生物大分子上，同时接枝邻苯二酚基团和光敏基团，得到邻苯二酚基光敏大分子，溶解后进行光交联得到。
6.一种具备二次交联特性的水凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)将明胶溶解于pbs溶液中，加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基丁二酰亚胺，溶液ph调至4.5
‑
5.5后进行活化；
8.(2)盐酸多巴胺溶解于pbs溶液中，将盐酸多巴胺溶液逐滴加入步骤(1)所得的明胶溶液中，将混合溶液置于恒温摇床中，避光振荡后透析、冷冻干燥后得到邻苯二酚基明胶；
9.(3)将步骤(2)制备的邻苯二酚基明胶溶解在mes缓冲溶液中，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和n
‑
羟基丁二酰亚胺，溶液ph调至4.5
‑
5.5后进行活化；
10.(4)将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐溶解于在mes溶液中，2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯
盐酸盐溶液逐滴加入步骤(3)所得的邻苯二酚基明胶溶液中，将混合溶液置于恒温摇床中，避光振荡后透析、冷冻干燥后得到邻苯二酚基光敏明胶；
11.(5)将步骤(4)所得的邻苯二酚基光敏明胶配成质量分数为5
‑
20％的水溶液，加入光引发剂，然后溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，使用紫外光照射，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
12.进一步的，所述步骤(1)中明胶溶解于pbs溶液中的质量分数分别为0.5％
‑
2％，步骤(2)中得到的邻苯二酚基明胶溶解在mes缓冲溶液中的质量分数分别为0.5％
‑
2％，步骤(2)中盐酸多巴胺与明胶的质量比为0.2
‑
1：1。
13.进一步的，所述步骤(1)中采用的原料明胶可替换成海藻酸盐或透明质酸，海藻酸盐或透明质酸溶解于pbs溶液中的质量分数分别为0.05％
‑
0.5％和0.01％
‑
0.3％，步骤(2)中得到的邻苯二酚基海藻酸盐或邻苯二酚基透明质酸溶解在mes缓冲溶液中的质量分数分别为0.05％
‑
0.5％和0.01％
‑
0.3％。
14.进一步的，所述步骤(1)和步骤(3)中加入的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐与n
‑
羟基丁二酰亚胺的质量比为5：3
‑
1：1之间，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐在溶液中的质量浓度为0.1％
‑
1％，所述步骤(1)和步骤(3)的活化时间为5
‑
60min。
15.进一步的，所述步骤(2)中盐酸多巴胺在pbs溶液中配成5％
‑
10％质量浓度，避光振荡的温度为20
‑
40℃，振荡时间为5
‑
24小时，透析袋的孔隙在3000da
‑
1000000da间，透析时间24
‑
48h。
16.进一步的，所述步骤(4)中2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐溶解于在mes溶液的配成5
‑
10％的质量浓度，2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐与邻苯二酚基明胶的质量比为0.2
‑
1：1，避光振荡的温度为20
‑
40℃，振荡时间为5
‑
24小时，透析袋的孔隙在3000da
‑
1000000da间，透析时间24
‑
48h。
17.进一步的，所述步骤(5)中采用365nm紫外光照射，光照时间在5
‑
30秒之间，所述光引发剂为lap或i2959，添加的质量浓度在0.1
‑
1％之间。
18.所述制备方法得到的具备二次交联特性的水凝胶材料的二次交联使用方法，配置0.1
‑
1mm/l氯化铁溶液或0.1
‑
1mm/l高碘酸钠溶液，在皮肤上薄涂一层溶液，随后将水凝胶材料贴在皮肤表面，即可实现紧密黏附；或在将两个水凝胶贴在一起，向其表面滴加氯化铁溶液或者高碘酸钠溶液，即可实现紧密黏附。
19.一种具备二次交联特性的水凝胶材料的应用，利用光固化3d打印技术，使用水凝胶材料制备毫米级水凝胶微单元；利用水凝胶的二次交联特点，达到多个水凝胶微单元之间的拼接以及水凝胶与组织之间的紧密黏附，实现对缺损部位的精准修复；或利用光固化3d打印技术，将水凝胶材料预先制备成特定形状的皮肤创面敷料，利用水凝胶的二次交联特点使其与皮肤之间形成紧密黏附，达到覆盖创面促进皮肤修复的效果。
20.本发明制备得到的水凝胶材料具备二次交联特性，这种材料在配成溶液后，能够首先利用水凝胶分子中的光敏基团实现光固化交联制备出特定形状，还可利用水凝胶分子中的邻苯二酚基团再次交联、实现水凝胶与组织之间的黏附或不同形状水凝胶之间的拼接。这一类可二次交联的水凝胶在制备伤口敷料、导电生物传感器、组织工程支架等多个领域具备极大的应用价值。
附图说明
21.图1是本发明的制备方法的流程图；
22.图2是本发明的化学合成步骤及对应产物的实物图；
23.图3是本发明中的水凝胶材料的核磁共振氢谱结果图；
24.图4是本发明中的水凝胶材料的傅里叶红外光谱结果图；
25.图5是本发明中的水凝胶材料通过3d打印机打印的组织工程室模型图；
26.图6是本发明中的水凝胶材料二次交联后的效果图；
27.图7是本发明的水凝胶材料对组织黏附的效果图；
28.图8是本发明中使用不同分子量的透析袋制备得到的水凝胶材料的电镜图；
29.图9是本发明中使用不同分子量的透析袋制备得到的水凝胶材料的体外降解速率图；
30.图10是水凝胶材料的生理盐水中溶胀检测结果图；
31.图11是水凝胶材料的硬度检测结果图；
32.图12是水凝胶材料的弹性检测结果图；
33.图13是水凝胶材料混合骨髓间充质干细胞(bmsc)后光交联的细胞光镜图；
34.图14是水凝胶材料混合人脐静脉内皮细胞(huvec)后光交联的细胞光镜图；
35.图15是水凝胶材料混合huvec后光交联，培养1天、5天后观察细胞存活情况图；
36.图16是本发明的水凝胶材料的应用流程图；
具体实施方式
37.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
38.实施例1
39.取明胶溶解在pbs溶液中配成质量分数2％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为0.5％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取盐酸多巴胺在pbs溶液中配成质量分数为10％的溶液，将盐酸多巴胺溶液一滴滴加入明胶溶液，混合溶液中明胶与盐酸多巴胺质量比为2：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3500da)对溶液透析36小时，换液6次。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基明胶。
40.取制备的邻苯二酚基明胶溶解在mes缓冲溶液中配成质量分数1％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为1％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(aema)在mes溶液中配成质量分数为5％的溶液，将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐一滴滴加入邻苯二酚基明胶溶液，2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐与邻苯二酚基明胶的质量比为0.5：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3500da)对溶液透析36小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到混合分子量邻苯二酚基光敏明胶。
41.将15％质量浓度的邻苯二酚基光敏明胶溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，加入质量浓度0.5％的光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，使用365nm紫外
光照射，光照时间在20秒，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
42.实施例2
43.取明胶溶解在pbs溶液中配成质量分数2％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为0.5％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取盐酸多巴胺在pbs溶液中配成质量分数为10％的溶液。将盐酸多巴胺溶液一滴滴加入明胶溶液，混合溶液中明胶与盐酸多巴胺质量比为2：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在1000000da)对溶液透析36小时，换液6次。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基明胶。
44.取制备的邻苯二酚基明胶溶解在mes缓冲溶液中配成质量分数1％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为1％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(aema)在mes溶液中配成质量分数为5％的溶液，将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐一滴滴加入邻苯二酚基明胶溶液，2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐与邻苯二酚基明胶的质量比为0.5：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在1000000da)对溶液透析36小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到大分子量邻苯二酚基光敏明胶。
45.将15％质量浓度的邻苯二酚基光敏明胶溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，加入浓度0.5％的光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，使用365nm紫外光照射，光照时间在20秒，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
46.实施例1和2中制备了不同分子量的邻苯二酚基光敏明胶，即实验检测结果中的3500da和1000kda gdma
47.实施例3
48.取明胶溶解在pbs溶液中配成质量分数2％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为0.5％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取盐酸多巴胺在pbs溶液中配成质量分数为10％的溶液，将盐酸多巴胺溶液一滴滴加入明胶溶液，混合溶液中明胶与盐酸多巴胺质量比为3：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3500da)对溶液透析36小时，换液6次。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基明胶。
49.取制备的邻苯二酚基明胶溶解在mes缓冲溶液中配成质量分数1％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为5/3，edc在溶液中的质量浓度为1％，将溶液ph调至5，活化30分钟。取2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(aema)在mes溶液中配成质量分数为5％的溶液，将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐一滴滴加入邻苯二酚基明胶溶液，2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐与邻苯二酚基明胶的质量比为0.3：1。将混合溶液置于恒温摇床中，25℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3500da)对溶液透析36小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到大
分子量邻苯二酚基光敏明胶。将15％质量浓度的邻苯二酚基光敏明胶溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，加入浓度0.5％的光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，使用365nm紫外光照射，光照时间在20秒，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
50.实施例3相比于实施例1降低了盐酸多巴胺和2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的浓度，反应产物的接枝率降低。
51.实施例4
52.取海藻酸钠盐溶解在pbs溶液中配成质量分数0.2％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为3/2，edc在溶液中的浓度为0.2％，将溶液ph调至5，活化10分钟。取盐酸多巴胺在pbs溶液中配成8％浓度，将盐酸多巴胺溶液一滴滴加入海藻酸盐溶液。将混合溶液置于恒温摇床中，35℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3000da)对溶液透析48小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基海藻酸钠。
53.取制备的邻苯二酚基海藻酸钠溶解在mes缓冲溶液中配成质量分数为0.2％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为3/2，edc在溶液中的浓度为1％，将溶液ph调至5，活化50分钟。取2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(aema)在mes溶液中配成质量分数为5％的溶液，将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐溶液一滴滴加入邻苯二酚基海藻酸盐溶液。将混合溶液置于恒温摇床中，35℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3000da)对溶液透析48小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基光敏海藻酸盐。
54.将3％浓度的邻苯二酚基海藻酸钠溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，加入浓度0.5％的光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，使用365nm紫外光照射，光照时间在30秒，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
55.实施例5
56.取透明质酸溶解在pbs溶液中配成质量分数0.1％的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为1/1，edc在溶液中的浓度为0.2％，将溶液ph调至4.5，活化40分钟。取盐酸多巴胺在pbs溶液中配成10％浓度，将盐酸多巴胺溶液一滴滴加入透明质酸溶液。将混合溶液置于恒温摇床中，20℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙在3000da间)对溶液透析24小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基透明质酸。
57.取制备的邻苯二酚基透明质酸溶解在100mm/l mes缓冲溶液中配成0.1％浓度的溶液，充分溶解后向溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)，其中edc/nhs的质量为1/1，edc在溶液中的浓度为0.2％，将溶液ph调至4.5，活化40分钟。取2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(aema)在mes溶液中配成质量分数为10％的溶液，将2
‑
氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐溶液一滴滴加入邻苯二酚基透明质酸溶液。将混合溶液置于恒温摇床中，20℃避光振荡过夜。使用透析袋(孔隙10000da)对溶液透析24小时，每6小时换液。冷冻干燥后制备得到邻苯二酚基光敏透明质酸。
58.将2％浓度的邻苯二酚基光敏透明质酸溶液滴加到不同形状的水凝胶模具中，加
入浓度0.5％的光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)，使用365nm紫外光照射，光照时间20秒，使溶液固化获得片状水凝胶敷料；或者使用立体光投影3d打印机，制备不同形状的水凝胶敷料或支架。
59.gd
‑
ma水凝胶材料检测
60.取原料及产物溶于重水中，在核磁共振波谱仪扫描氢谱(仪器型号：bruker 600mhz)，得到不同材料的吸收峰，gd
‑
ma的吸收峰与多巴胺和明胶都有重叠，表明gd是这两种原料合成得到的，即在明胶的侧链上接枝了邻苯二酚基团；特征峰显示该水凝胶制备成功；gd
‑
ma核磁共振氢谱结果如图3所示。
61.取原料及产物在溴化钾中研磨压片后进行傅里叶红外光谱检测(仪器型号：thermo scientific nicolet 6700)，特征峰显示明胶侧链上的邻苯二酚基团和甲基丙烯酸酯键由酰胺键反应接枝。gd
‑
ma傅里叶红外光谱结果如图4所示，1640cm
‑
1的峰说明了酰胺键(hnco)的形成。3500
‑
3100n
‑
h伸缩振动1680
‑
1630c＝o伸缩振动1655
‑
1590n
‑
h弯曲振动3100
‑
3000烯类的c
‑
h伸缩振动引起1640也可能是碳碳双键的伸缩振动甲基的变形震动使1300nm的吸收峰发生了变化。
62.gd
‑
ma具备优异的光敏特性，能够使用立体光投影3d打印机制备出各种不同形状的组织工程室模型如图5所示(仪器：engineering for life光固化生物3d打印机bp8600)，gd
‑
ma具备较好的打印性能，可以打印出精密的结构。
63.如图6所示，gd
‑
ma在光固化后向水凝胶上滴加高碘酸钠溶液，该gd
‑
ma水凝胶变为橙黄色，接触面紧密黏附；向水凝胶滴加氧化铁溶液后该gd
‑
ma水凝胶变为蓝色，接触面紧密黏附。表明该gd
‑
ma水凝胶在光交联后还可以通过其侧链上的邻苯二酚基团实现二次交联。
64.如图7所示，gd
‑
ma水凝胶对组织的黏附，通过二次交联可紧密黏附组织上，扭曲折叠展示水凝胶和组织的紧密的黏附，水凝胶片堆叠，展示水凝胶之间的紧密黏附拼装，浸泡在pbs中30分钟，扭曲折叠展示水凝胶的紧密拼装。
65.如图8所示，使用不同分子量的透析袋制备了两种分子量的gd
‑
ma材料，配成不同浓度的水凝胶后进行电镜观察，发现使用1000kda透析制得的大分子量gd
‑
ma水凝胶孔隙更大，更均匀，可能更有利于细胞生长
66.如图9所示，在37℃pbs浸泡看体外降解，记录了3w的数据，从数据判断，大分子量的gd
‑
ma体外降解速率更快，可能与高孔隙率相关。(第4周时因水凝胶降解，无法称重)
67.如图10所示，gd
‑
ma水凝胶的生理盐水中溶胀检测，该水凝胶溶胀不明显，形状维持较好。
68.如图11和图12所示，gd
‑
ma浓度增加，水凝胶的硬度也增加，12％gd
‑
ma材料具有较好的弹性。
69.如图13
‑
15所示，gd
‑
ma的具有很好的生物相容性。
70.本发明制备的水凝胶具备可打印性和生物黏附效应；如图16所示，随后利用dlp光固化3d打印技术，使用上述材料制备毫米级水凝胶组织工程室；再将经生物反应器培养好的组织工程微组织进行一级组装填充，使其成为微单元；最后利用水凝胶的生物黏附性对多个组织工程室微单元进行二级组装拼接，可以实现对缺损部位的精准修复
71.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何
属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。